一种脂肪酶检测试剂和脂肪酶快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳品中脂肪酶快速检测试剂，包括A液、B液和标准品，其中标准品是甲氧基试卤灵，A液为PBS缓冲液，B液含有荧光底物、缓冲液、乳化剂和防腐剂。本发明还公开了使用该检测试剂快速检测乳品中脂肪酶的方法，包括标准曲线绘制、样品荧光值读取和脂肪酶活计算。本发明灵敏度高，操作简单，工作量小，系统误差小，多次试验重复性好，方便快捷，可在20～60min内得到检测结果。
【专利说明】一种脂肪酶检测试剂和脂肪酶快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于食品监测领域，涉及一种脂肪酶检测试剂及使用其检测脂肪酶的快速检测方法，特别涉及乳品如牛奶中脂肪酶的快速检测方法。
【背景技术】
[0002]乳制品营养丰富，是人类理想的营养食品，但同时也是微生物的良好培养基，属高危险性的食品原料。在众多微生物污染中，嗜冷菌污染是影响乳品保质期的主要因素。嗜冷菌在牛奶原料乳低温储存时会大量繁殖，虽然这些菌经过巴氏杀菌和UHT灭菌阶段可以被杀死，但它们中的某些菌属如假单胞菌属可产生极其耐热的脂肪酶，即使经过140°C的超高温灭菌处理，仍会有少量的残留。这些残留的耐热脂肪酶在乳制品储藏的过程中被激活，水解乳制品中的脂肪球，从而导致产品品质发生变化，如脂肪上浮分层，出现苦味、腐败味、脂肪氧化味，严重影响乳品品质。消费者购买到此类问题产品时，也常会投诉公司产品质量问题。每年因此类问题引发的产品质量事故，不仅给公司带来了巨大的经济损失，同时对企业品牌带来了负面影响。快速筛查原料乳中脂肪酶酶活，控制高酶活力的原料乳进入乳制品尤其是UHT乳生产环节，可以有效地降低嗜冷菌大量繁殖所带来的产品质量隐患，提高整体产品质量，提升公司经济效益。
[0003]目前对脂肪酶的检测方法主要是采用氢氧化钠标准溶液滴定(QB/T1803-1993)，采用橄榄油和聚乙烯醇的乳化液作为底物，检测方法十分复杂，耗时较长，但结果变化大，容易产生误差。此外脂肪酶的常见检测方法还包括铜皂法和对硝基苯酚法。铜皂法是依据脂肪酸和Cu2+形成绿色络合物，在710nm波长处测定吸光度来进行酶活定量，铜皂法精确度较高，但是操作繁琐、稳定性不高，并且由于该方法使用大量的苯进行铜皂的萃取，容易造成污染和对人体造成伤害；对硝基苯酚法采用对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解后产生有颜色的对硝基苯酚，在420nm波长下测定吸光度进行酶活定量，对硝基苯酚法测定酶活较低的脂肪酶时偏差较大，且对硝基苯酚有毒，不适于食品检测。
【发明内容】
[0004]本发明是针对现有技术方法的不足，旨在提供一种方便、快速、安全和高灵敏度的脂肪酶快速检测试剂及其检测方法，尤其用于检测乳品如牛奶中的脂肪酶。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明提供了一种基于荧光方法的脂肪酶的检测试剂，其包括A液、B液和标准品，其中
标准品是甲氧基试卤灵；
A 液为 PBS 缓冲液，配方为:137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和水，pH为 7.4;
B液含有荧光底物、缓冲液、乳化剂和防腐剂。
[0006]其中，所述荧光底物为1，2-氧-二月桂基-(±)丙三醇基-戊二酸-6 ’ -甲基-试卤灵酯(CAS号为110033-82-4)，浓度可以为10 μ M?200 μ M，优选50 μ M?100 μ Μ。[0007]所述B液中的缓冲液选自酒石酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液和甘氨酸缓冲液的一种或多种；乳化剂选自Tween (吐温)20、Tween 40、Tween 60和Tween 80的一种或多种；防腐剂选自Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300和叠氮化钠的一种或多种。
[0008]所述检测试剂中，A液与B液的体积比优选地可以为2:1?4:1。
[0009]在本发明中，所述检测试剂的量可以由本领域技术人员根据根据技术常识确定，当使用液体形式时，可采用不同浓度的标准品甲氧基试卤灵，比如0.1?4mM，比如100 μ M。
[0010]在一个实施方案中，所述B液中的缓冲液为醋酸钠缓冲液，乳化剂为Tween (吐温)20，防腐剂为 Proclin 300。
[0011]所述B液中缓冲液的浓度为ImM?20mM，优选的浓度为1.5mM?IOmM ;pH为3.0?6.0，优选的pH为4.0?5.0。所述的乳化剂的浓度为1/5000?1/500，优选的浓度为1/2000?1/800。所述防腐剂的浓度为1/10000?1/1000，优选的浓度为1/5000?1/2000。
[0012]在一个实施方案中，所述B液中缓冲液的浓度为5mM，pH为4.0，乳化剂的浓度为1/1000，防腐剂的浓度为1/5000。
[0013]本发明还提供一种试剂盒，其包括上述任一种方案中所述的检测试剂。
[0014]本发明所述的检测试剂或试剂盒，用于检测乳品中的脂肪酶，所述乳品可以选自原料乳、巴氏乳、UHT乳、复原乳及乳粉。
[0015]在本发明中，原料乳是指从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中挤出的无任何成分改变的常乳。巴氏乳是指仅以生牛(羊)乳为原料，经巴氏杀菌等工序制得的液体产品。UHT乳是指以生牛(羊)乳为原料，添加或不添加复原乳，在连续流动的状态下，加热到至少132°C并保持很短时间的灭菌，再经无菌灌装等工序制成的液体产品。复原乳是指炼乳或/和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳。乳粉是指以生牛(羊)乳为原料，经加工制成的粉状产品。
[0016]本发明还提供了一种使用前述检测试剂检测乳品中脂肪酶酶活的方法，其包括以下步骤:
1)将A液与B液按2:1?4:1的体积比例混合，配制成工作液C；
2)分别加入5，10，15，20μ L标准品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100?200 μ L工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C ；
3)将酶标板放入25?37°C预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510?550nm，优选520?540nm激发，在发射波长580?620nm,优选590nm?610nm处检测，读取突光值，记录为Aig,空白对照记录为As,以标准品荧光值(Aig-As)为纵坐标(单位为RFU),以标准品的体积为横坐标(单位为μ L)，绘制标准曲线；
4)加入2?20μ L乳品样品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100?200 μ L工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C ；
5)将酶标板放入25?37°C预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510?550nm，优选520?540nm激发，在发射波长580?620nm,优选590nm?610nm处检测，读取突光值，记录为Al样,空白对照记录为Al s，孵育20?60min，优选30?60min之后再次读取荧光值，记录为A2样,空白对照记录为A2 s ；
6)将样本的荧光值[A#= (A2#-A2S)-(A1#-A1S)]代入标准曲线中，从标准曲线上读出该样品所对应的标准品体积，带入下述计算公式即得到样品脂肪酶酶活；
计算公式为:
【权利要求】
1.一种脂肪酶检测试剂，其包括A液、B液和标准品，其中 标准品是甲氧基试卤灵；
A 液为 PBS 缓冲液，配方为:137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和水，pH为 7.4 ; B液含有荧光底物、缓冲液、乳化剂和防腐剂，其中荧光底物为1，2-氧-二月桂基_(±)丙三醇基-戊二酸_6’ -甲基-试卤灵酯。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其中所述B液中的缓冲液选自:酒石酸缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种；乳化剂选自=Tween 20、Tween 40、Tween 60和Tween 80 中的一种或多种；防腐剂选自 Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300和叠氮化钠中的一种或多种。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的检测试剂，其中所述荧光底物的浓度为ΙΟμΜ~200 μ Μ，优选50μΜ~100 μ M ;Β液中的缓冲液的浓度为ImM~20mM，优选1.5mM~IOmM ；乳化剂的浓度为1/5000~1/500，优选1/2000~1/800。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测试剂，其中所述B液中的缓冲液的pH为3.0~6.0，优选的pH为4.0~5.0 ;防腐剂的浓度为1/10000~1/1000，优选1/5000~1/2000。
5.根据权利要求 1-4中任一项所述的检测试剂，用于检测乳品中的脂肪酶，所述乳品选自原料乳、巴氏乳、UHT乳、复原乳及乳粉。
6.一种使用权利要求1-5中任一项所述的脂肪酶快速检测试剂检测乳品中脂肪酶酶活的方法，包括: 将A液与B液按2:1~4:1的体积比例混合，配制成工作液C ； 分别加入5，10，15，20 μ L标准品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100~200 μ L工作液C，混合均匀，空白对照为对应体积的工作液C ； 将酶标板放入25~37°C预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510~550nm，优选520~540nm激发，在发射波长580~620nm,优选590nm~610nm处检测，读取突光值，记录为Ag，空白对照记录为As,以标准品的荧光值(Aig-As)为纵坐标:单位为RFU,以标准品的体积为横坐标:单位为μ L，绘制标准曲线； 加入2~20 μ L乳品样品到96孔酶标板中，每孔中再分别加入100~200 μ L工作液C,混合均匀； 将酶标板放入25~37°C预热好的荧光酶标仪中，用激发波长510~550nm，优选520~540nm激发，在发射波长580~620nm,优选590nm~610nm处检测，读取突光值，记录为Al样’空白对照记录为Al s，孵育20~60min，优选30~60min之后再次读取荧光值，记录为A2样，空白对照记录为A2空； 将样本的荧光值[A# = (A2#-A2S)-(A1#-A1S)]代入标准曲线中，从标准曲线上读出该样品所对应的标准品体积，带入下述计算公式即得到样品脂肪酶酶活； 计算公式为:
7.试剂盒,其包括权利要求1-5中任一 项所述的检测试剂。
【文档编号】G01N21/64GK103983626SQ201410215727
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】周娟作 申请人:周娟作, 金京华, 郑朋, 周越, 王江云