[M+H]发_= 4345. 69,1个闭合的二硫化物桥，2个用NEM烷基化的二硫化 物；
[0138]d)峰4 [M+H]发_= 4345. 66,1个闭合的二硫化物桥，2个用NEM烷基化的二硫化 物；
[0139]e)峰5[M+H]发现的=4598. 6〇,3个用NEM烷基化的二硫键。
[0140] 将标记为峰1、2和3的中间体用TCEP处理lh，然后与IAM反应。产生的物质通 过RP-HPLC纯化，然后用修饰的胰蛋白酶处理3h。接下来将该物质通过MALDI-T0F分析。 基于全部数据，测定合成的C.geol[desGSH](SEQID010)中的连接性是：Cys3-Cysl8、 Cysl〇-Cys22和Cysl7-Cys29,其落入预测的VI/VII半胱氨酸框架中。它也是另外的证实： Cys24不涉及二硫键形成，但是还涉及合成的C.geol的功能活性。
[0141] 实施例7
[0142] C.geo2 的发现
[0143] 除了分离自地纹芋螺的生物学上有活性的C.geol肽，第二活性肽已从亚部分 34. 5 (C.ge〇2)鉴定。分离的肽的QPatch测定产生69%的hNaVl. 7阻断。将分离的天然肽 通过用二硫苏糖醇和4-乙烯吡啶处理而还原和烷基化，准备用于在犹他州大学通过埃德 曼降解测序。测序成果显示XXCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCS. ..(SEQID032)的部 分肽序列，其中X表示氨基酸序列中的错读。利用部分序列，通过搜索如前所描述的地纹芋 螺转录组数据来检索完全肽序列。C.ge〇2的完全序列显示标准的Co-芋螺肽半胱氨酸框架 和与C.geol共享相当量的序列同一,性（~55%同源）；然而，C.geo2缺少C.geol中观察 到的另外的半胱氨酸（Cys-24)(参见下面的比对）。
[0144]C.geol(SEQID003)GWCGD0GATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA~
[0145]C.geo2(SEQID024)DffCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCTG'
[0146] *注释：粗体表示序列之间的同源性T表示羧化的C端
[0147] 特别感兴趣的是，芋螺肽家族的成员通常具有终止密码子之后的C端 [Ser-Ser-Ala]三肽。然而，C.geol(SEQID003)已将三肽并入成熟序列，从而增加该肽家 族的C端多样性。
[0148] 实施例8
[0149]C.geo3 的发现
[0150] 3094. 35Da的质量在地纹芋螺的活性SubFr33. 6 (40%的hNavl. 7阻断）中被鉴 定。肽序列在地纹芋螺的转录组数据中被鉴定（SEQID025)，其特征为相同的质量。然后 将其在存在还原和氧化的谷胱甘肽的情况下合成和折叠。相同的期望质量的三个峰被收 集，并针对hNavl. 7和rNavl. 7进行测试。在两种情况中，肽都不是有活性的。
[0151] 要理解，本申请的上述组合物和方式只是说明本发明的优选实施方式。为数众多 的修改和可选的排列可以由本领域技术人员想到，而不背离本发明的精神和范围，并且所 附的权利要求意欲涵盖这样的修改和排列。因此，虽然本发明已结合目前认为是本发明最 实用的和优选的实施方式在上面被具体和详细地描述，但是对本领域普通技术人员将明显 的是可以做出为数众多的修改，包括，但不限于，大小、材料、形状、形式、功能和操作方式、 装配和应用的变化，而不背离本文阐述的原理和构思。
【主权项】
1?分离的肽，其具有序列 GWCGDOGATC GKLRLYCCSG FCX23C24X25TKTC-X3Q~(SEQ ID001)， 其中〇是羟脯氨酸，X23是天冬氨酸、天冬酰胺或羧基谷氨酸，C24是半胱氨酸或取代的半胱 氨酸，乂 25是酪氨酸或天冬氨酸，X 3。是0至6个氨基酸的肽，并且'是羧化的C端。2. 权利要求1所述的分离的肽，其中X是KDKSSA(SEQ ID002)。3. 权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽是合成的肽。4. 权利要求1所述的分离的肽，进一步包括标记。5. 权利要求1所述的分离的肽，其中所述标记是荧光标记。6. 权利要求1所述的分离的肽，其被修饰以含有0-聚糖、S-聚糖或N-聚糖。7. 权利要求1所述的分离的肽，其中C24是无巯基的取代的半胱氨酸.8. 权利要求1所述的分离的肽，其中C24与SEQ ID001的第二肽形成二聚体。9. 权利要求1所述的分离的肽，其中C24由可选的氨基酸残基置换。10. 权利要求1所述的分离的肽，其中C24通过二硫键用分子可逆地修饰。11. 权利要求10所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：谷胱甘肽、半胱 氨酸、半胱胺、DTNB、硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽以及C 24与链烷硫代磺酸盐试剂或硫代硫 酸盐试剂反应的任何产物，和其组合。12. 权利要求1所述的分离的肽，其中C24用分子不可逆地修饰。13. 权利要求12所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：乙酰胺基甲基、 C24与马来酰亚胺、乙烯基砜和相关的a，0 -不饱和体系的反应产物、0 -卤乙胺、a -卤羰 基，或其组合。14. 权利要求1所述的分离的肽，其中X 23是天冬氨酸，C 24是未取代的半胱氨酸，和X 25 是酪氨酸。15. 权利要求14所述的分离的肽，其中X 3。是SEQ ID002。16. 权利要求1所述的分离的肽，其中X23是天冬氨酸，C24用胱胺取代，和X25是酪氨酸。17. 权利要求16所述的分离的肽，其中X 3。是SEQ ID002。18. 分离的肽，其具有7个半胱氨酸残基和X J2C X4X5X6X7X8X 9C X11X12X13X14X 15X16CCX19X20X21C X23C24X25X26X27X 28CT (SEQ ID033)的序列，其中 X1 2、X4 9、X11 16、 X19 21、&3和X 25 28每个独立地是任何氨基酸，c 24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，和'是羧化 的C端。19. 权利要求18所述的分离的肽，其中所述肽进一步包括荧光标记。20. 权利要求18所述的分离的肽，其中所述肽是合成的肽。21. 权利要求18所述的分离的肽，其中C24是无巯基的取代的半胱氨酸。22. 权利要求18所述的分离的肽，其中C 24与SEQ ID033的第二肽形成二聚体。23. 权利要求18所述的分离的肽，其中C24由可选的氨基酸残基置换。24. 权利要求18所述的分离的肽，其中C24通过二硫键用分子可逆地修饰。25. 权利要求24所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：谷胱甘肽、半胱 氨酸、半胱胺、DTNB、硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽和C 24与链烷硫代磺酸盐试剂或硫代硫酸 盐试剂反应的任何产物，和其组合。26. 权利要求18所述的分离的肽，其中C24用分子不可逆地修饰。27. 权利要求26所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：乙酰胺基甲基、 C24与马来酰亚胺、乙烯基砜和相关的a，-不饱和体系的反应产物、-卤乙胺、a -卤羰 基，或其组合。28. 权利要求18所述的分离的肽，其中X27可以是赖氨酸或甘氨酸。29. 权利要求18所述的分离的肽，其中X6可以是羟脯氨酸或丙氨酸。30. 权利要求18所述的分离的肽，其中X 23可以是天冬氨酸、y -羧基谷氨酸或天冬酰 胺。31. 权利要求18所述的分离的肽，其中X25可以是酪氨酸或天冬氨酸。32. 药物组合物，其包括： 药学上可接受的载体中的与SEQ ID001具有至少90%序列同一性的肽，包括其药学上 可接受的盐或溶剂合物。33. 权利要求32所述的药物组合物，其中所述肽具有SEQ ID001的序列。34. 权利要求32所述的药物组合物，其中X 23是天冬氨酸，C 24是未取代的半胱氨酸，和 X25是酪氨酸。35. 权利要求34所述的药物组合物，其中X 3。是SEQ ID002。36. 权利要求32所述的药物组合物，其中X 23是天冬氨酸，C 24用胱胺取代，和X 25是酪 氨酸。37. 权利要求36所述的药物组合物，其中X 3。是SEQ ID002。38. 治疗钠通道显出活性增加的对象的状况或治疗所述状况的效应的方法，包括向所 述对象施用治疗有效量的根据权利要求32所述的组合物来调节所述钠通道的活性。39. 权利要求38所述的方法，其中所述状况或所述状况的效应包括选自下列的成员： 急性痛、慢性痛、神经性疼痛、癌症痛、糖尿病神经病变、炎性痛、三叉神经痛、围术期疼痛、 内脏痛、包括手术后疼痛的伤害性疼痛和涉及内脏、胃肠道、颅结构、肌肉骨骼系统、脊柱、 泌尿生殖系统、心血管系统和CNS的混合疼痛类型，包括癌症痛、背和口面疼痛或其组合。40. 权利要求38所述的方法，其中所述状况是神经学疾病，包括脊髓损伤、外伤性脑损 伤、周围神经损伤。 41?肽，其具有序列 DWCGDAGDAC GTLKLRCCSG LCNQYSGTCTG~(SEQ ID024)，其中 ~ 是羧 化的C端。 42?肽，其具有序列 CVGRDSKCGP PPCCMGMTCN YERVRKCT (SEQ ID025)，其中 ~ 是羧化的 C端。 43?肽，其具有选自下列的序列：GWCGDOGATC GKLRLYCCSG FCDCYTKTCKDKSSA~ (SEQ ID001)、序列 DWCGDAGDAC GTLKLRCCSG LCNQYSGTCTG~(SEQ ID024)、CVGRDSKCGP PPCCMGMTCN YERVRKCT~(SEQ ID025)以及 SEQ ID00USEQ ID024 和 SEQ ID025 的衍生物，其中一个或更 多的羟脯氨酸残基可以用脯氨酸取代；一个或更多的精氨酸残基可以用赖氨酸、鸟氨酸、高 精氨酸、去甲Lys、N-甲基-赖氨酸、N, N-二甲基-赖氨酸、N, N, N-三甲基-赖氨酸或任 何合成的碱性氨基酸取代；一个或更多的赖氨酸残基可以由精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸、去 甲赖氨酸或任何合成的碱性氨基酸取代；一个或更多的酪氨酸残基可以用任何合成的含有 羟基的氨基酸取代；一个或更多的丝氨酸残基可以用苏氨酸或任何合成的羟基化的氨基酸 取代；一个或更多的苏氨酸残基可以用丝氨酸或任何合成的羟基化的氨基酸取代；一个或 更多的苯丙氨酸残基可以用任何合成的芳族氨基酸取代；一个或更多的色氨酸残基可以用 任何合成的芳族氨基酸取代；和一个或更多的天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸或羟脯氨 酸残基可以被糖基化；一个或更多的酪氨酸残基可以用3-羟基或2-羟基异构体（分别为 间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-硫-和O-磷-衍生物取代或可用去甲Tyr、硝基-Tyr、单 碘-Tyr或二碘-Tyr取代；脂肪族氨基酸可以由带有上至和包括n = 8的非天然脂肪族分 支或线性侧链CnH2n+2的合成衍生物取代；Leu残基可用Leu (D)取代；Trp残基可用卤-Trp、 Trp(D)或卤-Trp(D)取代；卤素是碘、氯、氟或溴，其任选地被放射性标记。 44?分离的肽，其具有选自 SEQ ID003、SEQ ID010、SEQ ID01USEQ ID022 和 SEQ ID023 的序列。
【专利摘要】本发明涉及芋螺肽，其在锥体螺的毒液中以微量天然地可获得，或为天然地可获得的肽的类似物，并且其阻断钠通道。
【IPC分类】A61K38/17, A61P35/00, C07K14/435
【公开号】CN105102475
【申请号】CN201380031793
【发明人】J·因佩里亚尔, B·R·格林, J·咖也瓦克, M·张, D·尤斯卡米, G·布拉杰, B·奥利韦拉, A·威肯登, Y·刘
【申请人】犹他大学研究基金会, 杨森制药公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2013年4月17日
【公告号】EP2838913A1, EP2838913A4, US20150322120, WO2013158800A1