人二库宁肽的制作方法

专利名称：人二库宁肽的制作方法
技术领域：
本发明的组合物涉及领域为抑制丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质。本发明还涉及到的领域为产生丝氨酸蛋白酶抑制性蛋白质的核酸构建体、载体、以及宿主细胞、包含这种蛋白质的药物制剂，以及其使用方法。
背景技术：
失血是较大的外科手术，例如打开心脏的外科手术及其它复杂手术的一种严重的并发症。心脏手术患者构成了受血者的一大部分。输血有传染疾病和副反应的风险。此外，献血血液昂贵而且常常是供不应求。已有减少失血及随之而来的对输血的需求的药理学方法的报道(Scott等作过综述，胸外科年鉴(Ann.Thorac.Surg.)50843-851，1990)。蛋白质丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz族的牛丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑蛋白酶肽(aprotinin)是药剂Trasylol的活性物质。已有报道说抑蛋白酶肽(Trasylol)能有效地减少手术期失血(Royston等，手术刀(Lancet)ii1289-1291，1987；Dietrich等，胸部心血管外科手术(Thorac.Cardiovasc.Surg.3792-98，1989；Fraedrich等，胸部心血管外科手术(Thorac.Cardiovasc.Surg.3789-91，1989)；W.VanOeveren等(1987)，胸外科年鉴(Ann Thorac.Surg)44，640-645页；Bistrup等，(1988)手术刀I(Lancet I)，366-367)，但是也有有害反应的报道，包括低血压和潮红(Bohrer等，麻醉(Anesthesia)45853-854，1990)以及变应反应(Dietrich等，Supra)。对先前接触过抑蛋白酶肽的患者不推荐使用抑蛋白酶肽(Dietrich等，Supra)。Trasylol已被用于纤溶物过多(hyperfibrinolytic)出血及外伤出血休克的治疗。
已知抑蛋白酶肽能抑制一些丝氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶、纤溶酶和激肽释放酶，并用于急性胰腺炎、不同状态的休克综合征、纤溶物过多(hyperfibrinolytic)出血及心肌梗塞的治疗中(Trapnell等，(1974)英国外科杂志(Brit J.Surg.)61177；J.McMichan等(1982)循环休克(CirculatoryShock)9107；Auer等(1979)Acta Neurochir.49207；Sher(1977)美国妇产科杂志(Am.J.Obstet.Gynecol.129164；Schneider(1976)，Artzneim.-Firsch.261606)。一般认为Trasylol在体内通过抑制激肽释放酶和纤溶酶减少失血。与天然的抑蛋白酶肽本身相比，发现抑蛋白酶肽(3-58，Arg15，Ala17，Ser42)表现出改进的血浆激肽释放酶抑制能力(WO 89/10374)。抑蛋白酶肽的问题由于抑蛋白酶肽来源于牛，在把病人与药物再一次接触之后就会导致过敏反应的一定的风险。因此，人类功能等同的抑蛋白酶肽由于其更低的过敏反应的风险而将是最有用和所期望的。
当以高剂量重复给药时，抑蛋白酶肽还会引导啮齿类动物和狗肾中毒(Bayer，Trasylol，蛋白酶抑制剂(Inhibitor of Proteinase；Glasser等，见“Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin，78.Kongress”，Bergmann，Munchen，1972，第1612-1614页)。有一种假设把这种效应归因于由于带高净正电，抑蛋白酶肽在肾的附近带负电的小管中的积累(WO93/14120)。
因此，本发明的目的之一是发现有类似于抑蛋白酶肽的功能活性的人蛋白质。本发明的目的还包括发现可能带更少的电，然而表现同样的、高度相似的或改善的在抑蛋白酶肽上发现的蛋白酶特异性，尤其是对于纤溶酶和激肽释放酶而言。这类抑制剂就可以以减低的副免疫反应的风险和减低的肾中毒重复地用作人类患者的药剂。
发明简单总结本明所提供的丝氨酸蛋白酶抑制剂可特定地抑制激肽释放酶，该酶通过亲和色谱从人胎盘组织中分离出来。
本发明提供一种新发现的本文称之为人胎盘二库宁肽(bikunin)的人蛋白质，它包含Kunitz类的两个丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。在一个具体的实施方案中，本发明实施了一种具有下述氨基酸序列的蛋白质ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS 179
(序列号1)在本发明的一个优选实施方案中，提供的人胎盘二库宁肽蛋白，具有氨基酸序列ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK 170(序列号52)一方面，本发明的蛋白质的生物活性是它可与胰蛋白酶、人血浆和组织激肽释放酶、人纤溶酶和第VIIa因子结合并显著抑制其生物活性。在一个优选实施例中，本发明以糖基化的形式提供天然的人胎盘二库宁肽蛋白。在进一步的实施方案中，本发明包含被配制成至少含一个半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的天然人二库宁肽蛋白。在一个优选实施方案中，该蛋白质至少含有一个链内的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，该二硫键从下列半胱氨酸对的组中选择，包括CYS 11-CYS 61，CYS 20-CYS 44，CYS 36-CYS 57，CYS 106-CYS 156，CYS 115-CYS 139及CYS 131-CYS 152，其中半胱氨酸的编号根据天然人胎盘二库宁肽的氨基酸序列。一个普通技术人员会认识到本发明的蛋白质可折叠成合适的三维结构以保持天然人二库宁肽的生物活性，其中可能不出现，也可能出现一个或多个，或全部天然的链内半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。在一个最优选实施方案中，本发明的蛋白质合适地折叠并形成了带有所有合适的天然的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。
如下述实施例，本发明的活性蛋白质可从人类组织，例如胎盘中纯化而来，或通过合成蛋白化学技术而来。也可明白本发明的蛋白质可用分子生物学技术得到，其中自我复制的载体能在转化细胞中表达本发明的蛋白质。这种蛋白质可以设计成转化细胞的非分泌性的或分泌性的形式。为了帮助从转化细胞中分泌，或增强该翻译的蛋白质的功能稳定性，或帮助二库宁肽蛋白的折叠，可在天然人二库宁肽蛋白的NH2末端部分加上特定的信号肽序列。
在一个实施方案中，本发明因而提供了带有至少一部分完整的天然信号肽序列的天然人二库宁肽蛋白。因此，本发明的一个实施方案提供了带有至少部分该信号肽的天然二库宁肽，具有序列
AGSFLAWLGSLLLSGVLA -1ADRERSIHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 50YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF100NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE150ACMLRCFRQQENPPLPLGSKVVVLAGAVS 179(序列号2)在一个优选的实施方案中，本发明提供部分完整的引导序列的天然人胎盘二库宁肽蛋白，它具有序列号52的氨基酸序列并具有一个完整的引导区段，该区段具有氨基酸序列MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA-1(序列号53)在另一个实施方案中，本发明提供部分完整的引导序列二库宁肽蛋白，它具有序列号52的氨基酸序列并具有完整的引导区段，该区段具有氨基酸序列MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA-1(序列号54)此处所用的一个优选的编号系统中，把天然人胎盘二库宁肽氨基酸序列的NH2末端指定为编号+1的氨基酸。人们将方便地识别功能蛋白片断可衍生自天然人胎盘二库宁肽的，它会保留天然人胎盘二库宁肽的至少一部分生物活性，并作为丝氨酸蛋白酶抑制剂。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质含有天然人胎盘二库宁肽片断，该片断包含至少一个有功能的类Kunitz结构域，该结构域具天然人胎盘二库宁肽氨基酸7-159的氨基酸序列，下文称之为“二库宁肽(7-159)”。因此本发明实施了具有下列氨基酸序列的蛋白质IHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN50YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF 100NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVEFNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQ 159
(序列号3)其中氨基酸编号相应于天然人胎盘二库宁肽的氨基酸序列。本实施方案的另一个有功能的变体可是天然人胎盘二库宁肽的片断，它包含至少一个有功能的类Kunitz结构域，并具有天然人胎盘二库宁肽氨基酸11-156的氨基酸序列，二库宁肽(11-156)。
CLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN50YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF 100NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150ACMLRC 156(序列号50)可以意识到单独的类Kunitz结构域仍然是天然胎盘二库宁肽的片断。尤其是，本发明提供了具有由天然人胎盘二库宁肽氨基酸7-64组成的头一个类Kunitz结构域的氨基酸序列的蛋白质，下文中称之为“二库宁肽(7-64)”。因而在一个实施方案中，包含了一种具至少一个类Kunitz结构域的蛋白质，其具有氨基酸序列IHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCCLFVYGGCDGNSNN 50YLTKEECLKKCATV 64(序列号4)其中氨基酸编号相应于天然人胎盘二库宁肽的氨基酸序列。本发明另外一种形式的蛋白质可以是头一个类Kunitz结构域，它由天然人胎盘二库宁肽氨基酸11-61的氨基酸序列，具有氨基酸序列“二库宁肽(11-61)”组成CLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 50YLTKEECLKKC61(序列号5)本发明还提供一个具有由天然人胎盘二库宁肽氨基酸102-159的氨基酸序列组成的类Kunitz结构域的氨基酸序列的蛋白质，下文中称为“二库宁肽(102-159)”。因而本发明的一个实施方案包括至少一个类Kunitz的结构域蛋白质，它具有氨基酸序列
YEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQ 159(序列号6)其中氨基酸编号相应于天然人胎盘二库宁肽的氨基酸序列。本结构域的另一种形式可是一个由天然人胎盘二库宁肽氨基酸106-156的氨基酸序列组成的类Kunitz结构域，“二库宁肽(106-156)”具氨基酸序列CTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150ACMLRC 156(序列号7)因而一个普通技术人员会认识到可以设计能保留至少一部分天然蛋白质生物活性的天然人二库宁肽蛋白的片断。这类片断可以以不同方向或多种结合方式结合提供可供选择的蛋白质，它保留部分、或同样或更多的天然人二库宁蛋白的生物活性。
可以很轻易地意识到本发明的生物活性蛋白可包含一个或更多的本类Kunitz结构域与另外的其它来源的类Kunitz构域结合。本发明的生物活性蛋白可包含一个或更多的本类Kunitz结构域与另外的其它来源的具有各种生物活性的蛋白质结构域相结合。本发明的蛋白质的生物活性可与其它已知蛋白质的结合以提供具有可预知生物活性的多功能融合蛋白质。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种包含至少一种相同于或功能上相当于 序列号5或序列号7中的氨基酸序列片断的蛋白质。
一个在早期终止密码子处停止的开放阅读框仍然可编码有功能的蛋白质。本发明包括这类可供选择的终止，在一个实施方案中提供了的具下列氨基酸序列的蛋白质ADRERSIHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 50YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDS 92(序列号8)在一个实施方案中，本发明提供了相当纯化的，或重组产生了的天然人二库宁肽蛋白，该蛋白具有引导序列完整区断，以及完整天然穿膜区域的一部分。因此本发明的一个实施方案形成了天然人二库宁肽，它具有完整的引导序列，以及至少一部分穿膜结构域(下面划线)，它具有的氨基酸序列从下面选出 MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA -12)PCRMAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -13)λcDNA MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -11)ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN502)ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN503)ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN501)YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 1002)YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 1003)YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 1001)NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 1502)NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 1503)NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 1501)ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 2002)ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 2003)ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 2001)QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 2252)QERALRTVWS FGD 2133)QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225其中序列1)是从共有序列序列号45衍生来的EST，序列2)是PCR克隆序列号47，序列3)是λDNA克隆序列号49。在一个优选实施方案中，本发明的蛋白质包括序列号45，47或49的氨基酸序列中的一个，其中蛋白质在最后一个Kunitz结构域尾部和穿膜区域之间的区域被切开。
本发明还实施了缺失信号肽的蛋白质。因此本发明提供具有与穿膜氨基酸序列连续的具有序列号52的氨基酸序列的蛋白质，穿膜氨基酸序列ESTVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200ESTQERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(序列号69)穿膜氨基酸序列PCRVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200PCRQERALRTVWS FGD 213(序列号68)或穿膜氨基酸序列λcDNAVVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200λcDNAQERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(序列号67)本发明的蛋白质的氨基酸序列使本领域人员清楚地认识到能在分子生物学技术中使用以生产本发明的蛋白质的合适的核苷酸序列。因而，本发明的一个实施方案提供了具图3(序列号9)的共有DNA序列的编码人二库宁肽的核酸序列，它被翻译成了图3(序列号10)的天然人胎盘二库宁肽序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了编码图4D(序列号45)的氨基酸序列的图4C(序列号51)的共有核酸序列。
在一个优选实施方案中，本发明提供具有图4F(序列号48)DNA序列的编码序列号49的蛋白质序列的编码天然人胎盘二库宁肽的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供编码序列号47的蛋白质序列的图4E(序列号46)的核酸序列。
人们可以方便地认识到可以在核酸序列中设计特定的等位突变，以及保守取代，而仍将得到落入本发明的蛋白质氨基酸序列。本领域的技术人员可以明白本发明的蛋白质的特定的天然等位突变，以及本发明的蛋白质的氨基酸序列的保守取代将不会明显地改变蛋白质的生物活性，并落入本发明之中。
本发明还提供包含人胎盘二库宁肽及其片断并用于减少受治疗患者的手术期失血的药物组合物。
本发明还提供减少手术患者手术期失血的方法，其中把有效量的公开的本发明的人丝氨酸蛋白酶抑制剂在生物学可接受的载体上对患者给药。
本发明还提供包含氨基酸取代因而改变了蛋白酶特异性的胎盘二库宁肽的变体，以及上述的特定Kunitz结构域。优选的取代位点如下指出，是天然胎盘二库宁肽氨基酸序列中的从Xaa1到Xaa32的位置。从Xaa1到Xaa16取代是二库宁肽(7-64)的变体优选的，而Xaa17到Xaa32是二库宁肽的取代(变体102-159)优选的。
因而本发明实施的蛋白质具氨基酸序列(序列号 11)Ala Asp Arg Gla Arg Ser Ile Xaa1Asp Phe 10Cys Leu Val Ser Lys Val Xaa2Gly Xaa3Cys 20Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Trp Trp Tyr Asn30Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu Phe Xaa1040Tyr Xaa11Gly Cys Xaa12Xaa13Xaa14Ser Asn Asn 50Tyr Xaa15Thr Lys Glu Glu Cys Leu Lys Lys 60Cys Ala Thr Xaa16Thr Glu Asn Ala Thr Gly 70Asp Leu Ser Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp 80Ser Ser Val Pro Ser Ala Pro Arg Arg Gln 90Asp Ser Glu His Asp Ser Ser Asp Met Phe100Asn Tyr Xaa17Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala 110Val Xaa18Gly Xaa19Cys Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24120Xaa25Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser 130Cys Asn Asn Phe Xaa26Tyr Xaa27Gly Cys Xaa28140Xaa29Xaa30Lys Asn Ser Tyr Xaa31Ser Glu Glu 150Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Xaa32Gln 160Glu Asn Pro Pro Leu Pro Leu Gly Ser Lys170Val Val Val Leu Ala Gly Ala Val Ser179(SEQ ID NO11).
其中Xaa1-Xaa3每一个分别代表除半胱氨酸(Cys)外的天然存在的氨基酸残基，附带条件为至少Xaa1-Xaa32中有一个氨基酸残基与天然序列相应的氨基酸残基不同。
本文中，术语“天然存在的氨基酸残基”意指任一20个普遍存在的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
通过在上述一个或多个位置取代一个或多个氨基酸，可以改变天然胎盘二库宁肽或单个的类Kunitz结构域-二库宁肽(7-64)或二库宁肽(102-159)的抑制剂特异性分布，以优选地抑制其它丝氨酸蛋白酶，例如但不限于补体级联(complement cascade)的酶，转移因子/因子VIIa(TF/FVIIa)、因子Xa(FXa)、凝血酶、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G或蛋白酶-3。
胎盘二库宁肽的优选变体的实例包括那些其中Xaa1是从包含His、Glu、Pro、Ala、Val或Lys的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa1为His或Pro；或其中Xaa2是从包含Val、Thr、Asp、Pro、Arg、Tyr、Glu、Ala、Lys的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa2为Val或Thr；或其中Xaa3是从包含Arg、Pro、Ile、Leu、Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa3为Arg或Pro；或其中Xaa4是从包含Arg、Lys和Ser、Gln的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa4为Arg或Lys；或其中Xaa5是从包含Ala、Gly、Asp、Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa5为Ala；或其中Xaa6是从包含Ser、Ile、Tyr、Asn、Leu、Val、Arg、Phe的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa6是Ser或Arg；或其中Xaa7是从包含Met、Phe、Ile、Glu、Thr和Val的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa7是Met或Ile；或其中Xaa8是从包含Pro、Lys、Thr、Gln、Asn、Leu、Ser或Ile的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa8是Pro或Ile；或其中Xaa9是从包含Arg、Lys或Leu的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa9为Arg；或其中Xaa10是从包含Val、Ile、Lys、Ala、Pro、Phe、Trp、Gln、Leu和Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa10为Val；或其中Xaa11是从包含Gly、Ser和Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa11是Gly；或其中Xaa12是从包含Asp、Arg、Glu、Leu、Gln、Gly的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa12是Asp或Arg；或其中Xaa13是从包含Gly或Ala的组中选出的氨基酸残基；或其中Xaa14是从包含Asn或Lys的组中选出的氨基酸残基；或其中Xaa15是从包含Gly、Asp、Leu、Arg、Glu、Thr、Tyr、Val和Lys的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa15为Leu或Lys；或其中Xaa16是从包含Val、Gln、Asp、Gly、Ile、Ala、Met和Val的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa16是Val或Ala；或其中Xaa17是从包含His、Glu、Pro、Ala、Lys和Val的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa17为Glu或Pro；或其中Xaa18是从包含Val、Thr、Asp、Pro、Arg、Tyr、Glu、Ala或Lys的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa18是Thr；或其中Xaa19是从包含Arg、Pro、Ile、Leu或Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa19为Pro；或其中Xaa20是从包含Arg、Lys、Gln和Ser的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa20是Arg或Lys；或其中Xaa21是从Ala、Asp、Thr或Gly的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa21是Ala；或其中Xaa22是从包含Ser、Ile、Tyr、Asn、Leu、Val、Arg或Phe的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa22是Ser或Arg；或其中Xaa23是从包含Met、Phe、Ile、Glu、Leu、Thr和Val的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa23是Phe或Ile；或其中Xaa24是从包含Pro、Lys、Thr、Asn、Leu、Gln、Ser或Ile的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa24是Pro或Ile；或其中Xaa25是从包含Arg、Lys或Leu的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa25是Arg；或其中Xaa26是从包含Val、Ile、Lys、Leu、Ala、Pro、Phe、Gln、Trp和Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa26为Val或Ile；或其中Xaa27是从包含Gly、Ser和Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa27为Gly；或其中Xaa28是从包含Asp、Arg、Glu、Leu、Gly或Gln的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa28是Arg；或其中Xaa29是从包含Gly和Ala的组中选出的氨基酸残基；或其中Xaa30是从包含Asn或Lys的组中选出的氨基酸残基；或其中Xaa31是从包含Gly、Asp、Leu、Arg、Glu、Thr、Tyr、Val和Lys的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa31是Arg或Lys；或其中Xaa32是从包含Val、Gln、Asp、Gly、Ile、Ala、Met和Thr的组中选出的氨基酸残基，尤其是其中Xaa32是Gln或Ala。


下述详细说明与权利要求和附图一起将使得对本发明有更好的理解，其中图1描述了EST R35464(序列号12)的核酸序列及这段DNA序列(序列号13)的翻译，翻译后产生带有一些与抑蛋白酶肽相似的序列在开放阅读框。该翻译产物在恰当的间隔处有作为类Kunitz抑制剂结构域(以黑体指出)特征的6个半胱氨酸中的5个。一般被剩余半胱氨酸(密码子38处)占据的位置被苯丙氨酸所替代(以星号指出)。
图2描述了EST R74593(序列号14)的核酸序列，以及这段DNA序列(序列号15)的翻译，该翻译产生与Kunitz类的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域同源的开放阅读框。翻译产物包含在恰当间隔处作为类Kunitz抑制剂结构域(以黑体表示)特征的6个半胱氨酸。然而，这个阅读框序列包含在密码子3和密码子23处的终止密码子。
图3描述了标记为“共有序列”人胎盘二库宁肽(序列号9)的推论的核酸序列，其配对于被标记为“翻译的”翻译的蛋白质氨基酸序列(序列号10)。还作为对照，显示了ESTs H94519(序列号16)、N39798(序列号17)、R74593(序列号14)和R35464(序列号12)的核酸序列。在共有序列中下面划线的核苷酸相应于实施例中描述的PCR位点。在翻译的共有序列中下面划线的氨基酸是那些其本身被纯化的人胎盘二库宁肽的氨基酸测序所确证的残基。核苷酸和氨基酸的代码是标准的单字母代码，核酸代码中的“N”指未定的核酸，“*”指氨基酸序列中的终止密码子。
图4A描述了一系列有一些核酸序列与编码人胎盘二库宁肽的ESTs或其部分同源的ESTs的最初的重叠。用作参照显示出的是二库宁肽(7-64)和二库宁肽(102-159)的相对位置，分别被称为KID1和KID2。
图4B描述了合并了附加ESTs后的更全面的EST重叠。X轴上端的数字指碱基对长度，碱基对长度从最5′的EST序列的第一个碱基开始算。每一横条的长度与单个的包含间隙的EST的以碱基对表示的长度是成比例的。EST的增加数分别在其EST横条右边示出。
图4C描述了在图4B中简要显示的每一个重叠ESTs的相应的寡核苷酸相应的排列。上面的标记为二库宁肽的序列(序列号51)代表在每一位置上从重叠核苷酸衍生来的共有寡核苷酸序列。数字指在EST图中的碱基对位置。在EST R74593中黑体下面划线的寡核苷酸(在图上位置994和1005)是在所有其它重叠ESTs中一贯缺少而出现于R74593中的碱基插入。
图4D描述了在图4C中描述的二库宁肽的共有寡核苷酸序列(序列号45)的氨基酸翻译。
图4E描述了通过基于PCR扩增的从人胎盘cDNA文库衍生来的人胎盘二库宁肽编码序列的核苷酸序列(序列号46)及相应的氨基酸翻译产物(序列号47)。
图4F描述了通过克隆杂交而从人胎盘入cDNA文库分离的天然人胎盘二库宁肽编码克隆的核苷酸序列(序列号48)及相应的氨基酸翻译产物(序列号49)。
图4G比较了通过EST重叠(序列号45)、基于PCR的克隆(序列号47)，以及经典的λ克隆杂交(序列号49)来的胎盘二库宁肽的寡核苷酸序列的翻译的氨基酸排列。
图5显示了用Superdex 75凝胶过滤(Superdex 75 Gel-Filtration)后从胎盘组织中纯化人胎盘二库宁肽的曲线图。曲线图是通过OD 280nm测定的蛋白质洗脱曲线(实线)、胰蛋白酶抑制测定中的洗脱蛋白质的活性(抑制百分数以圆圈表示)，以及激肽释放酶抑制测定中洗脱蛋白质的活性(抑制百分数以方框表示)的重叠。
图6显示了用C18反相色谱法(C16 Reverse-Phase Chromatography)从胎盘组织中纯化人胎盘二库宁肽的曲线图。曲线图是通过OD 215nm测定的蛋白质洗脱曲线(实线)、胰蛋白酶抑制测定中的洗脱蛋白质的活性(抑制百分数以圆圈表示)，以及激肽释放酶抑制测定中洗脱蛋白质的活性(抑制百分数以方框表示)的重叠。
图7描述了高度纯化的胎盘二库宁肽(第二道)以及一系列的蛋白质分子大小标准参照物(泳道1)的银染十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，其大小以千道尔顿表示。迁移为从上到下。
图8显示了在源自用指导胎盘二库宁肽(102-159)表达的质粒(pS604)稳定转化的酵母菌株SC101(图版8A)或WHL341(图版8B)的生长的无细胞发酵肉汤中出现的胰蛋白酶抑制活性的量。
图9显示了用指导牛抑蛋白酶肽或胎盘二库宁肽(102-159)的表达的质粒稳定转化的酶母菌株SC101(重组体2.4和2.5)的生长的无细胞发酵肉汤的SDS-PAGE银染(左图版)和用抗胎盘二库宁肽(102-159)pAb的Westem印迹(右图版)。迁移为从上到下。
图10是一张照片，它显示了高度纯化的胎盘二库宁肽(102-159)SDS-PAGE的银染(泳道2)和一系列的其大小以千道尔顿表示的蛋白质分子大小标准参照物(泳道1)。迁移为从上到下。
图11是一张照片，它显示了杂交到32P标记的编码胎盘二库宁肽(102-159)(图版11A)或编码胎盘二库宁肽(1-213)(图版11B)的cDNA探针的从不同的人组织来的mRNA的Northern印迹结果。迁移从上到下。每个印迹右边的数字指以千碱基表示的相邻RNA标准参照物的大小。mRNA来源的器官在每条印迹泳道下面表示。
图12描述了用对合成还原胎盘二库宁肽(7-64)(图版A)或102-159(图版B)的兔抗血清的胎盘来源的胎盘二库宁肽的免疫杂交。每个图版中，其内容是分子大小标准参照物(泳道1)；从人胎盘中分离到的天然胎盘二库宁肽(泳道2)；合成的胎盘二库宁肽(7-64)(泳道3)及合成的胎盘二库宁肽(102-159)(泳道4)。印迹Tricine10-20％SDS-PAGE凝胶并用蛋白A-纯化的一级多克隆抗体(溶于20ml 0.1％DAS/Tris-缓冲盐(PH7.5))，随后通过碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔二级抗体显色。迁移从上到下。
图13描述了考马斯蓝染色的3毫克来自于杆状病毒/Sf9表达系统(泳道2)的高度纯化的胎盘二库宁肽(1-170)的10-20％Tricine SDS-PAGE凝胶。泳道1含有分子大小标准参照物。迁移为从上到下。
图14描述了增加Sf6衍生的人胎盘二库宁肽(1-170)(实心圆)或合成的胎盘二库宁肽(102-159)(空心圆)或抑蛋白酶肽(空心方框)的浓度对人血浆部分凝血激酶激活时间的效应的比较。凝结由氯化钙起动。以蛋白质浓度对凝结时间的延长倍数作曲线图。未抑制的凝结时间是30.8秒。
发明详细描述本发明包括此处被称之人胎盘二库宁肽的一种新发现的人蛋白质，该肽含有两个Kunitz类的丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。本发明还包括用于减少外科手术患者或严重外伤患者手术期失血的含有胎盘二库宁肽与其片段的药物组合物。
本发明还提供了用于减少外科手术患者或严重外伤患者手术期失血的方法，其中把有效量的本发明公开的人丝氨酸蛋白酶抑制剂在生物学可接受的载体中对患者给药。
胎盘二库宁肽、分离的结构域以及其它变体的优选使用是用于减少由外伤或可引起大量失血的手术引起的失血。这些方法和制剂减少或消除对全血捐献(Whole donor blood)或血产品的需求，因而减少了感染或其它不利副效应的风险，同时也减少了手术费用。因此这种方法对减少正常患者的失血是有用的，正常的患者即那些没有天生或手术前的凝血因子缺陷的患者。减少失血是减少手术期失血，或手术后失血(post surgical drainage)或二者。优选的手术方式包括但不限于胸和腹部手术，全部或部分髋关节替换手术和治疗眼上皮损伤患者的手术。优选的胸外科手术包括但不限于主动脉冠状动脉分流手术、心动脉瘤和主动脉瘤切除手术、食管脉管曲张手术、冠状静脉分流手术。优选的腹外科包括但不限于肝移植、根治性前列腺切除手术、结肠憩室手术、肿瘤去肿(tumor debulking)、腹部动脉手术及十二指肠溃疡手术，以及肝或脾外伤修复。对外伤的优选治疗应用包括但不限于安定在伤口由于失去四肢或严重的胸/腹部伤的严重受伤患者。在应用于减少手术失血的情况下，优选在术前和手术期间施用胎盘二库宁肽、单个的结构域或其它变体；然而用于外伤时，应把胎盘二库宁肽变体、单个的结构域、或其它变体在损伤后尽快给药，并且应当包含于运输到伤口的急症赋形剂上。
因子XII(也被称为Hageman因子)是以29-40μg/ml(见Pixley等。(1993)酶学方法(Meth.in Enz.)，222，51-64)的酶原形式(80KD)在循环中发现的丝氨酸蛋白酶，并被组织和血浆激肽释放酶所激活。一旦被激活，它就参与当血液或血浆接触“异质”或阴离子表面时被激活的血液凝结的内部途径。一旦被激活，因子XIIa可切割和活化许多其它血浆蛋白酶，包括因子XI，前激肽释放酶和补体系统的C1。因此，由于激活的激肽释放酶能切割激肽原释放缓激肽(见Colman，(1984)J.Clin.Invest.，73，1249)因子XII可参与引起低血压反应。
脓毒症是由细菌感染的内毒素或脂多糖(LPS)引起的一种疾病。因子XII暴露于LPS会导致因子XII的活化。患脓毒症的患者也常有血管内凝结的症状，这也是由于因子XII被LPS激活导致的。败血症性休克也可由细菌感染引起并与发烧、低系统血管阻力、低动脉血压相关。它是美国强化监护单位中导致病人死亡的常见原因，其中百分之七十五死于败血症休克的患者患有持续的低血压(参见Parillo，等(1989)医学综述年鉴(Ann Rev.Med.)40，469-485)。
成人呼吸窘迫综合症的特征是肺水肿、血氧过少、降低的肺顺应性。虽然据信有凝结和纤维蛋白溶解的蛋白水解途径在其中起作用，但是这种病的发病机制仍然是未知的(参见Carvalho等(1988)。实验室临床医学学报(J.LabClin.Med.，112270-277))。
本发明的蛋白质也是一种激肽释放酶，一种因子XII活化剂的人Kunitz型抑制剂。因此本发明的另一个目的是提供全身性发炎反应的一种预防或治疗方法，全身性发炎反应例如败血症性休克、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)，子痫前期、多器官衰竭、弥漫性血管内凝血(DIC)。把本发明的肽给药用于治疗或预防将会引起这些炎症的缓和且有益于患者。
纤溶酶在细胞外基质降解和matrix-metallo蛋白酶(MMP)级联的活化中具有重要的作用。总的来说，这些蛋白酶介导在血管发生/新血管形成中的内皮细胞和转移的癌细胞的迁移并通过它们而组织侵染。新血管形成对肿瘤生长是必要的，而且转移介导肿瘤的扩展的过程，并和患者极端不良的预后相关。
一些临床前期的研究表明，具有与抑蛋白酶肽相似蛋白酶特异性的类Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂，都可用作癌症药物。例如，抑蛋白酶肽降低癌症的生长和侵染，当对患高度侵染性纤维肉瘤的仓鼠或患类似恶性乳房癌的小鼠给药时还能增加肿瘤的坏死(Latner等(1974)，英国癌学期刊(Br.J.Cancer)3060-67；Latner和Turner，(1976)，英国癌学期刊(Br.J.Cancer)33535-538)。另外，把200,000 KIU的抑蛋白酶肽在用Lewis肺癌细胞接种后第1天和第14天腹膜内对C57B1/6 Cr雄小鼠给药时，能降低50％的肺部转移，尽管对原发的肿瘤体没有效应Giraldi et al.，(1977)欧洲癌学期刊(Eur.J.Cancer)，131321-1323)。类似地，把10,000 KIU的抑蛋白酶肽在用Lewis肺癌细胞接种后的第13-16天每天对C57BL/6J鼠给药时，能降低90％的肺部转移，同时对原发的肿瘤生长没有效应(Uetsuji等，(1992)，日本外科杂志(Jpn.J.Surg)22429-422)。在同一研究中，还证明了以同样的剂量时间表用纤溶酶和激肽释放酶给药时增加肺部转移量。这些结果使得作者认为如果在手术期间用抑蛋白酶肽对患者给药时可能会减少转移的可能性。Black和Steger(1976，欧洲药理学报(Eur.J.Pharmacol.)，38313-319)发现在鼠中抑蛋白酶肽能抑制移植的噬齿类Murphy-Strum淋巴肉瘤，表明有涉及抑制细胞分裂素-形成酶系统的效应。在七周内对雌ddY小鼠每天两次腹膜内注射10,000 KIU的抑蛋白酶肽(这些小鼠每一只都患有来自于3-甲基胆蒽处理引起的单个的自身鳞状细胞癌)后，原发肿瘤的生长速率被降低了90％。在有些动物中曾观察列肿瘤消退。在7周的时间内，用赋形剂处理的所有动物均已死亡，而用抑蛋白酶肽处理的组则仍然存活。肿瘤生长的降低与角化过度症相关(Ohkoshi，Gann(1980)，71246-250)。
临床上，接受抑蛋白酶肽静脉注射的外科治疗组的26名患者在术后两年内存活率为70％，没有肿瘤复发；而安慰剂组的26名病人在同样时间内只有38％的存活率，并且肿瘤复发率相当高(Freeman等，英国胃肠病学协会(Br.Soc.Gastroenterol.)(1980)附件A902)。在一病例研究中(Guthrie等，英国临床实践期刊(Br.J.Clin.Pract)(1981)35330-332)，用溴麦角隐亭及抑蛋白酶肽对患子宫颈部晚期癌症的患者给药引起消退。每8小时重复一次用500,000 KIU的抑蛋白酶肽腹膜内注射(bolus)，同时以每6小时200,000 KIU的抑蛋白酶肽持续静脉注射，这种给药方式每个月总共七天。由于引起了对抑蛋白酶肽的过敏反应，治疗在4个月后中止。更近期的证据已进一步确证了对抑蛋白酶肽在转移上的效应中纤溶酶作为靶的作用。
这些现象的机制可与一个事实联系起来，那就是抑蛋白酶肽阻断了癌细胞系的侵染能力(Liu G.等，国际癌症期刊(Int J.Cancer)1995，60501-506)。而且，由于本发明的蛋白质也是纤溶酶和激肽释放酶的强烈抑制剂，它们也可用设计用作抗癌剂。例如它们可以设计用于通过限制新血管形成和原发肿瘤侵染而阻碍原发肿瘤的生长；以及用于通过抑制组织渗透而阻断转移。这种化合物可以局部对肿瘤给药，也可系统给药。在一种优选的治疗方式中，可进行肿瘤消除的手术期给药以使转移的风险最小。在这样的方法下，因其能提供更加清楚的手术视野，所以该化合物的抑制血液损失的特性具有额外的优点。另一种优选的给药方式是与MMP抑制剂或化学治疗剂结合的结合治疗。另一个优选的给药方式是实施设计为在肿瘤细胞或与其相联系的间质和血管床中选择性表达的胎盘二库宁肽的局部基因治疗。
所要治疗的优选癌症类型是血管依赖性的实体肿瘤，例如乳癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌，这些癌症均具有高度转迁的潜力，并且，该蛋白质对其高浓度的局部传送是可行的，例如肺癌通过肺运输、结肠癌通过肝运输到肝转移，皮肤癌，例如头颈癌或黑素癌通过皮下运输。由于本发明的蛋白质来源于人，所以当再一次使用时，它和如Guthrie等Supra所观察到的变应反应及过敏反应的相关性会更少一些。
另外，本发明的蛋白质是设计用于减少与凝结的内源途径的激活相关的血栓栓塞并发症的。这可以包括防止晚期癌症患者的肺栓塞，这是导致死亡的一个常见原因(Donati MB.，(1994)，Haemostasis 24128-131)。
脑和脊髓的水肿来自于脑外伤和脊髓损伤，中风、大脑局部缺血、大脑和蛛网膜下出血、手术(包括心脏打开手术)；感染疾病，例如脑炎或脑(脊)膜炎；肉芽肿疾病，例如肉样瘤和病灶性或扩散性的癌的并发症。而且这种水肿是这些事件的高度发病率或死亡的原因之一。实验已证实缓激肽能破坏血脑屏障(Greenwood J.，(1991)，放射神经学(Neuroradiology)，3395-100；Whittle等，(1992)，Acta Neurochr.，11553-59)。把缓激肽注入体内的颈动脉内会在患颈普通动脉闭塞的自发性高血压大鼠(SHR)上引起脑水肿(Kamiya，(1990)，Nippon IKa Daigaku Zasshi.57180-191)。在鼠脊髓创伤模型中，发现在受伤后细胞外液中缓激肽的水平上升(Xu等，(1991)，J.Neurochem，57975-980)，由于脑局部缺血导致脑水肿的鼠血浆和组织中缓激肽的水平也上升(Kamiya等，(1993)，Stroke，24571-575)。缓激肽从高分子量的激肽原通过包括激肽释放酶的丝氨酸蛋白酶释放而来(Coleman(1984)J.Clin Invest.731249)，有发现丝氨酸蛋白酶抑制剂抑蛋白酶肽能阻断由于SHR鼠(Kamiya，(1990)，Nippon IKa Daigaku Zasshi.57180-191；Kamiya等，(1993)，Stroke，24571-575)及患脑冷损害的兔子(Unterberg等，(1986)，J.Neurosurgery，64269-276)的脑局部缺血引起的脑水肿的加重。
这些现象说明由于激肽的局部蛋白水解释放，例如缓激肽从高分子量的激肽原释放，随后缓激肽诱导的血脑屏障的渗透的上升导致了脑水肿。因此，胎盘二库宁肽及其片断可被设计成用于预防有水肿风险的患者的水肿的药剂。尤其是那些具有致死或脑损伤的高风险。这包括头和脊柱外伤患者、多外伤患者、经受脑或脊髓和相关血管的手术或者其它常规手术包括心脏打开手术的患者，患有中风、脑或蛛网膜下出血出血、脑部感染疾病、脑部肉芽肿疾病或脑部弥漫性的或病灶性的癌及肿瘤或其它情况包括涉及血脑屏障崩溃的多发性硬化症的患者，或者患有其它脑或脊髓感染症的患者。患者将接受静脉内或颅内的输注或集合药团(bolus)注射形式的胎盘二库宁肽给药。额外剂量的二库宁肽可在随后的一至三周内间断给药。剂量水平将被设计以超过需用于中和血浆或缓激肽和其它通过丝氨酸蛋白酶作用形成的血管作用肽的水平上升，以及足以降低水肿的循环浓度。由于此蛋白来源于人，因此在治疗过程中的重复给药将不会导致形成对此蛋白质的免疫反应。胎盘二库宁肽及其片段可被设计用于单一治疗，也可与其它药剂例如神经治疗剂及神经保护剂结合用于预防。
最近的证据(Dola Cadena R.A.等(1995)，FASEB J.9446-452)已表明接触活化途径(contact activation pathway)可能参与了关节炎和贫血的发病机制，进而激肽释放酶抑制剂对于制疗可能是有益的。因此，本发明的蛋白酶根据其抑制人激肽释放酶的能力被设计用作治疗人的关节炎和贫血的药物。
用抑蛋白酶肽治疗男性非胰岛素糖尿病(NIDDM)患者能显著地提高总葡萄糖的吸收并降低胰岛素的代谢清除率(Laurenti等，(1996)，糖尿病医学(Diabetic Medicine 13642-645)。因此，本发明的人蛋白质可持续使用作治疗NIDDM的药物。
用尿胰蛋白酶抑制剂对有早产风险的病人进行每日治疗持续两周可显著降低复发子宫收缩(Kanayama等，(1996)，欧洲妇产科及生殖生物学期刊(Eur J.Obstet.Gynecol.& Reprod.Biol.)。因此，本发明的人蛋白质可设计用于预防早产。
已经表明抑蛋白酶肽能刺激小鼠成肌细胞在培养物中的分化(Wells和Strickland，发育(Development)，(1994)，1203639-3647))，这种分化过程可被TGFb抑制。TGFb以非活化的多肽原形式存在，并被限定的蛋白酶解活化。有建议认为抑蛋白酶肽作用机制是参与抑制了把TGFb原加工为成熟活化形式的蛋白酶。已经表明TGFb在各种纤维变性损伤中被上调节，长期以来还被认为是抗纤维变性治疗可能的靶。例如在肺纤维变性的模型鼠中，TGF-b浓度与博莱霉素诱导的感染程度是平行的。而且，肺泡巨噬细胞中的纤溶酶水平与成熟的TGF-b水平是一致的，加入纤溶酶抑制剂α2-抗纤溶酶能消除巨噬细胞对TGFb原的翻译后活化(Khal等，(1996)Am.JRespir，Cell.Mol.Biol.15252-259)。资料暗示纤溶酶参与通过肺泡巨噬细胞的活化形式TGFb的形成，而且此过程在博莱霉素诱导的肺感染中起到了病理性的作用。
基于这些情况，胎盘二库宁肽及其片段已被设计用作不同纤维变性疾病的治疗药剂，这些纤维变性包括肺、肝、肾和皮肤(硬皮病)的纤维变性。
已表明气雾化抑蛋白酶肽能防治50％的用致死剂量的流感病毒或副粘液病毒感染的小鼠(Ovcharenko和Zhirnov，抗病毒研究(Antiviral Research)，(1994)，23107-118)。经气雾化的抑蛋白酶肽治疗后，也观察到了致死出血性支气管肺炎的发展的抑制并有体重增加的正常。基于这些情况，胎盘二库宁肽及其片断已被设计用作各种与呼吸相关的类流感疾病的治疗剂。
本发明的人胎盘二库宁肽、单个的结构域以及其它变体都设计用于医药/治疗应用中，这些应用是需要天然抑蛋白酶肽或具有其它抑制特性的抑蛋白酶肽类似物，尤其是那些必需大剂量的。这包括用由于其能抑制人丝氨酸蛋白酶的特性而被使用的人蛋白质所治疗的疾病；该丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、激肽释放酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G及蛋白酶-3；这些疾病包括但不限于急性胰腺炎(胰弹性蛋白酶及胰蛋白酶)、感染、血小板减少病、血小板功能保存、器官保存、伤口愈合、各种形式的休克，包括休克肺、内毒素休克，以及术后并发病；凝血障碍，例如纤溶物过多出血(hyperfibrinolytic hemorrhage)；急性和慢性感染反应，尤其是治疗或预防器官损害，例如胰腺炎及辐射诱导的肠炎、复合物介导的发炎反应，例如免疫性脉管炎、肾小球肾炎及各种关节炎；胶原性疾病，尤其是类风湿性关节炎；各种由代谢相关废物引起的关节炎(例如痛风)；器官联结组织部分弹性成分的降解，例如动脉粥样硬化(血清弹性弹白酶)或肺气肿(嗜中性弹性蛋白酶)；成人呼吸窘迫综合症，肠感染疾病以及牛皮癣。
一个意料之外的重要发现是编码二库宁肽(7-64)及二库宁肽(102-159)的合成肽可以适当地折叠成具有活性的蛋白酶抑制剂生物活性的正确的三维结构(分别为实施例2及实施例1)。折叠时每一这些二库宁肽片断会减少每个片断上的6个半胱残基形成3个链内二硫键的6个质量单位，这种质量上的减少对每一种折叠情况都是一致的。另外一个意外的发现是编码二库宁肽(7-64)、二库宁肽(102-159)及二库宁肽(1-170)的合成肽对纤溶酶，以及组织和血浆激肽释放酶都是高度抑制的(分别为实施例4、3及10)。Trasylol对纤溶酶和激肽释放酶的抑制据信涉及到了在心脏打开手术中Trasylol减少了血液损失的机制。本发明的这种Kunitz结构域特异性的意外发现使得其可作为合适的治疗剂，可把它在大量失血或其它纤溶及/或激肽释放酶的抑制是有益的情况下的手术或外伤中用于止血。
而且，我们在此公开(实施例10)中表明胎盘二库宁肽(1-70)是因子XIa的一种有效抑制剂，并且是因子Xa的一种中度抑制剂。因子XIa在凝血内部途径中起到非常关键的作用，它能把无活性的因子IX相互转换成有活性的因子IXa。因此，胎盘二库宁肽抑制了内部途径的两个关键酶，激肽释放酶和因子XIa。与这些情况一致的是，我们也表明胎盘二库宁肽(1-170)是活化的部分促凝血酶原激酶时间的有效抑制剂，这个时间通过由内部途径引起的凝血时间测定。另一方面，我们表明胎盘二库宁肽(1-170)是组织因子VIIa复合物的一个极其弱的抑制剂，说明此胎盘二库宁肽在外源凝血级联的调控上是不重要的。基于这些意外的发现把胎盘二库宁肽设计成疾病的治疗剂，这些疾病中，凝血的内源途径的活化是主要的发病机制。这类疾病的实例包括伤后休克及弥漫性血管内凝血。
本发明的Kunitz结构域的一个主要优点是这些结构域都是人蛋白质，比Trasylol带更少的正电荷，因此在用大剂量蛋白质给药的情况下减少了肾损伤的风险。由于它来源于人，与等剂量的Trasylol给药相比，本发明的蛋白质因而可以在显著减少不需要的免疫反应的情况下对人类患者给药。另外，还发现二库宁肽(102-159)、二库宁肽(7-64)以及二库宁肽(1-170)在体内与Trasylol相比是明显更有效的血浆激肽释放酶的抑制剂(实施例3、4及10)。因此二库宁肽及其片断可望在体内能更有效地减少患者的失血。
丝氨酸蛋白酶抑制剂的给药量应足以提供正常血浆水平之上。为了用于防止在冠状动脉旁路手术(CABG)中或术后流血引起的血量减少，考虑到有效性的不同，应当使用本发明的蛋白质代替Trasylol。在《外科医生常用参考书》(Physicians Desk Reference)，(1995)中对Trasylol的使用已有简述，在附录A.列举了Trasylol。简短地说，在麻醉之后但在胸骨切开术之前以负荷剂量(loading dose)的胎盘二库宁肽、单个结构域或其它变体缓慢地用20到30分钟的时间对仰卧位的患者给药。依据例如患者体重及手术时间这些因素一般使用的总剂量在约2×106KIU(激肽释放酶抑制单位)到8×106KIU之间。完成负荷剂量之后，接着进行恒定的输注剂量(infusing dose)，一直到手术完成和患者离开手术室为止。优选的输出注剂量在每小时250,000列500,000 KIU的范围之内。把泵送初始量(Pump prime dose)加入到心肺旁路循环的初始流体中，在心肺旁路形成前把液态的初始流体替换掉。优选的泵送初始剂量在一到两百万个KIU的总量范围内。
本发明的蛋白质可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类。各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。本发明的蛋白质可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。
不经肠的给药方式包括静脉内的(i.v.)、皮下的(s.c.)、腹膜内的(i.p.)，以及肌内的(i.m.)途径。根据需要，静脉内给药可用于获得药物的峰值血浆浓度的快速调节。此外，这种药物可通过静脉内导管以所希望的速率持续给药。合适的赋形剂包括无菌、非致热的液体稀释剂，例如注射无菌水、无菌缓冲溶液或无菌盐水。所得的组合物在手术前或手术期间通过静脉内注射或输注给药。
由脂质体截留药物可能有助于提高药物的半衰期以及增强药物对吞噬体如参与发炎的嗜中性粒和巨噬细胞的靶向。通过引入与靶器官/组织如GI束及肺特异性的大分子结合的脂质体的外部的配基应该可提高脂质体标的的选择性。此外，i.m.或s.c.的沉淀物注射(deposit injection)，在有或没有把药物包裹入可消化的微球体(例如，包含聚-DL-交酯-共乙交酯(Poly-DL-Lactide-Co-glyColide))或含有胶原的保护性药剂中的情况下，可以用于达到药物缓释的效果。为了改善剂量形式的便利性，可以利用i.p.植入贮器及隔膜例如percuseal系统。也可通过利用注射笔(如，Novo Pin或Q-笔)或无针喷射注射器(例如，来自Bioject，Mediject或Becton Dickinson)来改善方便性以及患者的顺应性。也可利用可植入的泵通过套管(cannula)输送至目的地来精确地控制释放。实施例包括皮下植入的渗透泵，来自于ALEA例如ALZNET渗透泵。
可把药物结合入生物粘附性的特定载体(＜200mm)例如那些包含纤维素、聚丙烯酸酯或多聚亲有机物(PolyCarbophil)，并与适当的吸收增强物例如磷脂或酰基肉碱一起来获得到鼻的输送。市场上可以买到的系统包括由Biosys和Scios Nova开发的那些。
肺输送代表了把药物不经肠进入循环的给药方式。较低气道上皮对分子大小范围高至20kDa的大范围内的蛋白质是高度可渗透的。微米大小的干粉可用干粉吸入器例如InhaleTM、DuraTM、Fisons(SpinhalerTM)以及Glaxo(RotahalerTM)或基于Astra(TurbohalerTM)喷射剂的按计量剂量的吸入器输送到远端的肺泡表面，这些干粉在适当的载体，例如甘露糖醇、蔗糖或乳糖中包含有药剂。有或没有脂质体的溶液配方可用超声喷洒器输送。
经口的输送可把药物掺入片剂、包衣片剂、糖锭剂、硬的和软的明胶胶囊、溶剂、润滑剂、悬浮剂或惰性包衣的胶囊等设计为在低消化蛋白酶活性的结肠处释放药物的剂型中。后面一种的实例包括ALZA的OROS-CT/OsmetTM系统，以及Scherer Drug Delivery Systems的PULSINCAPTM系统。其它系统利用偶氮交联的多聚物，这些多聚物被结肠特异性的细菌偶氮水解酶降解，或利用在结肠中被pH升高所活化的聚丙烯酸多聚物。上述系统可与广范围的吸收增强剂一起联合使用。直肠的输送可通过把药物掺入到栓剂中而达到。
在其优选的药物应用中，为了减少手术期失血，本发明的胎盘二库宁肽的优选给药方式是不经肠的，优选通过中央线的静脉内途径。
所使用的药物组合物量将取决于待处理受者及状况。用本领域技术人员已知的方案无需过多实验的条件下可确定必需量。此外，根据靶蛋白酶例如为处理疾病状况需抑制的纤溶酶或激肽释放酶的测定量可计算必需量。因为本发明设计的活性物质被视为非毒性的，治疗优选超过活性剂最佳需要量的剂量给药。
另外，胎盘二库宁肽、单独的结构域或其它变体均可用于分离天然的物质，例如用基于亲和的分离方法从人体物质分离到的同源蛋白酶，以及用于诱导蛋白酶抗体，该蛋白酶可进一步用于探讨胎盘二库宁肽的组织分配及有用功能。寻找人类序列资料与抑蛋白酶肽在功能上同源的独特的蛋白质的存在是随着NCBI(国家生物学信息中心，马里兰州)的表达序列标记数据库(此后称为dbEST)的进入序列的独特的分析而推论出来的。利用TBlastN推导(BLAST或利用Altschul等(1990)J.Mol Biol 215403-410的方法的基础局部同源性搜寻工具)来搜寻查询序列及所有的数据库中的序列(包括蛋白质、或核酸的任何组合)之间的相似性，检查与牛前抑蛋白酶肽原(pre-pro-aprotinin)Trasylol序列具有同源性的核酸序列。这种对无数克隆的查询选择性地缩小到两个特别的克隆，这两个克隆可能能够编码一条推论的氨基酸序列，而此氨基酸可能相应于在功能上同源于抑蛋白酶肽的人蛋白质。所选择的氨基酸序列是R35464(SEQ IDNO12)及R74593(SEQ ID NO14)，它们来源于人胎盘核酸文库。在R35464(SEQ ID NO13)的最长的开放阅读框的翻译蛋白质序列中缺失了对Kunitz结构域共价结构的形成具关键作用的6个半胱氨酸中的一个，这意味着R35464的核酸序列不能产生有功能的抑制剂。类似地，R74593(SEQ IDNO15)的最长翻译的开放阅读框在编码类Kunitz序列的5′包含一个终止密码子，这意味着这个序列不能够翻译产生功能性的分泌Kunitz结构域。这些序列单独而言其意义不甚至明了。有可能它们代表a)假基因产物，b)未翻译mRNA区域，或c)编码测序不正确的有活力mRNA的产物。人二库宁肽的发现为了特异地分离及确定实际的人类序列，设计了能与编码我们建议的发现于R35464和R74593中的类Kunitz序列的cDNA片断的5′及3′序列杂交的引物。用于扩增R74593的编码类Kunitz序列的片断的引物为CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG(具Hind III位点的3′引物；SEQID NO33)及AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA(具Xba位点的5′引物；SEQ ID NO34)。
这些引物通过PCR(30个循环)用于扩增来自于Clontech(MATCHMAKER，Cat#HL4003AB，Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)的人胎盘cDNA文库的500对碱基的产物，该产物被亚克隆到Bluescript-SK+中，并通过T3引物用SequenceTM试剂盒版本2.0测序。令人惊奇的是，用我们的引物获得的片断与dbEST数据库中所列出的R74593的序列并不相同。具体而言，我们的新序列在假定的终止密码子的3′含有一个额外的插入鸟苷，但在编码类Kunitz序列的区断上它是在5′(图3)。这个额外的G的插入使得终止密码子移到了类Kunitz结构域阅读框之外(在R74593的正确序列中，G位于第114碱基对的位置；图3)。
随后dbEST中查询对R74593类Kunitz肽序列同源的序列，得到了衍生自人类视网膜文库的H94519及N39798。这些序列含有与R35464编码的类Kunitz结构域几乎是相同的类Kunitz序列，除了其含有所有6个特征性的半胱氨酸。把每一核苷酸序列与R74593(修正了第114碱基对处的插入G)及R35464进行重叠以获得部分人胎盘二库宁肽(SEQ ID NO9；图3)的共有核苷酸序列。共有序列的翻译产生了从-18到+179残基的开放阅读框(图3SEQ ID NO10的全翻译)，它含有两个完全的类Kunitz结构域序列，这两个序列分别位于氨基酸残基17-64和102-159的区域之内。
通过用R35464查询dbEST进行尝试以获得附加的5′序列，从这些查询得到的可能的符合具有附加5′序列再用来对dbEST进行重新查询。在这样一种重复查询形式下，发现了一系列的重叠5′序列，包括的克隆有H16866、T66058、R34808、R87894、N40851及N39876(图4)。这些序列的对比表明5′ATG的存在可能是作为共有翻译蛋白质序列合成的起始位点。从这种选择的信息中，现在有可能选择性地筛选并确定人的在功能上与抑蛋白酶肽同源的蛋白质的核酸和多肽序列。
对dbEST的再查询揭示了许多新的EST入口，如图4B所简要表示。这些附加EST的重叠能让我们构建一个更长的共有寡核苷酸序列(图4C)，该序列在5′和3′都延伸到了图3所示的原始寡核苷酸序列之外。实际上，新的总长1.6kb的序列一直延伸到3′多聚A尾处。顺着序列在每一碱基对处增加的重叠EST能增强在特定区域内例如在与EST R74593 3′(图3)重叠的序列上的置信度。在此区域内的几个重叠EST证实了与R74593相关的两个关键碱基缺失(R74593位于图4C中粗体下划线处，图上位置为994及1005)。在二库宁肽编码框内的新的共有序列(图4D)的翻译产生了一种比编码于原始共有序列(SEQ ID NO1)的成熟序列(179个氨基酸)要大(248个氨基酸)的胎盘二库宁肽，并被寡核苷酸共有序列内的框内终止密码子所终止。这种大小上的增加是由于缺失EST R74593所特有的两个碱基的插入所导致的3′编码区的移码。移码使得原始的共有序列(图3)的终止密码子移到了框外，这使得通读进入了一个新的读码框，该框编码附加的氨基酸序列。新的翻译产物(图4D)与原始的蛋白质共有序列(SEQ ID NO1)在+1到+175(编码Kunitz结构域)残基之间是相同的，但含有一个新的延伸的C末端显示出一个假设的24个残基长的穿膜结构域(图4D中划线部分)，其后跟随31个残基的胞质结构域。在起始密码子甲硫氨酸及信号肽周围的精确序列在某种程度上是推测性的，由于在这个区域的重叠EST间有相当多的异质性。
通过GeneworksTM对蛋白质序列进行分析，在第30及67位置上的所强调的天冬氨酸为假设的N-连接的糖基化共有序列位点。天冬氨酸30在对分离自人胎盘的全长蛋白质的N-末端测序中未观察到，这与它被糖基化是一致的。人二库宁肽的克隆由图3的分析推论出的相应于假设的人二库宁肽核苷酸序列的人mRNA的存在被如下证实。与R35464的Kunitz-编码的cDNA序列5′(图3中第3-27bp的共有核酸序列)杂交的引物GGTCTAGGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA(具XbaI位点的衍生自R35464序列的5′引物；SEQ ID NO35)，与R74593的Kunitz-编码序列的3′(图3中第680-700bp的共有核苷酸序列)杂交的核酸引物被用于PCR扩增Clontech人胎盘文库，预期有一个长约为670bp的编码图3的胎盘二库宁肽cDNA共有核酸序列的片段。(如图4A中简要表示)。
使用与上述的假设ATG起始位点5′的R87894的126bp序列杂交的5′引物，(如简要表示的图4A中第110bp)，再加上与上面所用的R74593相同的3′引物，可以从Clontech人胎盘文库中扩增一条具有期望长度的片段(约872bp)，这种长度可由EST重叠(如图4简要表示)推测出来。
对872bp片段的测序表明它在其5′末端含有相应于EST R87894的第110至218bp的的核苷酸区，在其3′末端含有从EST重叠分析推测而来的人胎盘二库宁肽的共有序列的第310至542bp的核苷酸区段。其3′核苷酸序列含有所有由胎盘二库宁肽(102-159)编码的类Kuntz结构域。
为得到编码蛋白质全部胞外区域的cDNA，设计与EST R34808杂交的下列5′PCR引物CACCTGATCGCGAGACCCC(序列36)该引物与相同的EST 74593的3′引物一起用来扩增(30个循环)一个约780碱基对的来自于人胎盘cDNA文库的cDNA产物。这个产物用凝胶纯化，并克隆到TA载体(Invitrogen)中用于通过双脱氧法进行DNA测序(Sanger F.，等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，745463-5467)，所用引物如下载体特异性GATTTAGGTGACACTATAG (SP6)(SEQ ID NO37)TAATACGACTCACTATAGGG (T7)(SEQ ID NO38)基因特异性TTACCTGACCAAGGAGGAGTGC (SEQ ID NO39)AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG (SEQ ID NO40)CAGTCACTGGGCCTTGCCGT(SEQ ID NO41)所得cDNA序列与其翻译产物在图4E中一块表示。在核苷酸水平上，此序列与共有EST序列(图4D)之间仅显示微小差异。序列的翻译产物含有框内起始ATG位点的编码序列、信号肽及成熟的胎盘二库宁肽及穿膜结构域。由于3′引物对PCR扩增的选择性，PCR产物的翻译序列在胞质结构域至少缺失了12个氨基酸。这种3′PCR引物(基于R74593的序列设计)的选择性也引入了翻译的PCR衍生序列的第211氨基酸位置上的S到F的人工变异。从PCR片段翻译推论到的信号肽与EST共有序列也多少有些差异。
为了获得全长的胎盘二库宁肽cDNA，PCR衍生的产物(图4E)用凝胶纯化并用于分离代表二库宁肽序列的非PCR基础的全长克隆。PCR衍生的cDNA序列通过High Prime(Boehringer Mannheim)以32P-CTP标记，并通过克隆杂交技术用来探查胎盘cDNA文库(Strategene，UnizapTMλ文库)。经过3轮筛选及噬菌斑纯化之后约有2×106个噬菌斑。根据与EST共有序列(参看上述内容)的比较及限制酶分析确定了两个被视为是全长(～1.5kb)的克隆。这些克隆中的其中一个的双脱氧分析法测序得到了如图4F所示的寡核苷酸序列。由此序列来的翻译产物产生具有框内起始密码子甲硫氨酸、信号肽及成熟的胎盘二库宁肽序列。成熟的胎盘二库宁肽序列与衍生自EST共有序列的翻译的成熟蛋白质序列是相同的，虽然信号肽序列的长度和序列不同。与PCR衍生物不同，由克隆杂交衍生的cDNA含有整个胞外结构域、穿膜结构域、胞质结构域及框内终止密码子。实际上，这个克隆一直延伸到了多聚A尾部。起始密码子甲硫氨酸后的疏水信号肽与PCR衍生克隆的信号肽是相同的。所以我们从Sf9细胞中表达并纯化了胎盘二库宁肽的可溶片段-二库宁肽(1-170)，还发现它是有功能的蛋白酶抑制剂(实施例10)。而且，我们从人胎盘中分离的胎盘二库宁肽的可溶性片段也是有活性的蛋白酶抑制剂(实施例7)。天然蛋白质及Sf9细胞表达的蛋白质形式，根据N-末端测序(实施例7和9)中的PTH-氨基酸回收(recoveries)，在第30位置上的天冬氨酸残基处可能被糖基化了。
根据这些现象，似乎全长胎盘二库宁肽具有同时作为细胞膜表面穿膜蛋白质和可溶性蛋白质的能力。已知其它含有Kunitz结构域的穿膜蛋白质经历蛋白酶解加工产生具有可溶及膜联形式的混合物。这些包括两种形式的淀粉样蛋白前体，被称之为APP 751(Esch F.等(1990)Science，2481122-1124)及APP 770(Wang R等，(1991)J.Biol Chem，26616960-16964)。
接触活化是一种通过损伤血管表面暴露于凝结级联的组分而被活化的过程。血管发生是一种涉及到内皮表面纤溶酶局部活化的过程。胎盘二库宁肽的特异性及其锚定到细胞表面的假定的能力暗示穿膜胎盘二库宁肽的生理学功能可能包括对接触活化和血管发生的调节。
胎盘二库宁肽(7-64)、二库宁肽(102-159)以及全长胎盘二库宁肽(图4F)的氨基酸序列用遗传学计算机集团程序(Genetics Computer GroupProgram)Fast A在PIR(版本46.0)和Patch X(版本46.0)蛋白质数据库以及Geneseq(版本20.00)蛋白质数据库中的专利序列中查找。用遗传学计算机集团程序TFastA(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448)对GenBank(版本92.0，96年1月26日更新)和EMBL(改进版本45.0)核苷酸数据库的6种形式的翻译，以及GeneSeq(版本20.0)核苷酸数据库的专利序列对同样的蛋白质序列进行了查找。在这一系列查找中并未包括GenBank和EMBL的EST和STS子集。从这些查找中所得的最符合的结果其全长也仅仅含有与衍生自我们所分析的R74593和R35464克隆的58个氨基酸的蛋白质序列的50％相同的序列。人二库宁肽的分离如上所述，由翻译二库宁肽(图3)的共有序列确定的相应于二库宁肽(7-64)和二库宁肽(102-159)的合成肽可折叠(实施例2及1，分别地)产生活化的激肽释放酶抑制剂蛋白质(实施例4及3，分别地)。我们研究了这种意料之外的特性以设计纯化途径来从人组织中分离天然胎盘二库宁肽。
第一步，使用激肽释放酶-琼脂糖亲和色谱作为纯化步骤，分离到高度纯化的天然的有功能的激肽释放酶抑制剂。分离到的天然人二库宁肽具有与所预测的共有核酸序列翻译的氨基酸残基+1到+50(实施例7)相同的N末端(测序了50个氨基酸残基。这第一次证实了分离自人胎盘的新的天然激肽释放酶抑制剂的存在。
已知的类Kunitz结构域列表如下。据信与靶蛋白酶接触的残基为了特定目的重点标出(粗体/下划线)。这些特殊的残基为了如下Xaa标记的特殊参照而被命名为位置Xaa1-16Xaa1 1 111 111 2 3 456789 0 1 234 561) IHDFCLVSKVV GRCRASMPRW WYNVTDGSCO LFVYGGCDGN SNNYLTKEEC LKKCATV2) YEEYCTANAVT GPCRASPPRW YFDVERNSCN NFIYGGCRGN KNSYRSEEAC MLRCFRQ3) -HSFCAFKADD GPCKAIMKRF FFNIFTRQCE EFIYGGCEGN QNRFESLEEC KKMCTRD4) -PDFCFLEEDP GICRGYITRY FYNNQTKQCE RFKYGGCLGN MNNFETLEEC KNICEDG5) -PSWCLTPADR GLCRANENRF YYNSVIGKCR PFKYSGCGGN ENNFTSKQEC LRACKKG6) -AEICLLPLDY GPCRALLLRY YYRYRTQSCR QFLYGGCEGN ANNFYTWEAC DDACWRI7) -PSFCYSPKDE GLCSANVTRY YFNPRYRTCD AFTYTGCGGN DNNFVSREDC KRACAKA8) -KAVCSQEAMT GPCRAVMPRT TFDLSKGKCV RFITGGCGGN RNNFESEDYC MAVCKAM9) RPDFCLEPPYT GPCKARIIRY FYNAKAGLCQ TFVYGGCRAK RNNFKSAEDC MRTCCGA10)----CQLGYSA GPCMGMTSRY FYNGTSMACE TFQYGGCMGN GNNFVTEKEC LQTC11) VAACNLPIVR GPCRAFIQLW AFDAVKGKCV LFPYGGCQGN GNKFYSEKEC REYCCVP12)-EVCCSEQAET GPCRAMISRW YFDVTEGKCA PFPYGGCGGN RNNFDTEEYC MAVCGSA13)----CKLPKDE GTCRDPILKW YYDPNTKSCA RFWYGGCGGN ENFFGSQKEC EKVC14)-PNVCAFPMEK GPCQTYMTRW FFNFETGECE LFAYGGCGGN SNNFLRKEKC EKFCKFT
其中序列号1)是二库宁肽(7-64)(SEQ ID NO4)；序列号2)是二库宁肽(102-159)(SEQ ID NO6)；序列号3)是组织因子途径抑制剂前体1(SEQID NO18)；序列号4)是组织因子途径抑制剂前体1(SEQ ID NO19)；序列号5)是组织因子途径抑制剂前体(SEQ ID NO20)；序列6)是组织因子途径抑制前体2(SEQ ID NO21)；序列7是组织因子途径抑制前体2(SEQ IDNO22)；序列8是淀粉样前体蛋白质同源物(SEQ ID NO23)；序列9)是抑蛋白酶肽(SEQ ID NO24)；序列10)是间-α-胰蛋白酶抑制剂前体(SEQ ID NOs25)；序列11是间-α-胰蛋白酶抑制剂前体(SEQ ID NOs26)；序列12)是淀粉样前体蛋白质(SEQ ID NO27)；序列13)是胶原α-3(VI)前体(SEQ ID NO28)；以及序列14)是HKI-B9(SEQ ID NO29)。
可以看出胎盘二库宁肽(7-64)和(102-159)都具有同样数目和间隔的半胱氨酸残基，如Kunitz族的丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员中所看到的一样。已知半胱氨酸形成3个链内二硫键的精确成键并且对先前已知的所有Kunitz族的成员都是不变的(Laskowski，M等，1980，Ann.Rev.Biochem.49593-626)。根据这种已知成键方式以及胎盘二库宁肽(7-64)和(102-159)折叠成活性蛋白酶抑制剂要伴随与三个链内二硫键形成一致的质量减少的事实(实施例2和1)，很有可能胎盘二库宁肽的Kunitz结构域内的二硫键形成是发生在下列半胱氨酸残基之间C11和C61；C20和C44；C36和C57；C106和C156；C115和C139；C131和C152。而且，这种二硫键成键形式在更大型的含有两个Kunitz结构域的胎盘二库宁肽中更具高度可能性的，这是因为这种形式的蛋白质也是活化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且因为通过50个循环对天然胎盘二库宁肽的N端测序(实施例7)使得在期望有半胱氨酸出现的位置上产生沉默的序列。
本发明的胎盘二库宁肽、分离的结构域或其它变体可以利用t-Boc化学法通过标准固相肽合成产生，或F-moc化学法产生，t-Boc化学法描述于Merrified R.B.及Barany G.的“肽、分析、合成、生物学2”，Gross E等编Academic Press(1980)第一章中；F-moc化学法描述于Carpino L.A.及Han G.Y.(1970)J.Amer Chem Soc.92，5748-5749中，并在实施例2中有说明。可替代地，编码胎盘二库宁肽的DNA的表达可用于产生重组胎盘二库宁肽变体。
本发明还涉及编码本发明的胎盘二库宁肽蛋白质变体的DNA构建体。这些构建体可通过例如Beaucage S.L.及Caruthers M.H.(1981)Tetrahedron Lett，22，第1859-1862页；Matleucci M.D.及Caruthers M.H.(1981)，J.Am.Chem.Soc.103，第3185页所描述的合成方法制备，或者通过用设计用来与编码胎盘二库宁肽的DNA序列杂交的探针筛选基因组或cDNA文库得到的基因组或cDNA序列制备。基因组或cDNA序列在一个或多个位置上可被修饰以得到编码本公开所描述的氨基酸取代或缺失的cDNA。
本发明还涉及含有编码本发明的胎盘二库宁肽、分离的结构域或其它变体的DNA重组体能用于产生重组胎盘二库宁肽变体的表达载体。该cDNA应该与合适的启动子序列相连，该启动子在所选择的宿主细胞中显示转录活性、具有适当的终止子及多聚腺苷酸化信号。编码胎盘二库宁肽变体的cDNA可与引起被该cDNA编码的被分泌的蛋白质的5′信号肽融合。信号肽可以是一种被宿主有机体识别的信号肽。在哺乳动物宿主细胞的情况下，信号肽也可以是全长胎盘二库宁肽中存在的天然信号肽。制备这种用于表达胎盘二库宁肽的载体的方法是本领域熟知的，而且例如在Sambrook等的MolecularCloningA Lboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，(1989)。
本发明还涉及可用来产生重组胎盘二库宁肽变体的含有编码本发明的胎盘二库宁肽、分离的结构域或其它变体的DNA重组体的转化细胞。可用于产生胎盘二库宁肽变体的表达载体和宿主有机体的组合是很多的。适当的宿主细胞包括用杆状病毒感染的Sf6昆虫细胞，哺乳动物细胞例如BHK、CHO、Hela及C-127，细菌例如E.Coli以及酵母菌例如酿酒酵母。需要表达胎盘二库宁肽的哺乳动物、昆虫和微生物表达系统的使用方法是本领域熟知的，而且已被描述，例如在Ausubel F.M等，现代分子生物学技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons(1995)，第16章中。对含有单个Kunitz抑制剂结构域例如二库宁肽(7-64)及(102-159)的胎盘二库宁肽片断而言，优选的是酵母和E.Coli表达系统，最优选的是酵母表达系统。典型地，可如美国专利5,164,482的用于抑蛋白酶肽变体的描述来进行酵母表达并适应本说明书的用于胎盘二库宁肽(102-159)的实施例5。用美国专利5,032,573所描述的方法可进行E.Coli表达。对含有两个抑制剂结构域的更大的胎盘二库宁肽变体例如变体二库宁肽(7-159)而言，用哺乳动物及酵母系统是最优选的。
编码具有天然氨基序列的取代氨基酸的胎盘二库宁肽变体的DNA可用Kunkel T.A.(1985)Proc.Natl.Acad Sci USA 82488-492所描述的用于表达重组蛋白质的方法制备。简单而言，把要诱变的DNA克隆到单链的噬菌体载体例如M13中。延伸到要被改变的区域并编码取代的寡核苷酸与单链DNA杂交，用常规的分子生物学方法制备双链。然后把此DNA转化到适当的细菌宿主中，并用双脱氧测序验证。把正确的DNA克隆到表达质粒中。可替代地，可用常规PCR技术诱变靶DNA，并测序，然后插入到适当的表达质粒中。
后面的具体实施例是为了描述而提供，而不是对本发明的特定方面和优选实施方式的限制。实施例1合成胎盘二库宁肽(102-159)的制备材料和方法/所用试剂。荧光底物Tos-Gly-Pro-Lys-AMC购自Bachem BioScience Inc(King of Prussia，PA)。PNGB、Pro-Phe-Arg-AMC、Ala-Ala-Pro-Met-AMC、牛胰蛋白酶(III型)、人血浆激肽释放酶以及人纤溶酶来自于Sigma(St.Louis，MO)。
重组抑蛋白酶肽(Trasylol)购自Bayer AG(Wuppertal，Germany)。预置GlnWang树脂购自Novabiochem(La Jolla，CA)。苯甲硫醚、乙二硫酚(ethanedithiol)及叔丁基甲基醚购自Aldrich(Milwaukee，WI)。功能性胎盘二库宁肽(7-64)及(102-159)的定量在纯化各阶段中再折叠样品出现的胰蛋白酶抑制活性的量以GPK-AMC为底物来测定。把牛胰蛋白酶(200皮摩尔)与来自不同纯化阶段的二库宁肽(7-64)或(102-159)在缓冲液A(50mM，Hepes，pH7.5，0.1M NaCl，2mM CaCl2和0.01％triton X-100)中37℃温育5分钟。加入GPK-AMC(终浓度20μM)，通过在Perikin-Elmer LS-50B荧光计上测量荧光(ex＝370nm，em＝432nm)来确定所产生的香豆素的量。根据方程式1计算每个所测样品的抑制百分数；其中R0是在抑制剂存在下的荧光增加率，R1是在没有加样品情况下所确定的率。抑制剂的活性单位定义为上述实验条件下的实验中获得50％的抑制所需的量。
抑制百分数＝100×[1-R0/R1](1)合成。用NMP-HBTU Fmoc化学法在Applied Biosystems 420A型肽合成仪上合成胎盘二库宁肽(102-159)。对每个偶联用过量8倍的氨基酸在预置Gln树脂上合成肽。在室温下用84.6％的三氟乙酸(TFA)、4.4％的苯硫醚甲、2.2％的乙二硫酚、4.4％的液化苯酚以及4.4％的水处理两小时来完成裂解和去保护。粗肽经沉淀、离心并用叔丁基甲基醚洗涤两次。用TFA/乙腈梯度在Dynamax 60AC18反相HPLC柱上纯化肽。终产物(61.0mg)产生了正确的氨基酸组合及分子量，通过Electrospray质谱(MH+＝6836.1；Calcd＝6835.5)测定预测的序列YEEYCTANAV TGPCRASFPP WYFDVERNSC NNFIYGGCRG NKNSYRSEEACMLRCFRG (SEQ ID NO6)纯化。按照Tam等人(J.Am.Chem.Soc.1991，1136657-62)的方法进行胎盘二库宁肽(102-159)的再折叠。一部分纯化的肽(15.2mg)溶于4.0ml的0.1M Tris，pH6.0和8M尿素中。二硫键的氧化通过滴加含有23％DMSO、及pH6.0的0.1M Tris的溶液以达到终浓度为0.5mg/ml肽在20％DMSO、pH6.0的0.1M Tris和1M尿素中来完成。溶液在25℃搅拌24小时，然后用含50mMTris、pH8.0及0.1M的NaCl的缓冲液稀释1∶10。根据厂商建议，把30毫克的牛胰激肽释放酶(Bayer AG)共价结合到3.5毫升的CNBr活化Sapharose(Pharmacia)上制成激肽释放酶亲和柱来纯化该物质。再折叠的物质置于亲和柱上，用流速为1毫升/分钟的50mM Tris，pH8.0，及0.1MNaCl洗涤至在280纳米洗涤不能检测到吸收为止。该柱分别用3倍体积的pH4.0和1.7的0.2M乙酸洗脱。聚集活性成分(如下所示)并把溶液的pH调到2.5。该物质直接置于Vydac C18反相柱(5微米，0.46×25厘米)上，该柱已用在0.1％TFA中的22.5％乙腈平衡。在40分钟以上的时间内以1.0毫升/分的0.1％TFA中的从22.5到40％的乙腈线性梯度完成分离。聚集活性部分，冻干，重新溶于0.1％TFA中，在-20℃保存待用。
结果。如上所述用20％的DMSO为氧化剂对合成胎盘二库宁肽(102159)进行再折叠，用如下所示的两步纯化法纯化，以得到有活性的胰蛋白酶抑制剂(下表1)。表1分离合成的胎盘二库宁肽(102-159)的纯化表表1纯化步骤 体积 毫克/毫克单位cSpA 产率(毫升) 毫升 (U)(U/毫克)8.0M尿素 4.0 3.75a15.0 0 0 -20％DMSO 32.0 0.47a15.0 16,162 1,078 100激肽释放酶亲和性 9.8 0.009b0.09 15,700 170,000 97C183.0 0.013ab0.04 11,964 300,000 74a由AAA确定的蛋白质。b由淬灭相关系数(extinction coefficient)确定的纯化蛋白质(1.7×104升摩尔1厘米-1)的OD 280纳米确定的蛋白质。c一个单位被定义为在常规实验中抑制50％胰蛋白酶活性所需的物质。
在固定的牛胰激肽释放酶柱上的层折粗制的再折叠材料选择性地分离到了6.0％的蛋白质并表现了97％的胰蛋白酶抑制活性。随后的利用C18反相色谱产生了进一步的2次纯化，总体回收率为74％。在RPHPLC上，还原和再折叠的胎盘二库宁肽(102-159)分别表现出26.3和20.1分钟的洗脱时间。该纯化物质的质谱分析揭示其分子量为6829.8，与起始物质相比有6个质量单位的损失。这证明了所预期的肽序列的3个二硫键的完全形成。
结合PI标准，用预制AmpholinePAGplate(pH3.5到9.5)，根据产商建议使用Multiphor II Electrophoresis系统电泳并聚焦1.5小时来确定纯化的再折叠的合成胎盘二库宁肽(102-159)的等电点。染色后测定从胶的阴极边缘到不同蛋白质带的迁移距离。通过由迁移距离标准及其相应PI所得的曲线产生的标准曲线确定每一个未知的PI。使用该方法，胎盘二库宁肽(102-159)的PI被确定为8.3，与由氨基酸序列所预测的值吻合。这比由PI确定的抑蛋白酶肽的10.5的值(Tenstad等，1994，Acta Physiol.Scand.15233-50)要低。实施例2合成胎盘二库宁肽(7-64)的制备基本上按照所描述的胎盘二库宁肽(102-159)所用的方法对胎盘二库宁肽(7-64)进行合成、再折叠和纯化，但有下述修改折叠时以在20％DMSO中的溶液形式在25℃下搅拌该合成肽30小时；以40分钟以上的时间用0.1％的TFA中的25到45％的乙腈线性梯度完成C18 RP-HPLC纯化。从第一次C18收集的活性成分重新置于柱上，并用0.1％TFA中的20到40％的线性梯度(60分钟，1毫升/分钟)分馏。
结果。最终获得的纯化的还原肽表现MH+＝6563，与下述序列一致IHDFCLVSKV VGRCRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEECLKKCATV (SEQ ID NO4)再折叠和纯化产生了一个具有胰蛋白酶抑制剂活性的有功能的Kunitz结构域(如下表2)表2A分离合成的胎盘二库宁肽(7-64)的纯化表纯化步骤 体积 毫克/毫克单位 SpA 产率(毫升) 毫升 (U)(U/毫克)8.0M尿素 8.0 2.5 20.00 0-20％DMSO 64.00.31 20.068,6993,435100激肽释放酶(Kall) 11.70.10 1.1643,33336,110 62亲和率pH4.0激肽释放酶(Kall) 9.0 0.64 5.8 4972 857 7.2亲和率pH1.7C18-1 4.6 0.14 0.0621,905350,143 31.9C18-2 1.0 0.08 0.027,937 466,882 11.5纯化的再折叠蛋白质表现MH+＝6558，也就是说比还原肽少5±1个质量单位。这证实了再折叠导致了至少一个适当的二硫键的形式。
用测定胎盘二库宁肽(102-158)的PI方法来测定胎盘二库宁肽(7-64)的PI。胎盘二库宁肽(7-64)表现出的PI比预期的值(PI＝7.9)要高的多。再折叠的胎盘二库宁肽(7-64)迁移到胶(pH9.5)的阴极边缘，在这些条件下，其PI值不能被精确测定。合成胎盘二库宁肽(7-64)的后续制备。
因为在纯化和再折叠之前，合成胎盘二库宁肽可能未经历完全的去保护，用确定要完全去保护的蛋白质来重复再折叠。胎盘二库宁肽(7-64)的合成、再折叠和纯化与胎盘二库宁肽(102-159)所用的方法基本一致，但有以下修改在再折叠中，把以20％DMSO溶液形式的合成肽(0.27毫克/毫升)在25℃搅拌30小时；以超过40分钟的时间用在0.1％TFA中的乙腈的22.5到50％的线性梯度完成C18 RP-HPLC纯化。
结果。最终得到的纯化的还原肽表现出MH+＝6567.5，与下述序列吻合IHDFCLVSKV VGRCRASMPRW WYNVTDGSC QLFVYGGCDGNSNNYLTKEE CLKKCATV(SEQ ID NO4)折叠和纯化产生一个具有胰蛋白抑制剂活性的有功能的Kunitz结构域(如下表2B所示)。表2B分离合成胎盘二库宁肽(7-64)的纯化表表2B纯化步骤 体积毫克/毫克 单位(U)SpA 产率(毫升) 毫升 (U/毫克)8.0M尿素 4.9 2.1 10.5 00 -20％DMSO 39.00.27 10.5 236,000 22,500 100激肽释放酶亲和 14.50.3 0.43 120,000 279,070 50.9率(pH2)C18反相0.2 1.2 0.24 70,676 294,483 30.0纯化的折叠蛋白质表现MH+＝6561.2，也就是说它比还原肽少6.3个质量单位。这表明折叠引起了所预期的二硫键的形成。
利用测定胎盘二库宁肽(102-159)的PI方法测定再折叠的胎盘二库宁肽(7-64)的PI。再折叠的胎盘二库宁肽(7-64)表现出的PI为8.85，稍高于预测值(PI＝7.9)。实施例3功能性胎盘二库宁肽片断(102-159)的体内特异性蛋白酶。牛胰蛋白酶、人胰蛋白酶以及牛胰激肽释放酶的定量通过活性位点滴定法(active site titration)进行，滴定按以前所描述的(Chase，T.及Shaw，E.(1970)Methods Enzmol.，1920-27)方法使用P-硝基苯-P′-胍基苯甲酸酯HCl。人激肽释放酶通过活性位点滴定法确定，滴定中以牛抑蛋白酶肽作标准，PFR-AMC作底物并假定形成1∶1的复合物。胰蛋白酶和纤溶酶在该条件下对GPK-AMC的Km分别是29μM和726μM；人血浆激肽释放酶和牛胰激肽释放酶对PFR-AMC的Km分别是457μM和81.5μM；弹性蛋白酶对AAPR-AMC的Km是1600μM。人组织激肽释放酶(Bayer，德国)的定量用先前描述的通过用P硝基苯基P’-胍基苯甲酸酯HCL的活性位点滴定法进行(Chare，T.，和Show，E.(1970)Methods Enzmol.1920-27)。
抑制动力学把50PM胰蛋白酶和胎盘二库宁肽(102-159)(0-2nM)或抑蛋白酶肽(0-3nM)在缓冲液A中以总体积1.0微升温育测定胎盘二库宁肽(102-159)或抑蛋白酶肽对胰蛋白酶的抑制。37℃5分钟后，加入15微升2mM GPK-AMC的并监测荧光的变化(如上)。胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽对人纤溶酶的抑制用纤溶酶(50pM)与胎盘二库宁肽(102-159)(0-10nM)和抑蛋白酶肽(0-4nM)在含50mM Tris-Hd(pH7.5)、0.1MNaCl和0.02％tritonX-100的缓冲液中测定。5分钟后，在37℃下温育，加入25微升20mM的GPK-AMC并监测荧光的变化。人血浆激肽释放酶被胎盘二库宁肽(102-159)或抑蛋白酶肽的抑制用激肽释放酶(2.5nM)及胎盘二库宁肽(102-159)0-3nM或抑蛋白酶肽(2.5nM)在50mM Tris-Hd(pH8.0)，50mM NaCl及0.02％triton X-100中测定。5分钟以后，在37℃加入15微升的20mM PFR-AMC并监测荧光值的变化。胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽对牛胰激肽释放酶的抑制以类似于激肽释放酶(92pM)，胎盘二库宁肽(102-159)(0-1.6nM)和抑蛋白酶肽(0-14PM)的方式测定，并且底物终浓度为100μM。用非线性回归数据分析程序Enzfitter软件(Biosoft，Cambridge，英国)确定表观抑制常数Ki*以紧密结合抑制剂的方程分析每个实验的动力学数据Vi/Vo＝1-(Eo+Io+Ki*-[(Eo+Io+Ki*)2-4EoIo)]1/2)/2Eo(2)其中Vi/Vo是相对酶活性(被抑制的对未抑制的比率)，Eo和Lo分别是酶和抑制剂的浓度，Ki值根据下面的方程修正底物效应后得到Ki＝Ki*/(1+[So]/Km)(3)(Boudier，C.及Bieth，J.G.(1989)Biochim Biophys Acta.，99536-41)关于胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽对人嗜中性弹性蛋白酶的抑制，把弹性蛋白酶(19nM)与胎盘二库宁肽(102-159)(150nM)或抑蛋白酶肽(0-7.5μM)在含0.1M Tris-HCl(pH8.0)和0.05％Triton X-100的缓冲液中温育。37℃5分钟后，加入AAPM-AMC(500μM或1000μM)并超过两分钟的时间测定荧光。以在两种不同底物浓度下的1/V对[I]的狄克逊标绘(Dixon plot)确定Ki值(Dixon等，1979)。
抑蛋白酶肽、胎盘二库宁肽片断(7-64)或胎盘二库宁肽片断(102-159)对人组织激肽释放酶的抑制的测定是通过把0.35nM的人组织激肽释放酶在含有50mM Tris-HCl缓冲液pH9.0，50mM NaCl及0.1％TritonX-100的1毫升反应体积中与胎盘二库宁肽(7-64)(0-40nM)或胎盘二库宁肽(102-159)(0-2.5nM)，或抑蛋白酶肽(0-0.5nM)温育进行的。5分钟后，在37℃，加入5微升的2mM PFR-AMC以达到10μM的终浓度并监测荧光的变化。在这种测定条件下人组织激肽释放酶对PFR-AMC的Km值是5.7μM。合成胎盘二库宁肽(102-159)、重组胎盘二库宁肽及抑蛋白酶肽对人因子Xa(American Diagnostica，Inc，Greenwich，CT)的抑制的测定按下面方法进行在含有20mM Tris(pH 7.5)，0.1M NaCl，以及0.1％BSA的缓冲液中把0.87nM的人因子Xa与量在增加的抑制剂温育。37℃5分钟后，加入30μl 20mM的LGR-AMC(Sigma)，并监测荧光变化。Kunitz抑制剂对人尿激酶的抑制的测定通过把尿激酶(2.7ng)与抑制剂在总体积为1毫升的含有50Mm Tris-HCl(pH8.0)、50mM NaCl和0.1 TritonX-100的缓冲液中温育进行。37℃5分钟后，加入35微升的20mM GGR-AMC(Sigma)并监测荧光的变化。对因子XIa(购自Enzyme Research Labs，Southben，IN)的抑制通过把因子XIa(0.1nM)与0到800nM的胎盘二库宁肽(7-64)，0到140nM胎盘二库宁肽(102-159)或者0到40nM抑蛋白酶肽在含有50mM Hepes pH7.5，100mM NaCl，2mM CaCl2，0.01％TritonX-100和1％BSA的总体积为1毫升的缓冲液中温育进行。37℃5分钟后，加入40mM Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC(Bachem Biosciences，King of Prussia，PA)，并监测荧光变化。
结果。通过在相同条件下测定其对各种蛋白酶的抑制常数来进行胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽抑制特性的直接比较。Ki值在下面表3中列出。表3二库宁肽(102-159)对各种蛋白酶抑制的Ki值表3蛋白酶(浓度)二库宁肽 抑蛋白底物(浓度) Km(102-159)酶肽 (mM)Ki(nM) Ki(nM)胰蛋白酶(48.5pM) 0.4 0.8 GPK-AMC(0.03mM)0.022胰凝乳蛋白酶(5nM) 0.24 0.86 AAPF-pNA(0.08mM) 0.027牛胰激肽释放酶0.4 0.02 PFR-AMC(0.1mM) 0.08(92.0pM)人血浆激肽释放酶 0.3 19.0 PFR-AMC(0.3mM) 0.46(2.5nM)人纤溶酶(50pM)1.8 1.3 GPK-AMC(0.5mM) 0.73人嗜中性弹性蛋白 323.08500.0 AAPM-AMC(1.0μM) 1.6酶(19nM)因子XIIa ＞300.0 12,000.0 PFR-AMC(0.2μM)0.35人组织激肽释放酶 0.13 0.004PFR-AMC(10μM) 0.0057(0.35nM)因子Xa(0.87nM)274 N.I. LGR-AMC(0.6mM) N.D.在3μM尿激酶110004500 GGR-AMC(0.7mM) N.D.因子XIa(0.1nM)15 288 E(OBz)AR-MC(0.4mM) 0.46在所用条件下，胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽对牛胰蛋白酶和人纤溶酶的抑制达到一种可比较的(类似的)程度。抑蛋白酶肽抑制弹性蛋白酶的Ki是8.5μM。胎盘二库宁肽(102-159)抑制弹性蛋白酶的Ki是323nM。胎盘二库宁肽(102-159)抑制牛胰激肽释放酶的Ki值比抑蛋白酶肽的Ki值高20倍。相反地，胎盘二库宁肽(102-159)是人血浆激肽释放酶的一种比抑蛋白酶肽更有效的抑制剂，其结合的亲和性高56倍。
作为激肽释放酶的抑制剂，胎盘二库宁肽(102-159)有效性比Trasylol要高超过50倍，由于这一点，要维持有效的抑制剂KIU患者剂量，只需要使用比Trasylol更少量的人胎盘二库宁肽或其片断(即胎盘二库宁肽(102-159))。这减少了每份剂量药物的花费，并减少了患者因重新接触药物而引起的有害的肾毒性效应发生的可能性。而且，由于该蛋白质来源于人，因此它比来源于牛的抑蛋白酶肽在人上的免疫原性更少。这也使得它在患者再接触该药剂时引起有害免疫原反应的风险大大降低。实施例4功能性胎盘二库宁肽片段(7-64)的体外特异性。
用上面实施例所描述的材料和方法测定功能性人胎盘二库宁肽(7-64)的体外特异性。
结果下面的表表明了胎盘二库宁肽(7-64)在体外作为各种丝氨酸蛋白酶的抑制剂的有效性。所列出的数据与来自用胎盘二库宁肽(102-159)和抑蛋白酶肽(Tasylol)作筛选抑制的数据进行了比较。表4A二库宁肽(7-64)对各种蛋白酶抑制的Ki值表4A蛋白酶(浓度) 二库宁肽 抑蛋白酶 二库宁肽(102-159)(7-64)Ki(nM)肽Ki(nM)Ki(nM)胰蛋白酶(48.5pM)0.17 0.8 0.4牛胰激肽释放酶(92.0pM) 0.4 0.020.4人血浆激肽释放酶(2.5nM) 2.4 19.00.3人纤溶酶(50pM) 3.1 1.3 1.8牛胰凝乳蛋白酶(5nM) 0.6 0.9 0.2因子XIIa＞30012000 ＞300弹性蛋白酶 ＞1008500323结果表明编码胎盘二库宁肽(7-64)的氨基酸序列可再折叠成有活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂至少对四种类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶有效。
下面的表4B也表明了再折叠的胎盘二库宁肽(7-64)作为体外各种丝氨酸蛋白酶抑制剂的有效性。再折叠的胎盘二库宁肽(7-64)是在纯化和再折叠之前从确定要完全去保护的蛋白质制备而来。所列出的数据与来自用胎盘二库宁肽(102-159)或抑蛋白酶肽(Trasylol)作筛选抑制的数据进行了比较。表4B再折叠二库宁肽(7-64)对各种蛋白酶抑制的Ki值表4B蛋白酶(浓度) 二库宁肽 抑蛋白酶 二库宁肽(102-159)(7-64)Ki(nM) 肽Ki(nM)Ki(nM)胰蛋白酶(50pM) 0.20.8 0.3人血浆激肽释放酶(0.2nM) 0.719.00.7人纤溶酶(50pM) 3.71.3 1.8因子XIIa 未做 12,000 4,500因子XIa(0.1nM) 200288 15人细织激肽释放酶 2.30.004 0.13意外地，胎盘二库宁肽(7-64)在抑制人血浆激肽释放酶时比抑蛋白酶肽更有效，而且作为纤溶酶抑制剂时在有效性上至少是相似的。这些数据表明胎盘二库宁肽在体外实验中与抑蛋白酶肽至少是同样有效的，而且可以预期在体内它应该具有更好或相似的能力。实施例5胎盘二库宁肽变体(102-159)在酵母中的表达编码胎盘二库宁肽102-159(SEQ ID NO6)的DNA序列用合成寡核苷酸产生。DNA终产物(5′到3′)由来自酵母α-交配因子前肽序列的15个核苷酸组成，该序列与编码胎盘二库宁肽(102-159)的框内cDNA序列融合，后接一个框内终止密码子。在克隆到酵母表达载体pS604时，该cDNA能指导含有融合到胎盘二库宁肽(102-159)的58个氨基酸序列上的N端酵母α-交配因子前肽的融合蛋白质的表达。设计位于α-交配因子和Kunitz结构域结合处的KEX-2裂解位点处的融合蛋白质的加工，以使Kunitz结构域在其天然N端释放。
合成含有下列序列以及用于克隆的HindIII位点的5′有义寡核苷酸。
GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA TAT GAA GAA TAC TGCACC GCC AAC GCA GTC ACT GGG CCT TGC CGT GCA TCC TTC CCACGC TGG TAC TTT GAC GTG GAG AGG(SEQ ID NO42)合成含有用于克隆的BamHI位点和终止密码子并具有下述序列的3′反义寡核苷酸CGC GGA TCC CTA CTG GCG GAA GCA GCG GAG CAT GCA GGC CTCCTC AGA GCG GTA GCT GTT CTT ATT GCC CCG GCA GCC TCC ATAGAT GAA GTT ATT GCA GGA GTT CCT CTC CAC GTC AAA GTA CCAGCG(SEQ ID NO43)把寡核苷酸溶于含有1mM EDTA的pH8.0的10mMT Tris缓冲液中，加入12微克的每种寡核苷酸，合起来加到0.25M NaCl中。为了杂交，把寡核苷酸煮沸5分钟以使变性，并在2个小时的时间内从65℃冷却到室温。重叠序列用Klenow片段延伸，用HindIII和BamHI消化。所得的消化双链片段克隆到PUC 19中，并经测序证实。含有正确序列片断的克隆用BamHI/HindIII消化以释放含有具下列+链序列的片段的二库宁肽GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA TAT GAA GAA TAC TGC ACCGCC AAC GCA GTC ACT GGG CCT TGC CGT GCA TCC TTC CCA CGCTGG TAC TTT GAC GTG GAG AGG AAC TCC TGC AAT AAC TTC ATCTAT GGA GGC TGC CGG GGC AAT AAG AAC AGC TAC CGC TCT GAGGAG GCC TGC ATG CTC CGC TGC TTC CGC CAG TAG GGA TCC SEQID.44)然后，其用凝胶纯化并连接到BamHI/HindIII酶切的pS604中。连接混合物用苯酚/氯仿提取，并用一个S-200微自旋柱(minispin column)纯化。将该连接产物转导到酵母菌株SC 101和WHL 341中，并涂于ura选择平板上。来自每个菌株的12个克隆重新划线ura脱落(drop out)的平板上。把单克隆接种到2毫升的ura DO培养基并30℃过夜生长。细胞以14000×g 2分钟沉淀，并评定其上清中胎盘二库宁肽(102-159)的含量。胎盘二库宁肽(102-159)在转化酵母中表达的检测首先，利用实施例1(1毫升测试体积)描述的方法确定上清(每个测试50微升)抑制胰蛋白酶体外活性的能力。阴性对照使用表达抑蛋白酶肽无活性变体的酵母克隆和未使用过的培养基样品。表达天然抑蛋白酶肽的酵母克隆作为阳性对照并以对比的形式表示。
定量胎盘二库宁肽(102-159)表达的第二种方法开发了利用合成肽的多克隆抗体(pAbs)来监测利用Western印迹的重组肽的累积。这些研究仅仅对衍生自SC101的菌株进行，这是因为它们比衍生自WHL 341的重组体产生更强的抑制活性。
为了产生pAb，每天用0到250微克的纯化还原合成胎盘二库宁肽(102-159)以完全Freund佐剂的形式免疫两只6-8周龄的新西兰白雌兔(Hazelton Research Labs，Denuer，Pa)，然后在第14、35和56及77天每天用125微克不完全Freund佐剂形式的同样抗原加强。本研究中所使用的抗血清在第三次加强后用现成方法收集。用蛋白质A的抗血清纯化多克隆抗体。
来自于转化酵母SC 101(图8)的克隆2.4和2.5以及对照抑蛋白酶肽在30℃下50毫升ura DO培养基上过夜生长。沉淀细胞，并用Centriprep 3(Amicon，Beverly，MA)浓缩剂把上清浓缩100倍。利用厂商方法在10-20％麦黄酮缓冲胶(Novex，San Diego，CA)对每个样品(30μl)进行SDS-PAGE电泳。重复胶或者用银染试剂盒(Intergrated Separation Systems，Nantick，MA)显影或者转移到硝酸纤维滤膜上用合成二库宁肽(102-159)的纯化多克隆抗体显影。根据厂商建议，用碱性磷酸酶结合的山羊抗兔抗体用作二级抗体(Kirkegaardand Perry，Gaithersburg，MD)。从SC 101转化菌株中纯化胎盘二库宁肽(102-159)通过离心(4000g×30分)收获来自SC 101菌株2.4的1升培养物的发酵肉汤，然后加到1.0毫升柱的脱水的胰凝乳蛋白酶-Sepharose(TakaraBiochemical Inc.，CA)，该Sepharose预先用含有0.1M NaCl、2mM CaCl2和0.01％(v/v)triton X-100的50mM Hepes缓冲液平衡。用同样的但含有1.0M NaCl的缓冲液洗柱，直到A280纳米降到零，此时用pH2.5的0.1M甲酸洗脱柱。收集洗脱成分并置于一个C18柱(Vydac，5微米，4.6×250毫米)上，该柱预先用0.1％TFA平衡，然后用20到80％的在0.1％TFA中的乙腈线性梯度洗脱。收集含胎盘二库宁肽(102-159)的成分，并在C18上重新层析，层析使用0.1％TFA中的22.5到50％的乙腈梯度进行洗脱。
结果。图8表示胰蛋白酶的活性被衍生自每个SC 101和WHL 341菌株的转化的12个克隆所抑制的百分数。结果表明用胰蛋白酶抑制剂胎盘二库宁肽(102-159)转化的酵母菌株SC 101的所有12个克隆，与两个不表现对胰蛋白酶抑制的阴性对照相比，都有产生相当量胰蛋白酶抑制活性的能力。因此这种活性与胎盘二库宁肽变体(102-159)转化的细胞中特异抑制剂的表达有关。酵母WHL 341样品含有最少量的胰蛋白酶抑制活性。这可能与所观察到的该菌株在所用条件下的缓慢生长相关。
图9表明酵母SC 101菌株上清的SDS-PAGE和Western印迹。对衍生自表达胎盘二库宁肽(102-159)的重组酵母2.4和2.5的以及来自表达抑蛋白酶肽的酵母的上清的SDS-PAGE进行银染，结果产生的蛋白质带电泳到约6KDa的位置上，与所期望的每个重组Kunitz结构域的大小相吻合。Western印迹表明由菌株2.4和2.5表达的6KDa带与胎盘二库宁肽(102-159)的pAb反应。对照的在抑蛋白酶肽中的同样的6KDa的带不和同样的抗体进行反应，证明了该抗体对胎盘二库宁肽变体(102-159)的特异性。
胎盘二库宁肽C端结构域的终产物通过银染SDS-PAGE高度纯化(图10)。在终产物中肉汤-衍生的胰蛋白酶抑制活性的总体回收率是31％。纯化抑制剂的N端测序表明40％的蛋白质被正确加工成胎盘二库宁肽(102-159)的正确N端，然而60％的物质含有一部分酵母α-交配因子。纯化的物质含有一活化的丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂对血浆激肽释放酶体外抑制的表现Ki是0.35nM。
总体而言，蛋白酶抑制活性及蛋白质的积累免疫化学地与发酵汤中的合成二库宁肽(102-159)相关，而且从一个转化系分离胎盘二库宁肽(102-159)提供了此处描述的重组酵母中胎盘二库宁肽表达的证据，第一次表明应用酵母在生产胎盘二库宁肽片段中的应用。
制备额外的构建体以尽力来增加包含在胎盘二库宁肽102-159中的Kunitz结构域的表达水平，同时增加具有正确N端的蛋白质的生产。我们假定胎盘二库宁肽102-159的N端残基(YEEY--)可能具有一个裂解位点，该位点仅被酵母KEX-2蛋白酶很差地识别，该蛋白酶酶促除去酵母的α-因子前区。因此，我们制备酵母表达构建体用于生产胎盘二库宁肽103-159(EEY N端...)，101-159(NYEEY N端...)及98-159(DMFNYEEY...)以修饰KEX-2裂解位点周围的P′次级位点。为了尝试增加重组蛋白的表达水平。我们用酵母优选密码子，而不是哺乳动物优选密码子来制备下述的一些构建体。这些构建体基本上按照上述的胎盘二库宁肽102-159(称作构建体#1)的制备方法制备，但有下述修改组建体#2胎盘二库宁肽103-159，酵母密码子使用5′有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAGAAGAA TACTGTACTGCTAATGCTGT TACTGGTCCA TGTAGAGCTT CTTTTCCAAGATGGTACTTT GATGTTGAAA GA(SEQ ID NO55)而3′反义寡核苷酸ACTGGATCCT CATTGGCGAA AACATCTCAA CATACAGGCTTCTTCAGATC TGTAAGAATT TTTATTACCT CTACAACCACCGTAAATAAA ATTATTACAA GAATTTCTTT CAACATCAAAGTACC ATCT(SEQ ID NO56)用生产表达胎盘二库宁肽102-159的表达载体(上面的组建体#1)所述的方法制备。组建体#3胎盘二库宁肽101-159，酵母密码子使用5′有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAAATTAC GAAGAATACTGTACTGCTAA TGCTGTTACT GGTCCATGTA GAGCTTCTTTTCCAAGATGG TACTTTGATG TTGAAAGA(SEQ ID NO57)与组建体#2所用的相同的3′反义寡核苷酸用生产用于表达胎盘二库宁肽102-159的表达载体(上文的组建体#2)的方法制备。组建体#4胎盘二库宁肽98-159，酶母密码子使用5′有义寡核苷酸GAAGGGGTAA GCTTGGATAA AAGAGATATG TTTAATTACGAAGAATACTG TACTGCTAAT GCTGTTACTG GTCCATGTAGAGCTTCTTTTCCAAGATGGT ACTTTGATGTTGAAAGA(SEQ ID NO58)和与组建体#2中所用的相同3′反义寡核苷酸用生产表达组建体(上文的组建体#1)所述的方法制备。
把酵母菌株SC 101(MATα，ura 3-52，Suc 2)用含有每种上述cDNA的质粒转化，用以人密码子使用的生产胎盘二库宁肽102-159上述的方法表达蛋白质。收获约有250毫升的每种酵母培养物，从离心(15分×3000RPM)来的上清分别以如上所述的1毫长激肽释放酶-Sepharose纯化。测定applysate中胰蛋白酶的相对抑制量，回收到的纯化蛋白质的量以及纯化蛋白质的N端序列，并把数据列如下表7。表7含有胎盘二库宁肽C端Kunitz结构域的不同蛋白质的相对生产水平表7构建体 applysate中抑N端测序序列 备注制剂相对浓度 数量(pmol)#2 103-159 未检测到 无 无 未表达#3 101-159 25％抑制 无 无 低表达#4 98-159 93％抑制 910DMFNYE 良好表达正确产品-#1102-159 82％抑制 480AKEEGV 表达活性的- 未正确加工的蛋白质结果表明含有C端Kunitz结构域的不同长度的胎盘二库宁肽片断在表达有功能的分泌蛋白质时具有广泛的变异。表达101-159片段和103-159片断的组建体在纯化之前的上清中产生具有极少或低的活性，0.05毫升每种纯化片断的等分试样的N端测序产生不可检测量的抑制剂。另一方面，胎盘二库宁肽102-159或98-159的表达在纯化前产生数量可观的蛋白酶活性。然而，N端测序表明从表达102-159回收的纯化蛋白质大部分再一次被不正确加工，表明其N端与大部分前蛋白的酵母α-交配因子原序列内的位点上的加工是相吻合的。然而从表达胎盘二库宁肽98-159回收的纯化蛋白质全部在正确的位点上加工并产生正确的N端。而且，与胎盘二库宁肽102-159的回收相比，其回收的蛋白质量几乎是两倍。因此胎盘二库宁肽98-159表现出优选的片断长度，以通过啤酒八叠球菌(S.cerevisiae)的α-交配因子前原序列/KEX-2加工系统生产C端Kunitz结构域。实施例6用于酵母表达的可选方案衍生自R74593翻译产品的58个氨基酸的肽也可从在DNA测序后克隆在TA载体TM(Invitrogen，San Diego，CA)中的R87894-R74593 PCR产品PCR扩增而来，亦可从人胎盘cDNAPCR扩增而来。扩增的DNA产品由19个来自于酵母α-配合因子的引导序列的核苷酸组成，该引导序列与编码YEEY-CFRQ(58残基)的R74593序列配合以使翻译产品位于框内，组建成了一个α-配合因子/Kunitz结构域融合蛋白质。该蛋白质序列还含有一个Kex 2裂解，该裂解在其天然N端释放Kunitz结构域。
含有一个用于克隆的HindIII位点的5′有义寡核苷酸将含有下述序列GCCAAGCTTG GATAAAAGAT ATGAAGAAT ACTGCACCGC CAACGCA(SEQ ID NO30)含一个用于克隆的BamHI位点及终止密码子的3′反义寡核苷酸具有下述序列GGGGATCCTC ACTGCTGGCG GAAGCAGCGG AGCAT(SEQ ID NO31)用于克隆到酵母表达载体中的全长206个核苷酸的cDNA序列具有下述序列CCAAGCTTGG ATAAAAGATA TGAAGAATAC TGCACCGCCA ACGCAGTCACTGGGCCTTGC CGTGCATCCT TCCCACGCTG GTACTTTGAC GTGGAGAGGAACTCCTGCAA TAACTTCATC TATGGAGGCT GCCGGGGCAA TAAGAACAGCTACCGCTCTG AGGAGGCCTG CATGCTCCGC PGCTTCCGCC AGCAGTBAGCATCCCC(SEQ IB NO32)在PCR扩增之后，该DNA将用HindIII、BamHI消化的并克隆到也用HindIII和BamHI消化的酵母表达载体pMT15(参见美国专利5,164,482，在此处以参考文献被引见)。所得质粒载体用美国专利5,164,482所描述的方法转化SC 106菌株。在诱导条件下分离并培养URA 3+酵母转化体。重组胎盘二库宁肽变体的产率根据胰蛋白酶抑制活性的量来确定，该活性用上述的体外试验方法时随时间在培养上清中积累。发酵肉汤以9000rpm离心30分钟。然后上清用0.4其次用0.2微米的滤器过滤，稀释到其电导率为7.5ms，并用柠檬酸调节到pH3。样品批量吸收到200毫升S-Sepharose上快流(Pharmacia)，在50mM pH3的柠檬酸钠中并搅拌60分钟。凝胶随后经一系列洗涤各2升的50mM pH3.0柠檬酸钠；pH9.0的50mM Tris HCl；pH6.0的20mM HEPES。经洗涤的凝胶转移到合适的柱上并用0到1M的在pH6.0的20mM HEPES中的氯化钠的线性梯度洗脱。收集含有体外胰蛋白酶抑制活性的洗脱成分并进一步以下述两种方法纯化a)在固定了脱水的胰蛋白酶的柱上层析(基本上按实施例2所述)；b)在固定了牛激肽释放酶的柱上层析；或c)结合包括凝胶过滤和/或阴离子-交换层析传统的色层层析步骤。实施例7从胎盘中分离和表征天然人胎盘二库宁肽从完全的冰冻胎盘(Analytical Biological Services，Inc.，Wilmington，DE)纯化二库宁肽蛋白质至表观均质。胎盘(740克)融化至室温并切成0.5到1.0厘米大小的碎片，置于冰上并用600毫升的PBS缓冲液洗涤。并倾去洗涤液，并把240毫升的胎盘碎片置于Waring搅拌器上。加入300毫升含0.1MTris(pH8.0)和0.1M NaCl的缓冲液，混合物高速搅拌两分钟，倾入750.0毫升离心管中置于冰上。重复此过程至加工完所有物质。4℃下把混合组织浆液以4500×g离心60分钟。通过干酪包布过滤上清，用激肽释放酶亲和柱纯化胎盘二库宁肽，该亲和柱根据产商建议用70毫克牛胰激肽释放酶(BayerAG)共价地结合到5.0毫升的CNBr活化Sepharose(Pharmacia)上制成。该物质置于亲和柱上，以流速为2.0毫升/分钟的0.1M Tris(pH8.0)，0.5M NaCl进一步洗涤，然后用3倍体积的pH4.0 0.2M乙酸稀释。收集含有激肽释放酶及胰蛋白酶抑制活性(如下)的级分、冷冻并冻干。胎盘二库宁肽进一步用凝胶过滤层析，凝胶过滤用结合到Beckman System Gold HPLC系统的Superdex 7510/30(Pharmacia)柱。简而言之，该柱在0.5毫升/分钟的流速以0.1M Tris、0.15M NaCl和0.1％ Triton X-100平衡。冻干样品在1.0毫升的0.1M pH8.0Tris中重建，并以200微升的等分样品注射到凝胶过滤柱上。收集组分(0.5毫升)并测定胰蛋白酶和激肽释放酶抑制活性。收集活性组分，加入TFA调节溶液的pH至2.5。把该物质直接置于Vydac C18反相柱(5微米，0.46×25厘米)，该柱预先以0.1％TFA中的20％乙腈平衡。用在0.1％TFA中的20到80％的乙腈线性梯度以1.0毫升/分钟以50分钟的时间分离，在分离之前先用在0.1％TFA中的20％乙腈初始洗涤20分钟。收集组分(1毫升)并测定胰蛋白酶和激肽释放酶的活性。用Speed-Vac浓缩器(Savant)浓缩含有抑制活性的组分，并经N端序列分析。胎盘二库宁肽功能分析测定其抑制牛胰蛋白酶及人血浆激肽释放酶的能力来识别功能性的胎盘二库宁肽。胰蛋白酶抑制活性用Gly-Pro-Lys-氨基甲酸香豆素作为底物在96-孔微滴定板(Perkin Elmer)在室温下在分析缓冲液(50mM Hepes，pH7.5，0.1M NaCl，2.0mM CaCl2，0.1％Triton X-100)中分析。在装备有平板读数计的Perkin-Elmer LS-50B荧光计上通过测定其荧光(ex＝370纳米，em＝432纳米)值来测定通过胰蛋白酶产生的香豆素的量。把胰蛋白酶(在100微升缓冲液中的23微克)与待测的20微升样品混合，并在25℃温育10分钟。在测试缓冲液中加入50微升的底物GPK-AMC(终浓度33μM)起始反应。测试荧光强度并通过下式测定每个级分的抑制百分数抑制百分数＝100×[1-F0/F1]其中F0是未知的荧光，而F1是对照中的胰蛋白酶的荧光。级的激肽释放酶抑制活性用测试缓冲液(50mM Tris，pH8.0，50mM NaCl，0.1％triton X-100)的7.0nM激肽释放酶及66.0μM Pro-Phe-Arg-AMC作为底物来类似地测定。胎盘二库宁肽体外特异性的测定用前述实施例中描述的材料和方法测定天然胎盘二库宁肽的体外特异性。通过用GPK-AMC作底物来监测未结合胰蛋白酶级分通过一种已知浓度的胰蛋白酶的活性位点滴定定量胎盘二库宁肽。蛋白质测序把1毫升组分(C18-29 Delaria)在Speed Vac上体积减少到300毫升，以减少有机溶剂量。然后把样品置于Hewlett-Packard微型双相反应柱上，并用1毫升2％三氟乙酸洗涤。用Edman降解法在Hewlett-Packard G1005A型蛋白质测序系统上对样品进行测序。版本3.0的测序方法及所有试剂由Hewlett-Packard提供。序列经50个循环确证。
结果。用系列激肽释放酶亲和、凝胶过滤、以及反相色谱把胎盘二库宁肽纯化至表观均质(参见下面的纯化表5)表5天然胎盘二库宁肽(1-179)纯化表表5步骤 体积 OD 280 OD 280 单位a(U)单位/OD 280(毫升) (/毫升)胎盘上清 1800.0 41.775,060 3,000,000 40.0激肽释放酶亲和 20.0 0.173.3616,000 4,880pH4.0激肽释放酶亲和 10.2 0.454.5612,000 2,630pH1.7Superdex 75 15.0 0.0085 0.133,191 24,546a一个单位定义为在标准分析中抑制50％的胰蛋白酶活性所需的量。
大部分激肽释放酶和胰蛋白酶抑制活性是从pH4.0洗脱的激肽释放酶亲和柱中洗脱出来的。随后的凝胶-过滤色谱(图5)产生了激肽释放酶和胰蛋白酶抑制活性的峰，分子量的值在10到40KDa的范围内，该分子量的值通过在同等条件下分子量标准迁移所产生的标准曲线确定。反相C18色谱(图6)产生了4个抑制活性峰，其最强洗脱约在30％乙腈处。与C18洗脱来的第一个峰相关的活性(馏分29)显示了以所预测的胎盘二库宁肽(ADRER...；SQID NO1)的氨基酸序列起始的第一个氨基酸起始的氨基酸序列，并与50个循环测序得到的预测序列相同(图3中有下划线的氨基酸)。此序列中的半胱氨酸残基与所预期的氧化蛋白测序一样是沉默的。在成熟胎盘二库宁肽第11和第20氨基酸位置上的半胱氨酸残基从后来对S-吡啶乙基化的蛋白质的测序中发现，在该测序中第11和第20循环中回收了PTH-吡啶乙基-半胱氨酸。
有趣的是，在序列第30位上的天冬氨酸是沉默的，这表明该位置易于被糖基化。馏分29产生一个相对应于在第1号残基(27皮摩尔，在第1循环中)起始的胎盘二库宁肽的主要序列加上一段衍生自在第6位残基(SIHD...)起始的胎盘二库宁肽的次要序列。这表明馏分29中测序的终产品是高度纯净的，而且最有可能是产生与该馏分关的蛋白酶抑制活性的原因(图6)。
因此，从C18色谱得到的胎盘二库宁肽的最终制剂基于银染SDS-PAGE分析是高度纯化的(图7)，在10列20％的丙烯酰胺麦黄酮凝胶(Novex，San Diego，CA)上的迁移的蛋白质其表观分子量为24KDa，并用下述分子量标准校准胰岛素(2.9KDa)；牛胰蛋白酶抑制剂(5.8KDa)；溶菌酶(14.7KDa)；β-乳球蛋白(18.4KDa)；碳脱水酶(carbonic anhydrase)(29KDa)；以及卵白蛋白(43KDa)。上述在SDS-PAGE上的胎盘二库宁肽的大小是与全长编码序列所预期的是相吻合的(图4F)。
与所期望的一致，根据上述的N端测序结果，与胎盘二库宁肽(7-64)的抗体反应的纯化蛋白质产生的带与用银染(图7)在凝胶上检测到的纯净制剂具有相同的分子量(图12A)。但是，当把同样制剂与合成胎盘二库宁肽(102-159)的抗体反应时，未观察到相应于全长蛋白质的带。与此相反的是，观察到与合成二库宁肽(102-159)共迁移的约6KDa的片断。对这些结果的简单解释就是纯化蛋白质制剂在纯化后经受了降解产生含有N端结构域的N端片段和含有C端结构域的C端片的C端片段。假设具与胎盘二库宁肽(7-64)的抗血清反应活性的片段缺少全长蛋白质的C端尾，这个大小(24kDa)暗示其糖基化程度较高。
下面的表6表明了胎盘二库宁肽对不同丝氨酸蛋白酶的体外抑制能力。数据与来自于抑蛋白酶肽(Traslol)的相比较。表6胎盘二库宁肽对不同蛋白酶抑制的Ki值表6蛋白酶(浓度)胎盘二库宁肽Ki(nM) 抑蛋白酶肽Ki(nM)胰蛋白酶(48.5pM) 0.13 0.8人纤溶酶(50pM)1.9 1.3结果表明从天然来源(人胎盘)分离的胎盘二库宁肽是一种类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的有效的抑制剂。实施例8胎盘二库宁肽在不同的人器官和组织中的表达形式多组织Northern印迹购自Clontech，该印迹含有2微克Poly A+来自于人心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏和胰腺的RNA。用两种不同的cDNA探针1)编码胎盘二库宁肽(102-159)的凝胶纯化的cDNA；2)用EcoRI消化及凝胶纯化的从TA克隆中释放的PCR衍生的780个碱基对的cDNA。每个探针用32P-dCTP标记并用来自于Boehringer MannheimBiochemicals(Indiana)的试剂盒随机标记，然后根据产商建议，用来与多组织Northern进行杂交。以18小时曝光时间用Biomax进行放射自显影，用AdobePhotoshop及Umax Scanner扫描进行显影。
结果。用胎盘二库宁肽(102-159)探针(图11A)或含有两个胎盘二库宁肽(图11B)的Kunitz结构域的更大的探针观察到的组织表达形式与所期望的基本上是一致的。胎盘二库宁肽mRNA在胰腺和胎盘中最为丰富。在肺、脑和肾中也观察到了明显的含量，然而在心和肝中含量较低，在骨骼肌中测不到该mRNA。在所有情况下，转录体长度为1.95kb，与上述文中所述的全长cDNA克隆和EST重叠所推导得到的结果很接近。
该mRNA在组织中的广泛分布表明胎盘二库宁肽是广泛表达的。既然该蛋白质还有引导序列，它就会广泛暴露于人免疫系统下，因而它就必须被识别为一种自身蛋白质。胎盘二库宁肽mRNA在组织中广泛分布的额外证据衍生自一个事实，即一些与胎盘二库宁肽(图4B)具有同源性的EST entries来自于成人或婴儿的脑，以及人视网膜、乳房、卵巢、嗅上表和胎盘。因此可断定天然人蛋白质对患者的给药将不会诱发免疫反应。
有趣的是，胎盘二库宁肽的表达形式在某种程度上使人联想到在牛肺和胰中发现的高含量的抑蛋白酶肽。为了进一步阐明胎盘二库宁肽的表达形式，测定了从下述人细胞中来的总RNA的RT-PCR未刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，HK-2(衍生自肾近小管系)，TF-1(红白血病系)和Phorbolester(PMA)刺激的人外周血白细胞。所用的引物CACC TGATCGCG AGACCCC(有义；序列59)；CTGGCGGAAGCAGCGGAGCATGC(反义；序列60)；设计来扩增编码胎盘二库宁肽的600b.p.的cDNA片断。通过包括肌动蛋白引物扩增800b.p.的肌动蛋白片断而使比较能推至一般情况。然而在用溴化乙锭琼脂糖凝胶中所检测到的800b.p.片断在所有泳道中均是强度一致的，600b.p.的胎盘二库宁肽片断在HUVECs中缺失但在任何其它细胞系中含量都很明显。我们断定胎盘二库宁肽至少在一些内皮细胞中不表达，但在一些红细胞群体中有表达。实施例9从杆状病毒/Sf9表达系统高度纯化的胎盘二库宁肽(1-170)的纯化及特点含有两个Kunitz结构域(胎盘二库宁肽1-170)的胎盘二库宁肽的大片断如下在Sf6细胞中表达。来自于PCR(图4E)并包含在TA载体(见上述实施例)中的胎盘二库宁肽cDNA用HindIII和Xbal消化产生其侧翼有5′XbI位点和3′HindIII位点的片段。该片段用凝胶过滤并免隆到M13mp19载体(NewEngland Biolabs，BeUerly，MA)中。用体外突变(Kunkel T.A.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492)用于在5′端的XbaI位点产生3′Pst1位点；而在编码ATG起始位点的序列、天然胎盘二库宁肽信号肽及成熟胎盘二库宁肽编码序列的5′。用于诱变的寡核苷酸具有下述序列5′CGC GTC TCG GCT GAC CTG GCC CTG CAG ATG GCG CAC GTG TGCGGG 3′(SEQ ID NO61)以相似的方法在利用下述寡核苷酸在该cDNA3′端产生终止密码子(TAG)和BgIII/XmaI位点5′CTG CCC CTT GGC TCA AAG TAG GAA GAT CTT CCC CCC GGG GGGGTG GTT CTG GCG GGG CTG 3′(SEQ ID NO62)终止密码子与编码胎盘二库宁肽的序列符合读框并导致紧随在第170氨基酸残基处赖氨酸发生终止，因此编码缺失了假定的穿膜结构域的截短了的胎盘二库宁肽片段。分离从PstI和BglII消化而来的产物并克隆到Bac Pac8载体中用于表达含有全部两个Kunitz结构域的但在紧邻假定的穿膜区段的N末端处被截短的胎盘二库宁肽片断(1-170)。
在感染后72小时收获培养基，Sf-9昆虫细胞对二库宁肽的表达被优化至1∶1的感染多样性。收获以后，加入Tris-HCl把杆状病毒细胞培养物上清(2升)的pH调至8.0。使用如上面实施例7中所述的从胎盘中纯化天然胎盘二库宁肽的方法，用5毫升的牛胰激肽释放酶亲和柱通过层析纯化二库宁肽。洗脱物用TFA把pH调至2.5，并置于C18反相柱(1.0×25厘米)层析，该柱用流速为1毫升/分钟的0.1％TFA中的10％乙腈平衡。二库宁肽用0.1％TFA中10到80％的乙腈线性梯度洗脱。收集活性馏分，冻干，重新溶于50mM Hepes(pH7.5)，0.1M NaCl，2mM CaCl2，以及0.1％triton X-100中，并保存在-20℃待用。重组二库宁肽的浓度通过氨基酸分析确定。
结果。以下述两步纯化法从杆状病毒细胞培养物上清中纯化重组二库宁肽，以产生活性胰蛋白酶抑制剂(如下表8)。表8从转化的培养物上清中纯化重组二库宁肽表8纯化步骤体积OD280/OD280 单位(U)比活性(毫升)毫升 总量 (单位/OD)上清2300.09.0 20,700 6,150,00297激肽释放酶亲和 23.00.122.7640,70014,746C18反相0.4 3.841.5411,11172,150在固定牛胰激肽释放酶亲和柱层析粗产品，并选择性地分离0.013％的蛋白质，并表现出0.67％的胰蛋白酶抑制活性。在起始上清中出现的大部分胰蛋白酶抑制活性不与固定的激肽释放酶结合，与二库宁肽无关(结果未列出)。随后的C18反相色谱产生了进一步的5倍的纯化，回收率为0.2％。通过SDS-PAGE高度纯化的终产品具有的分子量为21.3KDa，并与兔抗胎盘二库宁肽102-159免疫印迹反应(未列出)。N端测序(26循环)产生了所期望的以残基+1(ADRER...)起始的成熟胎盘二库宁肽(图4F)的序列，表明在Sf9细胞中信号肽被正确加工。
从Sf9细胞纯化的胎盘二库宁肽(100皮摩尔)被吡啶乙基烷基化，CNBr消化，然后在未对所得片段进行再溶解即进行测序。20个循环的测序得到下序N末端序列 数量胎盘二库宁肽残基#LRCFrQQENPP-PLG-----21皮摩尔 154-168(SEQ ID NO63)ADRERSIHDFCLVSKVVGRC20皮摩尔 1-20(SEQ ID NO64)FNYeEYCTANAVTGPCRASF16皮摩尔 100-119(SEQ ID NO65)Pr--Y-V-dGS-Q-F-Y-G 6皮摩尔 25-43(SEQ ID NO66)因此回收了相应于每种所期望的四种片断的N端。这证实了Sf6表达含有胎盘二库宁肽(1-170)的全部胞外结构域的蛋白质。N端测序(50个循环)了未消化胎盘二库宁肽(1-170)的附加样品产生了氨基酸序列，而该序列在30个循环缺乏任何PTH-氨基酸(PTH-天冬氨酸是所期望的)。对从人胎盘而来的天然蛋白质的测序得到了相应的结果(实施例7)，而且与此天冬氨酸残基周围的氨基酸序列所推测的一样，该残基被糖基化。而且，在此区域内的半胱氨酸残基与二硫键成键中所推测的一样，是沉默的。实施例10来自于Sf6细胞的纯化的胎盘二库宁肽的抑制特异性用实施例3、4和7中所述的材料和方法确定重组二库宁肽的体外特异性。此外，二库宁肽对人组织激肽释放酶的抑制通过把0.35nM的人组织激肽释放酶重组二库宁肽在含50mM Tris(pH9.0)50mM NaCl和0.01％triton X-100的缓冲液中温育来测定。37℃5分钟后，加入5微升2mM PFR-AMC并监测荧光变化。
也通过下述方法确定了组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)的抑制在含有150mM NaCl和0.02％叠氮化钠的20mM Tris缓冲液pH7.2中在室温下把tPA(来自于Sigma Chemical Co，St Louis，MO的人黑瘤细胞培养物的单链形式)与抑制剂预先温育2小时。随后把反应转移到含有下述起始组分浓度的反应系统中起始反应tPA(7.5nM)，抑制剂0到6.6μM，在含有0.004％(v/v)tritonX-100及0.005％(v/v)叠氮化钠的pH8.5的28mM Tris缓冲液中DIle-Lpro-Larg-对硝基苯胺(1mM)。对硝基苯胺的形成在37℃两小时温育后通过在A405钠米处测定而来。
下面的表表明重组二库宁肽作为不同丝氨酸蛋白酶体外抑制剂的有效性。列出的数据与从用重组二库宁肽或抑蛋白酶肽筛选得到的数据作为对比。表9各种蛋白酶被重组胎盘二库宁肽(1-170)或抑蛋白酶肽对各种蛋白酶抑制的Ki值的比较表9蛋白酶(浓度)重组二库宁肽 抑蛋白酶肽Ki(nM) Ki(nM)胰蛋白酶(48.5pM)0.064 0.8人血浆激肽释放酶(2.5nM) 0.18 19.0人组织激肽释放酶(0.35nM)0.04 0.004牛胰激肽释放酶(100pM) 0.12 0.02人纤溶酶(50pM) 0.23 1.3因子Xa(0.87nM) 180 在31μM时5％抑制因子XIa(0.1nM) 3.0 288组织纤溶酶原激活剂(7.5nM) ＜60 在6.6μM时无抑制组织因子VIIa800 在1μM时无抑制结果表明重组二库宁肽可在昆虫细胞中表达并产生活性蛋白酶抑制剂，该抑制剂至少是5种丝氨酸蛋白酶的抑制剂。
重组二库宁肽对人血浆激肽释放酶、胰蛋白酶和纤溶酶比抑蛋白酶肽更有效。意外的是，对所有所测试的酶来说，重组二库宁肽比合成二库宁肽片断(7-64)和(102-159)更有效。这些数据表明重组二库宁肽用于体外实验对比抑蛋白酶肽更有效，因此人们期望它在体内含更有效力。
除了测定对特定蛋白酶的有效性之外，还鉴定了胎盘二库宁肽(1-170)对延长活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的能力，并与抑蛋白酶肽相关的活性进行比较。抑制剂在含150mM NaCl和0.02％叠氮化钠的pH7.2的20mM Tris缓冲液中稀释，并加(0.1毫升)到置于MLA Electra800自动凝结时间仪(Automatic Coagulation Timer)凝结仪(Medical Laboratory Automation，Inc.Pleasantville，N.Y.)中的小杯中。把该仪器置于APTT档300秒活化时间及重复模式，加入1毫升血浆(Speielly Assayed Reference Plasma Lot1-6-5/85，Helena Laboratories，Beaumomt，TX)，APTT试剂(Automated APTT-lot102345)，购自Oregon Teknika Corp.Durhan.NC)及25mM CaCl2，自动分散以起始凝结，并自动监测凝结时间。结果(图14)表明凝结时间的加倍需要约2μM的终浓度的抑蛋白酶肽，但仅有0.3μM Sf9衍生的胎盘二库宁肽。这些数据表明胎盘二库宁肽是一种有效的抗凝血剂，可用作治疗涉及凝血内源途径的病理活化的疾病的治疗剂。
虽然本发明的特定实施方式已为说明的目的而详细地描述，显而易见，对本领域熟练技术人员来说，所描述的那些方法及配方可在不脱离本发明的精神及范围的情况下被修改。因此，除了所附的权利要求书进行了限制，本发明是未作限制。
权利要求
1.一种基本上纯化的蛋白质，具有丝氨酸蛋白酶抑制活性，选自于由包含任一种含有下述氨基酸序列中的一个的物质所组成的蛋白质的组，所说序列的氨基酸按图4F中所列出的天然的人胎盘二库宁肽的氨基酸序列编号，在图4F中通过去掉信号肽而成的N端残基被定为第1号残基ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK 170(SEQ ID NO52)；MACLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL225(SEQ ID NO49)；ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL225(SEQ ID NO70)；AGSFLAWL GSLLLSGVLA -1ADPERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN TTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS179(SEQ ID NO2)；MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA-1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225(SEQ ID NO45)；MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSRDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS FGD 213(SEQ ID NO47)；ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSMI50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200QERALRTVWS FGD 213(SEQ ID NO71)；IHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATV 64(SEQ ID NO4)；CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK C 61(SEQ ID NO5)；YEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE150ACMLRCFRQ159(SEQ ID NO6)；CTANAVTGPC RASFPRWYFD VERNSCNNFI YGGCRGNKNS YRSEE150ACMLRC 156(SEQ ID NO7)；IHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPPRQ DSEDHSSDMF 75NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 125ACMLRCFRQ 159(SEQ ID NO 3)；CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150ACMLRC 156(SEQ ID NO50)；ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 25YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 75NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 125ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS179(SEQ ID NO1)；andADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DS 92(SEQ ID NO8).
2.一种根据权利要求1的蛋白质，其中所说的蛋白质是糖基化的，或含至少一个链内半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，或既被糖基化的又含有至少一个链内半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。
3.一种用于抑制丝氨酸蛋白酶活性的药物组合物，该药物组合物含有权利要求1或权利要求2的一种蛋白质再加上一种药物可接受的载体。
4.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1的蛋白质。
5.一种自我复制的蛋白质表达载体，该载体含有编码并能表达权利要求或权利要求2的蛋白质的核酸序列。
6.一种抑制丝氨酸蛋白酶活性的方法，包括用有效量的至少一种如权利要求1或权利要求2的蛋白质去接触丝氨酸蛋白酶。
7.一种治疗下述疾病状况的方法，包括用有效量的权利要求1或权利要求2的蛋白质对具有这些疾病的患者给药，这些疾病状况包括脑水肿、脊髓水肿、多发性硬化、局部缺血、手术期失血、脓毒症、败血症性休克、纤维变性、与病理性血凝结或凝块相关的疾病、复合外伤、中风、大脑或蛛网膜下出血、脑部炎症、脊髓炎症、大脑感染、大脑肉芽肿、脊髓感染、脊髓肉芽肿、心脏打开手术、胃癌、颈癌或预防转移。
8.权利要求7的方法，其中所说的疾病状况是脑水肿、脊髓水肿、多发性硬化、局部缺血、手术期失血、脓毒症、败血症性休克、纤维变性、与病理性血凝结或凝块有关的疾病、中风、大脑或蛛网膜下出血、脑部炎症、脊髓炎症、大脑感染、大脑肉芽肿、脊髓感染、脊髓肉芽肿或打开心脏的手术。
9.权利要求7的方法，其中所说的疾病状况是胃癌、颈癌或预防转移。
10.一种制备治疗下述疾病状况的药剂的方法，这些疾病状况包括脑水肿、脊髓水肿、多发性硬化、局部缺血、手术期失血、脓毒症、败血症性休克、纤维变性、与病理性凝血或凝块相关的疾病、中风、大脑或蛛网膜下出血、脑部炎症、脊髓炎症、大脑感染、大脑肉芽肿、脊髓感染、脊髓肉芽肿、心脏打开手术、胃癌、颈癌或预防转移。
11.一种用重组DNA技术制备权利要求1或权利要求2的蛋白质的方法。
全文摘要
本发明提供利用人胎盘二库宁肽、丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、以及其片段的蛋白质、多肽、核酸序列、构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物及方法。
文档编号C07K14/81GK1259999SQ97194556
公开日2000年7月12日 申请日期1997年3月10日 优先权日1996年3月11日
发明者保罗·P·塔姆布里尼, 加里·戴维斯, 凯瑟琳·A·德拉里亚, 克里斯托弗·W·马洛尔, 丹尼尔·K·马勒 申请人:拜尔公司