一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法
【技术领域】
[0001]本发明是通过构建木醋杆菌Acetobacter xylinum NUST4.2 (简称Ax.4.2)和衣藻(Chlamydomonas)共培养体系，提高细菌纤维素的产率，并实现对纤维素微纳米尺度组装过程进行精密调控，具体涉及微生物共培养体系的构建。
【背景技术】
[0002]细菌纤维素(BacterialCellulose, BC)是由木醋杆菌(Acetobacter xy linum)生物合成的一种新型高性能微生物合成材料，与其他形式形成的纤维素相比，尽管具有相同的化学成分，但其还具有特殊的物理化学和生物学特性，特别是发酵过程的可调控发酵底物的多样性、微生物的多样性等。
[0003]作为一种新兴的生物功能材料，细菌纤维素的生产虽然已实现工业化。但迄今为止，在细菌纤维素的工业化生产过程中依然存在很多问题亟待解决，这些问题的存在也严重阻碍了细菌纤维素作为优良生物材料的广泛使用。其中，最严峻的工艺难题是在发酵后期，细胞会向环境中分泌一种水溶性多糖，acetan。这种物质会使发酵液粘度增加。Acetobacter xyIinum是一种严格的好氧菌，常用于细菌纤维素的制备，在制备过程发酵液中acetan的累积，不仅影响了细胞对氧气的摄取，使胞内代谢反应减缓，同时作为主要的副产物，消耗了底物，使目标产物的产率下降，不利于工业化生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供了一种构建微生物共培养体系产细菌纤维素的方法。该方法通过利用木醋杆菌在发酵过程中会分泌乙酸，衣藻是以乙酸为碳源的微生物，能消耗发酵液中的乙酸，使环境pH维持在适宜的水平，两种微生物共培养能实现互利共生，解决了发酵后期粘度过高造成的溶氧问题，同时能维持发酵过程中PH稳定，提高了细菌纤维素的产率，产率从3.67g/L提高至IJ 5.21g/L0
[0005]实现本发明目的的技术解决方案为:
[0006]第一步:木醋杆菌与衣藻分别进行种子培养；
[0007]第二步:将衣藻种子液经离心浓缩后，通过控制微流控技术，利用海藻酸钙固定衣藻，最终制备成线状凝胶；
[0008]第三步:木醋杆菌接种至发酵培养基中后，加入第二步中制备的衣藻，进行发酵动态培养；
[0009]第四步:发酵结束，除去木醋杆菌细胞和衣藻，获得纯净的细菌纤维素。
[0010]本发明与现有技术相比其显著优点是:
[0011]1、衣藻作为一种产氧的微生物，与木醋杆菌共同培养，在发酵后期，为细菌产纤维素提供氧气，能解决粘度带来的溶氧问题；
[0012]2、木醋杆菌在发酵过程中会分泌乙酸，衣藻是以乙酸为碳源的微生物，能消耗发酵液中的乙酸，使环境pH维持在适宜的水平，有利于细菌纤维素的产生积累，两种微生物共培养能实现互利共生
[0013]3、本发明涉及构建微生物共培养体系产细菌纤维的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产，能极大地降低用于提高溶解氧含量而带来的动力消耗，并优化了木醋杆菌的生长条件，有利于缩短其生产周期。
[0014]下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
【附图说明】
[0015]图1 是本发明木醋杆菌 Acetobacter xy linum NUST4.2_ 衣藻 Chlamydomonas 共培养体系构建的流程图。
[0016]图2是对比例中木醋杆菌单独发酵过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。
[0017]图3是实施例3中木醋杆菌-衣藻共培养过程中BC产量与pH随发酵时间变化图。
【具体实施方式】
[0018]结合附图，构建木醋杆菌-衣藻共培养体系的方法，步骤如下:
[0019]第一步:木醋杆菌与衣藻分别在不同的生长条件下进行种子培养，其中木醋杆菌种子培养条件为:温度25-32°C，摇床转速90-250rpm，培养时间6-72h ;衣藻种子培养条件:温度20-25°C，摇床转速80-270rpm，光照培养箱中培养6_48h ；
[0020]第二步:将衣藻种子液经离心浓缩后，加入0.3-1.0% (w/v)的海藻酸钠溶胶中，通过控制微流控技术，利用注射栗注射至浓度为0.3-1.0% (w/v)氯化钙溶液中进行固定化，衣藻固定于线状凝胶中；
[0021]第三步:木醋杆菌以2-20%接种量接种至发酵培养基中后，加入第二步中制备的衣藻，在光照条件下进行发酵动态培养；
[0022]第四步:发酵结束，获得的产物放入0.8-1.2mol/L pH7左右的磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去海藻酸钙，随后用含质量分数1_10%。(w/v) NaOH、1-10%。卜八)!1202的溶液在70-100°C条件下处理0.5-3.0小时，去离子水洗涤至pH中性，即可获得纯净的细菌纤维素。
[0023]为了更好地理解本发明，下面通过具体的实施例来具体说明本发明的技术方案。
[0024]实施例1:
[0025]本发明为一种通过构建微生物共培养体系提高细菌纤维素产量的方法:
[0026]第一步:将两种微生物各自在种子液中进行扩大培养。木醋杆菌放在30°C 160rpm摇床培养36h，衣藻放在22°C 160rpm光照培养箱中培养36h用于制备各微生物种子液；
[0027]第二步:将衣藻种子液经离心浓缩后，加入1mL0.8% (w/v)的海藻酸钠溶胶中，均匀混合后，用注射栗控制流速为200mL/h注射至浓度为1% (w/v)氯化钙溶液中进行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器针头容量10mL，内径为0.4_，衣藻固定于线状凝胶中；
[0028]第三步:木醋杆菌以8%接种量接种至发酵培养基中后，摇瓶动态发酵培养24h后加入第二步的固定化衣藻，进行发酵动态培养；
[0029]第四步:发酵结束后，将获得的产物放入0.lmol/L pH = 7.8磷酸缓冲溶液中震荡，过滤，弃滤液，除去固定化衣藻凝胶，然后用质量分数3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在85°C条件下处理I小时，获得的纤维素用去离子水洗涤至pH中性为止。
[0030]实施例2:
[0031]本发明为一种通过构建微生物共培养体系提高细菌纤维素产量的方法:
[0032]第一步:将两种微生物各自在种子液中进行扩大培养。木醋杆菌放在29 °C 150rpm摇床培养36h，衣藻放在23°C 160rpm光照培养箱中培养36h用于制备各微生物种子液；
[0033]第二步:将衣藻种子液经离心浓缩后，加入1mLl.0% (w/v)的海藻酸钠溶胶中，均匀混合后，用注射栗控制流速为200mL/h注射至浓度为0.8% (w/v)氯化钙溶液中进