专利名称：蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中表达的方法。本发明公开了融 合核酸、载体、融合多肽以及用于获得蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术：
蛋白酶参与很多生物过程。蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间的平衡失调经常与病理组 织破坏有关。许多研究集中在蛋白酶在组织损伤中的作用，并且据认为，蛋白酶与蛋白酶抑制 剂之间的平衡对保持组织完整性是主要的决定因素。来自包括嗜中性白细胞的炎性细胞的 丝氨酸蛋白酶参与多种炎症疾病，例如肺气肿、关节炎、过敏性湿疹和银屑病。蛋白酶似乎也对一些癌的扩散起作用。正常细胞与被称作胞外基质(ECM)的复杂 蛋白质网络接触而生存。ECM是细胞运动的屏障，为了转移，癌细胞必须设计出打破它们的 粘附、使之降解的途径、并移动通过ECM。蛋白酶是降解其它蛋白质的酶，并且长久以来被认 为是通过消耗ECM帮助肿瘤细胞从其原始位置释放出来。最近的研究已经表明，通过激活 被称作蛋白酶-激活受体-2 (PAR2)的肿瘤细胞膜中的蛋白质，它们可以促进细胞形状改变 以及运动。这导致激活细胞的运动器(motility apparatus)的胞内反应的级联。因此，假 设在肿瘤转移中的第一步骤之一是细胞形状的再组织，以使其在面向移动的方向的一边上 形成不同的突出。然后，细胞迁移通过血管壁，并移动到远侧位置，最终重新附着并形成转 移肿瘤(metastasis tumor)。例如，人前列腺上皮细胞组成性地分泌前列腺-特异性抗原 (PSA)，一种激肽释放酶-样丝氨酸蛋白酶(kallikrein-like serine protease)，其为精液 血浆的正常组分。蛋白酶的作用是降解胞外基质并促进癌细胞的侵入。[10]合成的和天然 的蛋白酶抑制剂已经显示出在体内和体外抑制肿瘤诱发。在前的研究调查表明，已知属于 结构-相关蛋白质家族的被分类为丝氨酸蛋白酶抑制剂或SERPINS的一些蛋白酶抑制剂， 抑制数种蛋白酶，包括胰蛋白酶、组织蛋白酶G、凝血酶、组织激肽释放酶以及嗜中性白细胞 弹性蛋白酶。SERPINS对体外预防/抑制致癌剂_诱导的转化和动物模型系统中的癌的发 生非常有效。全身性给予纯化蛋白酶抑制剂减少了关节炎症以及软骨和骨破坏。 发现局部施用蛋白酶抑制剂在如过敏性湿疹这样的状况中有用途，过敏性湿 疹是皮肤炎症的一种常见形式，其可以定位于少量的部分，或涉及身体的大部分。蛋白 酶抑制剂的褪色活性以及其可以预防紫外_诱导色素形成的能力已经在体外和体内都 H 以 ilH $。 Paine ， Journal of Investigative Dermatology 116，587—595 (2001)。 此外，已经发现蛋白酶抑制剂有助于创伤愈合(http://www. sciencedaily. com/ releases/2000/10/001002071718, htm)。已经证实，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在被局部
6给予时，可逆转组织破坏并加速创伤愈合过程。另外，丝氨酸蛋白酶抑制剂也可以帮助减轻 红斑狼疮患者的疼痛(参见美国专利号6537968)。如上所述，蛋白酶抑制剂干扰蛋白酶的作用。天然存在的蛋白酶抑制剂可以在很 多食品中找到，例如谷类(燕麦、大麦和玉米)、芽甘蓝(Brussels sprouts)、洋葱、甜菜根、 小麦、龙爪稷(finger millet)和花生。一种感兴趣的来源是大豆。在大豆中的Kunitz和 Bowman-Birk的平均含量分别是大约1. 4%和0. 6%, Kuniz和Bowman_Birk是两种最重要 的蛋白酶抑制剂。这些低含量使得分离用于临床应用的天然蛋白酶抑制剂是不现实的。因此，需要可生产大量蛋白酶抑制剂及其变异体的方法，这种方法也可以减少或 消除在哺乳动物组织培养细胞中产生这些物质中的，与血液_携带的传染剂(blood-borne infectious agent)有关的风险。在此所提供的本发明的生产方法允许大量的蛋白质治疗 剂的生产。
发明概述在此所提供的是核酸、细胞以及用于生产蛋白酶抑制剂及其变异体的方法。在第一个实施方案中，提供了编码功能性蛋白酶抑制剂的核酸。在一个方面，提供 了包含与第一个、第二个、第三个和第四个核酸序列可操作连接的调节序列的核酸。提供了 在第四个核酸序列之后的终止序列。在第二个方面，所述第一个核酸序列编码在第一丝状真菌中功能为分泌性序列的 信号多肽，第二个核酸编码正常分泌自所述第一丝状真菌或第二丝状真菌的分泌多肽或其 功能部分，第三个核酸编码可切割连接子，以及第四个核酸编码蛋白酶抑制剂或其片段。在第三个方面，提供了包含编码蛋白酶抑制剂的核酸序列的表达盒。在第四个方面，本发明涉及编码蛋白酶抑制剂变异体的多核苷酸。所述多核苷酸 可以编码Bowman-Birk抑制剂变异体，其中至少一个环已被改变。所述多核苷酸可以编码 大豆胰蛋白酶抑制剂变异体，其中至少一个环已被改变。在第二个实施方案中，提供了表达功能性蛋白酶抑制剂或其变异体的方法。在一 个方面，(i)宿主细胞用包含编码蛋白酶抑制剂或其变异体的核酸序列的表达盒转化，和 (ii)在合适的条件下被培养，以表达蛋白酶抑制剂或其变异体。任选地，所述方法进一步包 括回收蛋白酶抑制剂或其变异体。在第二个方面，(i)宿主细胞用包含编码蛋白酶抑制剂或其变异体的核酸序列的 第一个表达盒转化，(ii)用包含编码侣伴蛋白的核酸序列的第二个表达盒转化，和(iii) 在合适的条件下被培养，以表达蛋白酶抑制剂或其变异体。任选地，可以回收蛋白酶抑制剂 或其变异体。在一个方面，蛋白酶抑制剂或其变异体作为融合蛋白被表达。任选地，所述方 法进一步包括回收蛋白酶抑制剂或其变异体。在第三个实施方案中，提供了可以表达蛋白酶抑制剂或其变异体的细胞。宿 主细胞用编码蛋白酶抑制剂或其变异体的表达盒转化。宿主细胞可以选自曲霉属 (Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)。在第四个实施方案中，提供了功能性蛋白酶抑制剂或其变异体。在一个方面，所 述功能性蛋白酶抑制剂或其变异体作为融合蛋白表达，所述融合蛋白由葡糖淀粉酶信号序 列、前序列、催化结构域和连接区域，其可达成熟葡糖淀粉酶的氨基酸数目502，随后的氨基酸NVISKP，以及然后的成熟蛋白酶抑制剂或其变异体组成。在第二个方面，用蛋白酶处理表达的蛋白质，以便从融合蛋白中释放蛋白酶抑制 剂或其变异体。在第三个方面，本发明提供具有蛋白酶抑制活性的多肽，选自a)B0Wman-Birk抑 制剂变异体；b)大豆胰蛋白酶抑制剂变异体；c)B0Wman-Birk抑制剂；d)大豆胰蛋白酶抑 制剂；和e)包含至少一个变异体序列的骨架。根据下面详细的描述，本发明的其它目的、特征和优势将是显而易见的。然而，应 当理解，虽然指明是本发明的优选实施方案，所述详细的描述和具体实施例仅通过举例说 明被提供，因为根据该详细描述，在本发明的范围和精神之内的各种改变和修改对本领域 普通技术人员将是显而易见的。
附图简述
图1是大豆Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂的密码子优化的核苷酸序列(BBI) (SEQ ID N0:1)。该序列包括编码NVISKR的核苷酸(点下划线)、融合蛋白的切割位点以及克隆 到表达质粒中的三个限制性酶位点。在5’端的Nhel位点和在3’端的Xhol位点被加以下 划线并进行标记。在3’端的BstEII位点用#符号标出。终止密码子用星号标明。没有起 始密码子，因为其作为融合蛋白被表达。编码成熟BBI的序列由双下划线标注(SEQ ID NO 2)。在图2中所示，使用编码三个甘氨酸残基的序列，可以将编码三个甘氨酸(图1B)残基 的核苷酸添加到编码成熟BBI的序列之前(SEQ ID N0:5)。图1C示出了编码BBI的核苷 酸序列、三个限制性位点、kex2位点、在N-端的三个甘氨酸残基和在C-端的六个组氨酸残 基(SEQ ID NO 54)。图2是大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)，Kunitz型蛋白酶抑制剂的密码子优化的核苷 酸序列(SEQ ID NO 3)。该序列包括编码NVISKR的核苷酸(点下划线)(SEQ ID NO 4)、融 合蛋白的切割位点以及在C-端的六个组氨酸残基(用点表示)。也包括用于克隆到表达质 粒中的三个限制酶位点(在5'端的Nhel和在3'端的Xhol和BstEII，如图1所述进行标 记)。用黑体表示在kex2位点(NVISKR)之后的三个甘氨酸残基。编码成熟STI的核苷酸 序列由虚下划线标出(SEQ IN NO 6) 0图3A是BBI的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。图3B是在N-端具有三个甘氨 酸残基的BBI(SEQ ID N0:8)。图3C是在N-端具有三个甘氨酸残基和在C-端具有六个组 氨酸残基的BBI(SEQ IDN0 9)。在图3A-C中，环1由下划线标出的氨基酸残基表示，环II
氨基酸残基由黑体字表示。图4A是在N-端具有三个甘氨酸残基和在C-端具有六个组氨酸残基的成熟 STI (SEQ ID NO: 10)。图4B是在N-端具有三个甘氨酸残基的STI (SEQ ID NO: 11)。图4C 是STI的成熟氨基酸序列(SEQ IDN0 :12)。环1由下划线的氨基酸残基表示(SEQ ID NO 13)。环II氨基酸残基由黑体字表示(SEQ ID NO 14)。图5是表达质粒pSLGAMpR2-BBI的图。该表达质粒基于pSLGAMpR2，其是 通过插入黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶启动子、催化核心和终止子、标记基因(黑曲 霉pyrG)和牛凝乳酶原基因，由pSLl 180衍生而来。pSLl 180质粒供应自Amersham Biosciences (Piscataway，NJ)。pSLGAMpR2质粒具有上面所列出的插入在与如
8pSLGAMpR2-BBI所示的相同的相对位置的元件，除牛凝乳酶原基因位于BBI基因处之外。因 此，在pSLGAMpR2中BBI基因置换凝乳酶原基因，以产生pSLGAMpR2_BBI。图 6 是野生型 BBI (SEQ ID NO :7)和 BBI 的选择的变异体(SEQID NOs 15 thru 29)的氨基酸序列。野生型BBI具有下划线的环。变异体与野生型的差别被显示为或者粗 体/下划线(环1)或者粗体(环II)。在一些变异体中，例如02丄3丄4丄5和8因子，在 位置13的丙氨酸(在两个半光氨酸之间)也被变为或者“丝氨酸”、“甘氨酸”或者“谷氨酰 胺”。并且，compstatin肽具有9个氨基酸而不是7个。也显示了变异体序列(SEQ ID NOs 30 thru 40)。图7是蛋白质SDS凝胶的照片。泳道1含有分子量标记。泳道2是未转化的亲代 菌株。泳道3是用编码BBI的DNA转化的亲代菌株。泳道4是用编码BBI的载体和编码侣 伴蛋白(pdiA)的载体共转化的亲代菌株。泳道15是用编码BBI的载体和编码侣伴蛋白 (prpA)的载体共转化的亲代菌株。在侣伴蛋白存在时，期望蛋白质例如BBI的表达得以增强。图8是质粒pTrex4的图。图 9A-D 是 pTrex2 的核酸序列(SEQ ID NO 41)。
发明详述现在使用下面的定义和实施例，仅以参考的方式，本发明被予以详细的描述。在此 所参考的所有专利和出版物，包括公开在此类专利和出版物中的所有序列，被清楚地引入 作为参考。除非在本文中另外被定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有与本发明 所属领域中的普通技术人员一般所理解的同样的含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND M0LECULARBI0L0GY，2D ED.，John Wiley and Sons,New York(1994)和 Hale &Marham,THE HARPER C0LINS DICTIONARY OF BIOLOGY，HarperPerennial，NY (1991) 为普通技术人员提供了关于本发明中所使用的很多术语的综合词典。尽管在本发明的实践 或试验中可以使用与那些在此所述的相似或等同的任何方法或材料，优选的方法和材料被 予以描述。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指示，分别地，核酸以5'到3'的方 向，从左到右书写；氨基酸以氨基到羧基的方向，从左到右书写。至于本领域的定义和术语， 技术人员特别要参考Sambrook等，1989和Ausubel FM等，1993。应当理解，本发明并不限 于所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以改变。此处所提供的标题并非限制本发明的各个方面或实施方案，其通过参考说明书作 为一个整体而被拥有。因此，通过参考作为整体的说明书，下面随即所定义的术语被更加充 分地定义。
定义(expression cassette)(expression vector) "^M^Lf1 生或合成产生的核酸构建物(nucleic acid construct)，该核酸构建物具有允许特定核酸 在靶细胞中转录的一系列具体的核酸元件。重组表达盒可以被整合到质粒、染色体、线粒体 DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其它序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。表达盒可以与DNA构建物及其语法等同物交替使用。如此处所用，术语“载体(vector) ”指的是被设计为将核酸序列转移到细胞中的核 酸构建物。“表达载体(expression vector) ”指的是有能力将异源DNA片段整合到外源细 胞中，并在外源细胞中表达的载体。许多原核和真核表达载体是商业可得的。合适的表达 载体的选择在具有本领域技术的普通技术人员的知识范围内。如此处所用，术语“质粒(plasmid) ”指的是被用作克隆载体的环状双链(ds)DNA 构建物，并且其在一些真核细胞中形成染色体外自我复制的遗传元素，或者整合到宿主染 色体内。术语“核酸分子(nucleicacid molecule)” 或“核酸序列(nucleicacid sequence) ”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，作为遗传密码简并性的结果，可以产生 众多编码特定蛋白质的核苷酸序列。如此处所用，“融合DNA序列(fusion DNA sequence)”从5'到3'，包含第一个、 第二个、第三个和第四个DNA序列。如此处所用，“第一个核酸序列(first nucleic acid sequence) ”或“第一个 DNA序列(first DNA sequence) ”编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号肽。这 样的信号序列包括来自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶的那些信号序列，所 述葡糖淀粉酶、a-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶来自黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var. awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)；来自木 霉属(Trichoderma)的纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切 葡聚糖酶III的信号序列；来自葡糖淀粉酶的信号序列，所述葡糖淀粉酶来自链孢霉属 (Neurospora)和腐质霉属(Humicola)；以及真核细胞的信号序列，包括来自牛凝乳酶、人 组织纤溶酶原激活子、人干扰素的信号序列，以及例如由Gwyrme等(1987)Bio/Technoloqy 5,713-719 Ijf^W^j^W^W^tlff(consensuseukaryotic signal sequence)。 特别优选的信号序列是那些由表达宿主所分泌的多肽衍生而来的信号序列，所述表达宿主 被用于表达和分泌融合多肽。例如，当表达和分泌来自黑曲霉(Aspergillus niqer)的融 合多肽时，则优选来自黑曲霉的葡糖淀粉酶的信号序列。如此处所用，第一个氨基酸序列对 应于在丝状真菌内起作用的分泌性序列。这样的氨基酸序列由所定义的第一个DNA序列编 码。如此处所用，“第二个DNA序列(second DNA sequences) ”编码从丝状真菌中正 常表达的“分泌多肽(secreted polypeptides) 这样的分泌多肽包括来自黑曲霉泡盛变 种、黑曲霉和米曲霉的葡糖淀粉酶、a-淀粉酶和天冬氨酰蛋白酶；来自木霉属的纤维二糖 水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶III ；以及来自链孢霉属的 种和腐质霉的种的葡糖淀粉酶。如同第一个DNA序列，优选的分泌多肽是那些由丝状真菌 表达宿主天然分泌的多肽。因此，例如当使用黑曲霉时，优选的分泌多肽是来自黑曲霉的葡 糖淀粉酶和a-淀粉酶，最优选葡糖淀粉酶。在一个方面，该葡糖淀粉酶与曲霉属的葡糖淀 粉酶的同源性大于95%、96%、97%、98%或99%。当曲霉属葡糖淀粉酶是由第二个DNA序列编码的分泌多肽时，可以使用全蛋白质 或其部分，任选包括前序列。因此，在从位置468-509的任何氨基酸残基上，可以将可切割 连接多肽(linker polypeptide)融合到葡糖淀粉酶中。其它氨基酸残基也可以成为融合
10位点，但是利用上述残基是特别有优势的。“分泌多月太的功能部分(functional portion of a secretedpolyp印tide) ”或语 法等同物指截断的分泌多肽，虽然被截短，其保留可折叠成正常构型的能力。例如，在通过 黑曲霉泡盛变种生产牛凝乳酶的情况下，已经显示，与前凝乳酶原(pr印rochymosin)的生 产相比，在成熟葡糖淀粉酶的第11个氨基酸之后的凝乳酶原的融合没有提供益处(美国专 利5，364，770)。在USSN 08/318，494中显示，在高达成熟葡糖淀粉酶的第297个氨基酸处， 将凝乳酶原融合到前葡糖淀粉酶(pr印roglucoamylase)的C_端，加上成熟葡糖淀粉酶的 氨基酸1-11的重复，没有在黑曲泡盛变种中产生分泌型凝乳酶。在后面的情况中，存在于 融合蛋白中的葡糖淀粉酶催化结构域的部分(大约63% )能够正确地折叠是不可能的，因 此可能已经产生了异常的、错误折叠的和/或不稳定的融合蛋白，其不能被细胞分泌。部分 催化结构域不能正确地折叠可能已经干扰了所连接的凝乳酶的折叠。因此，必须存在天然 分泌多肽的结构域的足够残基，以允许它以其正常构型折叠，独立于它所连接的期望多肽， 这是有可能的。在大多数情况下，分泌多肽的部分不但会正确折叠，并且与其不存在时相比可导 致分泌增加。类似地，在大多数情况下，分泌多肽的截断意味着功能部分(functional portion)保留了生物功能。在优选的实施方案中，使用了分泌多肽的催化结构域 (catalytic domain)，尽管可以使用其它功能域，例如底物结合结构域(substrate binding domains)。在黑曲霉和黑曲霉泡盛变种葡糖淀粉酶的情况下，优选的功能部分保 留了酶的催化结构域，并且包括氨基酸1-471。另外优选的实施方案使用催化结构域和所有 或部分连接区。可选择地，可以使用葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，其包含黑曲霉和黑曲霉 泡盛变种葡糖淀粉酶的氨基酸509-616。如此处所用，“第三个DNA序列(third DNA sequences) ”包含编码可切割连接多 肽的DNA序列。这样的序列包括那些编码葡糖淀粉酶的前序列、牛凝乳酶的前序列、枯草蛋 白酶的前序列、包括人免疫缺陷病毒蛋白酶的逆转录蛋白酶的前序列的序列，以及编码被 胰蛋白酶、因子Xa胶原酶、梭菌蛋白酶、枯草蛋白酶、凝乳酶、酵母KEX2蛋白酶、曲霉属KEXB 及类似物识别并切割的氨基酸序列的DNA序列。参见例如Marston，F. A. 0. (1986)Biol. Chem J. 240，1-12。这样的第三个DNA序列也可以编码可以被溴化氰选择性切割的氨基酸 甲硫氨酸。应当理解，第三个DNA序列仅需要编码被特定的酶或化学试剂识别所必需的氨 基酸序列，以进行融合多肽的切割。因此，不必使用例如葡糖淀粉酶、凝乳酶或枯草蛋白酶 的完整前序列。相反，仅对被合适的酶识别和切割是必需的那部分前序列是不可缺少的。应当理解，第三个核酸仅需要编码被特定的酶或化学试剂识别所必需的氨基酸序 列，以引起融合多肽的切割。特别优选的可切割连接子是KEX2蛋白酶识别位点(Lys-Arg)——其可以被天然 曲霉属KEX2-样(KEX2-like) (KEXB)蛋白酶切割、胰蛋白酶识别位点Lys和Arg，以及内切 蛋白酶的切割识别位点-Lys-C。如此处所用，“第四个DNA序列(fourth DNA sequence) ”编码“期望多肽(desired polypeptides) ”。这样的期望多肽包括蛋白酶抑制剂及其变异体。上面所定义的编码相应的四种氨基酸序列的DNA序列结合形成“融合DNA序列(fusion DNA sequence)”。这样的融合DNA序列从5 ‘端到3'端按第一、第二、第三和第 四DNA序列的顺序被装配在合适的阅读框中。当这样装配时，DNA序列将编码“融合多肽 (fusionpolyp印tide) ”或“融合蛋白(fusion protein) ”或“融合类似物(fusionanalog)， 从其氨基端起，编码在丝状真菌中功能为分泌性序列的信号肽、正常分泌自丝状真菌的分 泌多肽或其部分、可切割连接多肽以及期望多肽。如此处所用，术语“期望蛋白质(desired protein) ”或“期望多肽(desired polyp印tide)”指的是处于其成熟形式的多肽或蛋白质，其没有被融合到分泌增强构建物 (secretion enhancing construct)中。因此，“其月望蛋白质(desired protein)，，或“其月望 多肽(desired polyp印tide) ”指的是以非融合形式被宿主细胞表达和分泌的蛋白质。如此处所用，“融合多肽(fusionpolypeptide) ”或“融合蛋白(fusion protein)，， 或“融合类似物(fusion analog)”从其氨基端起，编码在宿主细胞中作为分泌性序列的信 号肽、正常分泌自宿主细胞的分泌多肽或其部分、可切割连接多肽以及期望的多肽。可以 通过宿主细胞酶例如蛋白酶加工融合蛋白，以便产生与融合蛋白中的其它蛋白质序列分离 的期望蛋白质。如此处所用，术语“融合类似物(fusion analog)”或“融合多肽(fusion polyp印tide)”或“融合蛋白(fusion protein) ”可以被交替使用。如此处所用，“启动子序列(promoter sequence) ”是被具体丝状真菌识别用于 表达目的的DNA序列。它被可操作性地连接到编码上面所定义的融合多肽的DNA序列上。 这样的连接包括与编码融合DNA序列的DNA序列的翻译起始密码子有关的启动子的定位。 启动子序列含有介导融合DNA序列表达的转录和翻译控制序列。例子包括来自黑曲霉泡 盛变种或黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(Nunberg, J. H.等(1984)Mol. Cell. Biol. 4, 2306-2315 ；Boel, E.等(1984)EMB0 J. 3，1581-1585)；米曲霉、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉 a-淀粉酶基因，米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)羧基蛋白酶基因，里氏木霉纤维二糖 水解酶I基因的启动子(Shoemaker, S. P.等(1984)欧洲专利申请号EP00137280A1)；构 巢曲霉菌(A. nidulans)trpC 基因的启动子(Yelton，M.等(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1470-1474 ；Mullaney, E.J.等(1985) Mol. Gen. Genet. 199，37-45)；构巢曲霉菌 alcA 基因的启动子(Lockington, R. A.等(1986)Gene 33 137-149)；构巢曲霉菌 amdS 基 因的启动子(McKnight，G. L.等(1986) Cell 46，143-147)；构巢曲霉菌amdS基因的启动子 (Hynes,M. J.等(1983)Mol. Cell Biol. 3，1430-1439)，以及较高等的真核细胞启动子，例如 SV40 早期启动子(Barclay, S. L.和 E. Meller (1983)Molecular and Cellular Bioloay 3， 2117-2130)。同样，“终止序列(terminator sequence) ”是被表达宿主识别以终止转录的DNA 序列。它被可操作性地连接到编码待被表达的融合多肽的融合DNA的3'端。例子包括来 自构巢曲霉菌 trpC 基因(Yelton, M.等(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81，1470-1474 ; Mullaney, E.J.等(1985) Mol. Gen. Genet. 199，37-45)、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉葡糖淀粉 酶基因(Nunberg，J. H.等(1984)Mol. Cell. Biol. 4，2306-253 ；Boel,E.等(1984)EMB0 J. 3， 1581-1585)、米曲霉、黑曲霉泡盛变种或黑曲霉a-淀粉酶基因以及米黑根毛霉羧基蛋白 酶基因(EP0
发明者B·施密特, D·A·埃斯特尔, H·德诺贝尔, S·D·鲍尔, 刘巍, 王华明 申请人:金克克国际有限公司