专利名称：一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育的制作方法
技术领域：
一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，属于 生物工程中发酵技术领域。
背景技术：
2，3-丁二醇，英文名为2，3-butanediol，简写为2，3-BD0，是无色结晶或液体，熔 点23-27°C，沸点170-182°C，具有吸水性，能与水和醇相互混溶，能溶于醇和醚。2，3-BD0是一种重要的化工原料和医药前体，例如它可以脱水形成1，3_ 丁二烯， 可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；酯化形式的2，3-BD0是合成聚亚胺的前体，可应用于药 物、化妆品、洗液等。此外2，3-BD0还可作为风味物质添加到白酒和奶油中。2，3-BD0可以 通过化学合成法和微生物生产法两种，由于2，3- 丁二醇结构特殊，化学法生产2，3- 丁二醇 主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程繁琐、 不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。随着石油价格的日益攀升，用微生物发 酵法生产2，3_ 丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。发酵法生产2， 3_ 丁二醇有许多优点首先在成本上具有优势，化学法生产成本比较高；其次，发酵法具有 对环境友好的特征，2，3_ 丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品 的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广泛应用；第三由于发酵法生 产2，3- 丁二醇是以可再生资源为原料的，因此本身摆脱了对石化原料的依赖，具有很好的 应用前景。目前，2，3_ 丁二醇的工业化主要是发酵法，有关研究国外进行的较早，取得的成 绩比较显著，国内研究还处于初级阶段，国内外发酵法产2，3- 丁二醇的研究常用的菌种大 都是克雷伯氏菌，而克雷伯氏菌具有潜在的致病性，限制了其工业化的应用。本发明筛选到以葡萄糖为底物高产2，3_ 丁二醇的微生物菌株，对该菌进行了鉴 定，确定其为枯草芽孢杆菌，是环境安全菌株具有较大的工业应用前景，对其发酵条件进行 了初步研究，在5L发酵罐上的产量可以达到61. 7g/L，为微生物发酵法产2，3- 丁二醇的工 业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵产 2，3_ 丁二醇的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为6-7。对发酵 产物进行了定性定量鉴定，为微生物发酵法生产2，3-丁二醇的工业化提供了有益的指导。本发明的技术方案一种通过微生物发酵产2，3_BD0的方法，是在初始发酵培养 基中，以从自然界土壤中筛选的菌株为生产菌株，控制温度37°C，摇床发酵72h，通过气质 联用定性检测发酵液中物质成分然后再通过液相色谱定量检测发酵液中物质的含量，筛选 出能以葡萄糖为底物发酵产2，3-BD0的菌株。本发明成功筛选到一株能以葡萄糖为底物发 酵产2，3-BD0的菌株，通过16S rDNA鉴定，将其命名为Bacllius subtilis 6-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC M 2009200。主要试剂2,3-BDO 购自美国 Sigma-Aldrich 公司2,3-BDO 分析方法的确定2，3-BD0标样在Sugarpakl糖柱上通过液相色谱进行分析，不同构型的 2，3-BD0保留时间分别为19. 3min和22. 5min。所用液相色谱仪为Waters，糖柱 Sugarpakl (6. 5mmidX 300mm)。确定具体色谱条件为糖柱Sugarpakl (6. 5mmidX 300mm))；柱温85°C ；流动相 纯水；流速0. 4ml/min ；进样量为10 y L ；检测器示差折光检测器。目的菌株的筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋 白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37°C 150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉 18g/LpH 7.0)上进行划线分离，37°C培养ld-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用；将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖 的发酵培养基中，然后置于37°C、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清 液以备检测。目的菌株的鉴定采用16S rDNA测序，将该序列与美国国家生物信息中心(NCBI) 收录的DNA序列进行比对，结果表明其与Bacillus subtilis strain BIHB332的16S rDNA序列相似性最高，为99%，为Bacillus subtilis的一个亚种，将其命名为:Bacillus subtilis 6—7。产物的定性检测采用气质联用(GC-MS)来鉴定产物中是否含有2，3-BD0。分别 测定2，3-BD0标样GC-MS图谱，发酵液用乙酸乙酯萃取后的GC-MS图谱，并进行图谱分析， 确定转化液中是否含有2，3-BD0。产物的定量检测用液相色谱法(HPLC)检测发酵液中产物2，3-BD0的生成量本发明的有益效果以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试菌株，将出发菌株在 斜面培养基上活化后，接种于装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，37°C，150r/min 的摇床上培养7h，然后按5%接种量加入初始发酵培养基中，37°C，150r/min的摇床上发酵 72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测；取2ml上清液，用2ml三氯乙酸去除蛋白，离心 过有机膜，用液相色谱法(HPLC)检测发酵液中2，3-BD0含量。国内用微生物发酵法产2， 3-BD0还处于初级阶段，本发明为微生物法发酵产2，3-BD0奠定基础。将较廉价底物葡萄糖转化成具有附加价值较高的2，3-BD0，其是重要的化工原料 和医药中间体；同时用微生物法生产2，3-BD0，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料 利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
图 1 菌株(Bacillus subtilis)6-7 电镜图片图 22，3-BD0 标准品 GC-MS 图谱图3图2中3. 37min处解图结果
图4图2中3. 55min处解图结果
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图56-7以葡萄糖为底物72h发酵液的GC-MS图谱图6图5中3. 37min处解图结果图7图5中3. 5min处解图结果图82，3-BD0标准品HPLC图谱图96-7以葡萄糖为底物72h发酵液HPLC图谱具体实施方法实施例1 菌株的筛选目的菌株的筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋 白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37°C 150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉 18g/LpH 7.0)上进行划线分离，37°C培养ld-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用。将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖的发 酵培养基中，然后置于37°C、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以 备检测。 实施例2:2，3-BD0定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液 中是否含有2，3-BD0。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在60°C下保温 lmin，然后以6°C /min的升温速率升至90°C并保持2min，最后以30°C /min的升温速率升至 180°C，恒温2min。进样口温度为250°C，进样量为1 y L，载气为高纯氦气，载气流量1. 2mL/ min，检测器温度为240°C ；TraceMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30 500amu，发射 电流为200 u A，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；标准品2，3- 丁二醇标准品GC-MS图谱及解图结果如图1、图2和图3所示，菌株发 酵液GC-MS图谱如图5、图6和图7所示。实施例3 菌株的合成2，3- 丁二醇能力检测将实施例1获得的发酵液中2，3- 丁二醇含量采用液相色谱测定。Waters液相色 谱仪，糖柱 Sugarpakl(6.5mmidX300mm))；柱温85°C ；流动相纯水，流速 0. 4ml/min ；进 样量为10 y L ；检测器示差折光检测器。不同构型的2，3-BD0保留时间分别为19. 3min和 22. 5min。2，3-BD0标准品HPLC图如图6所示，6_7以葡萄糖为底物72h发酵液HPLC图谱如 图12所示；筛选到的一株枯草芽孢发酵72h后，发酵液中葡萄糖留量为1.58/1左右，2，3_丁 二醇含量为50g/L左右。实施例4 :5L发酵罐的初步放大实验将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到含有葡萄糖为15%发 酵培养基的发酵罐中，发酵条件为温度37°C、转速350r/min、通气量lL/min，发酵72h。 收集发酵液，离心，取上清液测得2，3-丁二醇含量为61. 7g/L。
权利要求
一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，其特征是以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试株，以葡萄糖为底物微生物法生产2，3-丁二醇，筛选得到的1株枯草芽孢杆菌菌株Bacllius subtilis 6-7，该菌能以葡萄糖为底物进行发酵，在发酵液中测得2，3-丁二醇；(1)菌株的筛选菌种筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37℃，150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉18g/L pH7.0)上进行划线分离，37℃培养1d-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基，作初筛备用；从斜面上挑取菌株到种子培养基中培养，将用种子培养基培养到对数期的种子，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测；(2)2，3-BDO定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液中是否含有2，3-BDO。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在60℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持2min，最后以30℃/min的升温速率升至180℃，恒温2min。进样口温度为250℃，进样量为1μL，载气为高纯氦气，载气流量1.2mL/min，检测器温度为240℃；TraceMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；(3)菌株鉴定提取出发菌株的基因组DNA以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌16S rDNA的通用引物进行扩增正向引物为f5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’反向引物为r5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’PCR方法如下50μL反应体系中加入10mol/L的引物f和r各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coli JM109。经氨苄青霉素抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株的16SrDNA分析，该酵母菌株分类名称为 Baclliussubtilis,Bacllius subtilis 6-7。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株，其特征是将枯草芽孢杆菌接种于50mL种 子培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L pH 7. 0)的250mL的 三角瓶中，37°C，150r/min，培养7h后，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖的发酵培养基 中，然后置于37°C、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测， 测得2，3- 丁二醇的含量为49. 6g/L。
全文摘要
2，3-BDO是一种重要的化工原料和医药前体，例如它可以脱水形成1，3-丁二烯，可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；酯化形式的2，3-BDO是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗液等。此外2，3-BDO还可作为风味物质添加到白酒和奶油中。2，3-BDO可以通过化学合成法和微生物生产法两种，由于2，3-丁二醇结构特殊，化学法生产2，3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程繁琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。发酵法生产2，3-丁二醇有许多优点首先在成本上具有优势，化学法生产成本比较高；其次，发酵法具有对环境友好的特征，2，3-丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广泛应用；第三由于发酵法生产2，3-丁二醇是以可再生资源为原料的，因此本身摆脱了对石化原料的依赖，具有很好的应用前景。目前，2，3-丁二醇的工业化主要是发酵法，有关研究国外进行的较早，取得的成绩比较显著，国内研究还处于初级阶段，目前国内外发酵法产2，3-丁二醇的研究常用的菌种大都是克雷伯氏菌，而克雷伯氏菌具有潜在的致病性，限制了其工业化的应用。本发明筛选到以葡萄糖为底物高产2，3-丁二醇的微生物菌株，对该菌进行了鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，是环境安全菌株具有较大的工业应用前景，对其发酵条件进行了初步研究，在5L发酵罐上的产量可以达到61.7g/L，为微生物发酵法产2，3-丁二醇的工业化提供了基础。
文档编号C12R1/125GK101851598SQ201010167019
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者张显, 张术聪, 杨套伟, 林清, 饶志明 申请人:江南大学