专利名称：用于人b型钠尿肽bnp快速检测的试剂及制备方法和临床应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂及制备方法和临床应用。 属于生物医药技术领域。
背景技术：
BNP是B型钠尿肽(B type natriuretic p印tide)的简称。现有技术中，测定血浆 BNP的方法主要有放射免疫法、免疫放射测量法、电化学发光法、免疫荧光法。目前国内外常 用的实验室检测方法是电化学发光法，虽然该方法结果精确，但不能快速提供检查结果。虽 然目前有人使用"床旁即时检测BNP"的方法，但价格昂贵，普通患者无法承受，不能广泛推 广应用。为了解决现有电化学方法测定血浆BNP存在不能快速提供检查结果以及"床旁即 时检测BNP"法存在价格昂贵等问题，需要研制出一种用关于BNP快速诊断试剂。
目前，关于BNP快速诊断试剂的研制处于起步阶段。BNP快速诊断试剂 盒多采用BNP的两种多克隆抗体夹心ELISA (酶联免疫吸附测定，Enzyme-linked ImmunosorbnentAssay)法检测BNP浓度，其试剂盒的主要成分为两种抗BNP的多克隆抗 体、ELISA反应板、显色酶和显色剂等。其中获得抗BNP的抗体或者多肽、并采用合适的方 法将其应用于检测是制备BNP快速诊断试剂盒的关键技术。现有技术中所使用的BNP抗体 多采用杂交瘤的方法获得，或通过自行构建噬菌体抗体库，筛选出抗BNP的单链可变区抗 体片段(scFv)。但是这两种方法均有很多缺点。采用杂交瘤的方法获得的杂交瘤细胞不稳 定、难保存，不适应于大规模工业化生产，而且制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需 要数月，耗时长。而利用自行构建的噬菌体抗体库进行筛选的方法，不仅自行构建抗体库会 花费大量时间，而且自行构建的噬菌体抗体库的库容小， 一般只能达到108pfu/ml。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了提供一种用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂。
本发明的第二个目的，是为了提供一种用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的 制备方法。 本发明的第三个目的，是为了提供一种用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的 临床应用。 本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到
用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂，其特点是 1)包括抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽，其DNA序列如序列表SEQ ID N2 :1所示；
2)所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽与载体蛋白KLH连接，并将所述抗人B型 钠尿肽BNP特异性多肽固定在硝酸纤维素膜上。
本发明的第一个目的还可以通过采取如下技术方案达到 本发明的一种实施方案是所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽是指抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽。 本发明的一种实施方案是采用戊二醛法，将抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽与 载体蛋白KLH连接。 本发明的一种实施方案是所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的主要组
份还包括胶体金颗粒、抗人B型钠尿肽BNP多克隆抗体。 本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案实现 用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法，其特征是包括以下几个步 骤 1)从噬菌体随机12肽库淘洗出获得与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体 克隆； 2)通过DNA测序对每个与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆进行定 性，推断出最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽； 3)利用免疫化学发光法检测血浆标本的B型钠尿肽BNP浓度，记录结果；
4)利用步骤2)推断出的最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽代替B型钠 尿肽BNP的两种多克隆抗体夹心ELISA法中的其中一种B型钠尿肽BNP多克隆抗体，建立 一种新的检测B型钠尿肽BNP的夹心ELISA方法，利用此方法检测步骤3)中所用的血浆标 本的B型钠尿肽BNP浓度，记录结果。 5)将步骤3)与步骤4)的两种检测结果进行线性相关性分析，若具有正相关，则确 定步骤2)推断出的最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽具有检测B型钠尿肽BNP 的有效性。 本发明的第二个目的还可以通过以下技术方案实现 本发明的一种实施方案是所述噬菌体随机12肽库是New England Biolabs公司 的噬菌体随机12肽库。 本发明的一种实施方案是所述淘洗方法是应用噬菌体展示12肽库，经过3 4 轮淘洗，将洗脱液进行蓝白斑筛选，挑选出蓝斑进行噬菌体阳性克隆鉴定，获得与BNP特异 性结合的阳性噬菌体克隆。 本发明的一种实施方案是用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法的 步骤4)所述的12肽可以是利用化学合成的方法获得的与步骤2)推断出的最有特异性结 合能力的阳性噬菌体克隆具有相同基因的12肽。
本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案实现 用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的临床应用，其特征是将抗人B型钠尿肽 BNP特异性12肽与KLH的连接蛋白与胶体金颗粒、抗人B型钠尿肽BNP多克隆抗体一起置 入包装盒体中，利用免疫层析法原理作为检测方法，构成临床用诊断试剂盒。
噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合 表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒子内。噬 菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子的 多肽配体通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速鉴定。经3-4轮淘选后，通过DNA 测序对每个可结合克隆进行定性。直接采用噬菌体随机多肽库，通过淘洗的方法获得抗B 型钠尿肽BNP特异性多肽是一种新方法，具有耗时短，抗体工程菌比杂交瘤细胞稳定、易保存，适应于大规模工业化生产，同时，可以利用库容量大(可达1.5 2.0X10"pfu/ml)的
商品化噬菌体随机多肽库，省却了构建抗体库的时间，可直接进行淘洗。 免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应
的一种常用的标记技术，在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogr即hy)
和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，已成功用于检领ljHBsAg、
HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。免疫层析法原理是将特
异的抗体或多肽先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品
后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相
应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定
的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 本发明具有的有益效果如下 1、本发明解决了 B型钠尿肽BNP的抗体或者多肽获得难的问题，本发明采用噬菌体展示New England Biolabs公司的噬菌体随机12肽库比杂交瘤技术简单快速，大大縮短了制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株过程的时间。 2、本发明通过噬菌体随机多肽库淘洗出来的是针对人B型钠尿肽BNP的抗原决定簇的特异性12肽，不仅分子量小，结构简单，而且制成试剂盒后能够提高检测的特异性和敏感性；同时直接用商品化的噬菌体随机多肽库进行实验，降低了成本、节约了时间、提高了工作效率。克服了既往的试剂盒多采用B型钠尿肽BNP的两种多克隆抗体夹心的方法检测B型钠尿肽BNP，存在特异性和敏感性不高的缺点。
图1是噬菌体克隆与B型钠尿肽BNP的结合力示意图。 图2是显示1-32号血桨标本使用免疫化学发光法检测B型钠尿肽BNP的结果图。
图3是化学合成的12肽代替B型钠尿肽BNP的两种多克隆抗体中的任一种建立的新的夹心ELISA法检测1-32号血浆标本B型钠尿肽BNP含量的结果(0D值)。
图4是打点印迹法鉴定12肽-KLH偶联物与B型钠尿肽BNP的结合力(1为随机对照12肽-KLH偶联物；2为KLH ;3为12肽-KLH偶联物)。
具体实施例方式
具体实施例1 本实施例制成一种用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂，其特点是
1)包括抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽，其DNA序列如序列表SEQ ID N2 :1所示；
2)所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽与载体蛋白KLH连接，并将所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽固定在硝酸纤维素膜上。 本实施例中，抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽是指抗人B型钠尿肽BNP特异性12
肽。所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的主要组份还包括胶体金颗粒、抗人B型
钠尿肽BNP多克隆抗体。 本实施例的制备方法如下 试剂与材料噬菌体随机12肽库和ER2738肠杆菌菌株购于New England Biolabs公司；B型钠尿肽BNP抗原液，购于sigma公司。Tween-20清洗液(吐温20) 、 PEG(聚乙二醇)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)、Glycine-HCl (非特异性缓冲液)、Tris-HCl缓冲液、HRP (辣根过氧化酶)、TME显色液和Xgal ( P -半乳糖苷酶的显色底物)直接购买；LB培养基、TBS缓冲液和PBS缓冲液自行配制；PBST和TBST分别为加了 Tween-20的缓冲液。
—、从噬菌体展示噬菌体随机12肽库，淘洗出与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆，具体步骤如下 1、准备100 ii g/ml的靶分子溶液；用所述溶液150 ii 1包被一个反应孔；在增湿容
器中4t:轻微震荡，孵育过夜； 2、第二天，挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于20ml细菌培养基LB液体中，37t:剧烈震荡培养； 3、倒掉孔中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。反应孔加满封阻液，4t:作用lhr ; 4、按照步骤3中所述方法去封阻液，再用TBST (TBS+0. 1 % [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次； 5、用1ml (微孔板则用100 y 1)的TBST缓冲液稀释2X 1011的噬菌体(即10的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60min;倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液；
6、按步骤4中所述方法用TBST缓冲液洗板10次； 7、用非特异性缓冲液0. 2M Glycine-HCl (pH 2. 2) ， lmg/ml BSA来分离已结合的分子温和摇动> lOmin，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150iU(微量孔则用15 ii 1) 1M Tris-HCl (pH 9. 1)中和上述洗脱液; 8、按常规M13方法中的程序测定少量(1 P 1)洗脱物的滴度； 9、剩余洗脱物应当被扩增将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处
于对数前期)，37t:剧烈摇动培养4. 5hr ; 10、将培养物转入一离心管中，然后，4t: 10，000rpm离心10min ;上清液转入另一离心管中，再离心；将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl ;让噬菌
体4t:沉淀过夜； 11、第二天，4。C 10， OOOrpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；沉淀物重悬于lml TBS中，悬液转入微量离心管中，4。C离心5min使残余细胞沉淀；上清液转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀；冰上孵育15-60min ;4"离心10min，弃上清；沉淀物重悬于200 iil TBS，O. 02% NaN3中，离心lmin，沉淀任何残余的不溶物，上清液转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物； 12、根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4"C贮存；
13、再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，如步骤1 ; 14、计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2X10"pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验；
15、进行第二轮淘选用第一轮淘选扩增的洗脱物中2X10"pfu的噬菌体量重复步骤2 ll，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0. 5% (v/v);在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度；
16、再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，如步骤1 ; 17、进行第三轮淘选用第二轮淘选扩增的洗脱物中2X10"pfu的噬菌体量重复步骤2 ll，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0. 5% (v/v);在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度； 18、再包被一个板或孔准备第四轮淘选时用，如步骤1 ; 19、进行第四轮淘选用第三轮淘选扩增的洗脱物中2X 1011pfu的噬菌体量重复步骤2 ll，清洗步骤中同样用O. 5% (v/v)的Tween在LB/IPTG/Xgal平板上测定第四轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第四轮洗脱液即是经过富集的噬菌体克隆，不必再扩增，将第四轮洗脱液进行蓝白斑筛选，挑选16个蓝斑进行噬菌体阳性克隆鉴定，获得IO个阳性克隆，提取其DNA。 其中所述噬菌体阳性克隆鉴定的步骤具体如下 以B型钠尿肽BNP包被96孔酶联板(100iig/ml，每孔100iiL)中的17个孔，同时包被一阳性对照孔，置于4t:孵育过夜后；倒弃包被液后，每孔加满封闭液(2%脱脂奶粉，用PBS溶解稀释)，室温孵育2h。倒去封闭液，PBST[TBS+0. 05% (v/v) Tween-20]洗3次，16个实验孔中每孔加入上步纯化的噬菌体200 ii L(约含2X 1011的噬菌体，用封闭液等量稀释并先孵育30min)，另1孔加入M13K07作为阴性对照，阳性对照孔则加入阳性对照液，室温孵育lh ;PBST洗6次后，每孔加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(1 : 5000) 200 y L，室温孵育lh ;TBST洗6次，每孔加100 ii g TMB显色，用2M H2S04终止反应；酶标仪在410nm波长下测定吸光度(0D)值，以0D值高于0. 2，且高于阴性对照(阴性对照值低于0. 1) 2倍以上者为阳性克隆，如图l所示。 其中所述提取10个阳性克隆DNA的步骤具体如下 取扩增后的噬菌体上清500ii L，加入200ii L PEG/NaCl，室温反应10min，离心弃
上清，沉淀物重悬于100 ii L碘化物缓冲液中，加入250 y L乙醇，室温温育10，沉淀DNA，离
心弃上清，用70%乙醇洗沉淀，短暂真空干燥，沉淀重悬于30 ii L灭菌双蒸水中。 二、通过DNA测序对每个与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆进行定
性，推断出最有特异性结合的阳性噬菌体克隆。 将提取出的IO个阳性克隆的DNA送广州英骏生物公司进行DNA测序，结果显示10个阳性克隆中有5个阳性克隆的序列相同，推断具有相同序列的阳性克隆即为与B型钠尿肽BNP最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆，其序列如序列表SEQ ID N2:l所示。
三、证实上述推断出的与B型钠尿肽BNP最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆具有检测B型钠尿肽BNP的有效性。 1 、免疫化学发光法是目前广泛应用于临床定量检测血浆B型钠尿肽BNP水平的方法，所以选取1-32号患者的血浆标本标本，利用免疫化学发光法检测B型钠尿肽BNP浓度，记录结果，见图2 ; 2、推断出的与B型钠尿肽BNP最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆可以通过生物体原核或真核表达，进而通过纯化获得成品。但由于此推断出的与B型钠尿肽BNP最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆序列短，只有12个氨基酸，生物体表达较困难，采用化学合成的方法获得与推断出的与B型钠尿肽BNP最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆具有相同基因的12肽，送与上海生物工程技术服务有限公司进行此12肽的合成；
3、把化学合成的抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽包被32个酶联板实验孔(每孔100 y L)，同时用B型钠尿肽BNP抗原液(100 ii g/ml，每孔200 y L)包被一个阳性对照孔，用lXPBS包被一个阴性对照孔。置于4t:孵育过夜后；倒弃包被液后，每孔加满封闭液(2%脱脂奶粉，用PBS溶解稀释)，室温孵育2h。倒去封闭液，PBST[PBS+0.05% (v/v)Tween-20]洗3次，挑选免疫化学发光法结果中B型钠尿肽BNP浓度依次升高的32位患者的血浆标本，分别取200 ii L加入至32个实验孔中，室温孵育lh，PBST洗6次；各实验孔与阴性、阳性对照孔各加入一抗溶液200iiL(抗BNP多克隆抗体，1 : 30稀释，用封闭液等量稀释并先孵育30min)，室温孵育lh， PBST洗6次；每孔加入二抗溶液200 y L (HRP标记羊抗兔IgG抗体，l : 5000稀释，用封闭液等量稀释并先孵育30min)，室温孵育lh;PBST洗6次后，每孔加100 iiL TMB显色，用2M H2S04终止反应；酶标仪在波长405nm处测吸光度(OD)值。化学合成的12肽代替现有技术B型钠尿肽BNP的两种多克隆抗体夹心ELISA法中的其中一种B型钠尿肽BNP多克隆抗体，建立的此检测B型钠尿肽BNP的夹心ELISA方法检测B型钠尿肽BNP浓度，记录结果，见图3。 4、用所得OD值与免疫化学发光法测定获得的B型钠尿肽BNP浓度值进行线性相关性分析。由图2、图3可以看出两种方法的检测结果呈正相关(r = 0. 813， P < 0. 001)，证明本发明淘选出的12肽与B型钠尿肽BNP有特异性结合能力。 四、应用本发明淘洗出的12肽研制成一种用于抗人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂。 由于12肽是小分子物质，必须将其与分子量大的载体蛋白连接，才能较好地将多肽固定在硝酸纤维素膜上。KLH是常用的载体蛋白，其与目的多肽的连接不影响12肽的结构特异性；连接反应效率高、产物均一、易于纯化；本发明采用戊二醛法成功地将12肽与KLH连接，打点印迹(Dot blot)表明偶联物能与B型钠尿肽BNP结合，见图4。而且，通过分光光度法，测得偶联物中12肽与KLH具有较高的结合比。 所述戊二醛法交联化学合成12肽与KLH的主要步骤是将8mg KLH溶于2ml的硼酸盐缓冲液中，温和震荡，加入12肽10mg，边振荡边缓慢加入新鲜配制的3mol/L的戊二醛溶液(lml)，室温作用2h，将反应物在Ph = 8. 5的硼酸盐缓冲液中4t:透析过夜，交联形成12肽-KLH偶联物。 所述打点印迹法鉴定偶联物的主要步骤是取12肽-KLH偶联物6ul，缓慢点在NC膜上，待干透后，以封闭液(0. 1M NaHC03，5mg/ml BSA，O. 02%NaN3，pH8. 6)封闭2h，PBST洗涤5次，加入100 ii g/mlBNP，室温孵育2h ;同法洗涤后，加入抗B型钠尿肽BNP —抗(1 : 30稀释)，室温孵育2h ;同法洗涤后，加入HRP标记羊抗兔二抗(1 : 5000稀释)，室温孵育lh，洗涤后显色，以不加戊二醛的反应体系产生的蛋白及随机12肽-KLH偶联物为对照。
所述分光光度法计算偶联物的结合比的主要步骤是取KLH溶液、12肽溶液、偶联物溶液，分别利用分光光度仪在波长300nm下测吸光度A值，根据朗伯-比尔定律计算3种溶液的300nm处摩尔吸光系数"由光的加合性原理计算结合物中12肽与KLH的结合比。
具体实施例2 本发明利用免疫层析法原理作为B型钠尿肽BNP快速诊断试剂盒的检测方法，将抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽与KLH连接蛋白，胶体金颗粒、抗人B型钠尿肽BNP多克隆抗体一起置入包装盒体中，构成临床用诊断试剂盒。
序列表 〈110〉广州医学院第二附属医院、中山大学 〈120〉用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂及制备方法和临床应用 〈160>1 〈210>1 〈211>36 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽，该12肽与B型钠尿肽BNP有特异性 结合能力，用于研制BNP快速诊断试剂盒。 〈400〉 1 tct cat tgg tgg tgg tgg gat gcg agg ggt tat gat 36 Ser His Trp Trp Trp Trp Asp Ala Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 1权利要求
用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂，其特征在于1)包括抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽，其DNA序列如序列表SEQ ID№1所示；2)所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽与载体蛋白KLH连接，并将所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽固定在硝酸纤维素膜上。
2. 如权利要求1所述的用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂，其特征在于所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽是指抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽。
3. 如权利要求1所述的用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂，其特征在于所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的主要组份还包括胶体金颗粒、抗人B型钠尿肽BNP多克隆抗体。
4. 用于抗人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤1) 从噬菌体随机12肽库淘洗出与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆；2) 通过DNA测序对每个与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆进行定性，推断出最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽；3) 利用免疫化学发光法检测血浆标本的B型钠尿肽BNP浓度，记录结果；4) 利用步骤2)推断出的最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽代替BNP的两种多克隆抗体夹心ELISA法中的其中一种B型钠尿肽BNP多克隆抗体，建立一种新的检测B型钠尿肽BNP的夹心ELISA方法，利用此方法检测步骤3)中所用的血浆标本的B型钠尿肽BNP浓度，记录结果；5) 将步骤3)和步骤4)的两种检测结果进行线性相关性分析，若具有正相关，则确定此推断出的最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽具有检测B型钠尿肽BNP的有效性。
5. 如权利要求4所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法，其特征在于所述噬菌体随机12肽库是New England Biolabs公司的噬菌体随机12肽库。
6. 如权利要求4所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法，其特征在于所述淘洗方法是应用噬菌体展示12肽库，经过3 4轮淘洗，将洗脱液进行蓝白斑筛选，挑选出蓝斑进行噬菌体阳性克隆鉴定，获得与B型钠尿肽BNP特异性结合的阳性噬菌体克隆。
7. 如权利要求4所述用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的制备方法，其特征在于步骤4)中所述的12肽是利用化学合成的方法获得的与步骤2)推断出的最有特异性结合能力的阳性噬菌体克隆12肽具有相同基因的12肽。
8. 用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂的临床应用，其特征在于将抗人B型钠尿肽BNP特异性12肽与KLH的连接蛋白、胶体金颗粒、抗人B型钠尿肽BNP多克隆抗体一起置入包装盒体中，利用免疫层析法原理作为检测方法，构成临床用诊断试剂盒。
全文摘要
本发明公开用于人B型钠尿肽BNP快速检测的试剂及制备方法和临床应用，其特征在于1)包括抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽，其DNA序列如序列表SEQ ID№1所示；2)所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽与载体蛋白KLH连接，并将所述抗人B型钠尿肽BNP特异性多肽固定在硝酸纤维素膜上。本发明采用噬菌体展示New England Biolabs公司的噬菌体随机12肽库比杂交瘤技术，缩短了制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株过程的时间；淘洗出来的特异性12肽，分子量小、结构简单，制成试剂盒后提高检测的特异性和敏感性；直接用于噬菌体随机多肽库进行实验，具有降低成本、节约时间、提高工作效率的效果。
文档编号G01N21/76GK101738481SQ20091019366
公开日2010年6月16日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者刘世明, 吴文言 申请人:广州医学院第二附属医院;中山大学