专利名称：一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育的制作方法
技术领域：
一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育，属于生物工程中 发酵技术领域。
背景技术：
3-羟基-2- 丁酮，英文名为 3-Hydroxy-2_Butanone，又名乙偶姻(Acetoin)，为 淡黄色液体，长期放置生成二聚体，微溶于水和乙醇、丙二醇等有机熔剂，熔点15°C，沸点 143 148°C，能自燃。3-羟基-2- 丁酮自然界存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食 品中。是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，并且在其它众多行业中也有广泛的应用。在食品中的应用主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生产，国家标准 GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80%含量的3-羟基丁酮俗称“醋嗡”，是酒类调 香中一个极其重要的品种。该产品因其应用范围极其广泛，用量也较大，是奶用、酒用香料 中的重要品种。在制药行业采用3-羟基-2-丁酮和光气为原料合成重要医药中间体CDMD0， 3-羟基丁酮还可以合成抗菌药伦氨苄西林盐酸盐。在化工行业3-羟基-2- 丁酮可以合成 起泡剂、杀菌和杀虫剂，含氯聚合物的稳定剂，另外3-羟基-2- 丁酮还是一种昆虫的性激
o3-羟基丁酮生产方法主要包括化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成 法生产3-羟基-2- 丁酮存在着产品收率和得率较低，且环境污染较严重等缺点，而且产品 质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域——食用香料的要求；更为严重的是这三 种工艺的原料来源受阻，导致了适用化学法生产3-羟基-2-丁酮难以大规模发展。酶法转 化法生产3-羟基-2- 丁酮产物得率高，没有其它副产物，并且产物具有旋光度，但要获得大 量特异性的酶比较困难。发酵法生产3-羟基-2-丁酮首先成本较低，其次对环境污染也较 小，并且以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基-2- 丁酮大大减轻了原料来源的限制。目前，发 酵法生产3-羟基-2- 丁酮的方法，国内外还大都处在研究阶段。本发明筛选到以葡萄糖为底物高产3-羟基-2- 丁酮的微生物菌株，对该菌进行 了鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物发酵法产3-羟 基-2- 丁酮的工业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵 产3-羟基-2-丁酮的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为 Bacllius subtilis JNA。对发酵产物进行了定性定量检测分析，为微生物发酵法生产3-羟 基-2- 丁酮的工业化提供了有益的指导。本发明的技术方案一种通过微生物发酵产3-羟基-2- 丁酮的方法，是在初始发酵培养基中，以从自然界土壤中筛选的菌株为生产菌株，在装液量为4L的7L发酵罐中 37°C、350r/min、通气量为lL/min的条件下培养130h，通过气质联用(GC-MS)定性检测发酵 液中物质成分然后再通过气相色谱定量检测发酵液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底 物发酵产3-羟基-2-丁酮的菌株。本发明成功筛选到一株能以葡萄糖为底物发酵产3-羟 基-2-丁酮的菌株，通过16S rDNA鉴定，将其命名为Bacllius subtilis JNA，已于2009年 12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 209309。主要试剂Acetoin购自美国TCI公司3-羟基-2-丁酮分析方法的确定3-羟基-2-丁酮标样在PEG-20M柱上通过气相色谱进行分析，保留时间为 12. 7min。所用气相色谱仪为日本岛津(Shimaduz)，色谱柱PEG_20M 30M I. D. 0. 32mm确定具体色谱条件为色谱柱PEG-20M 30M I. D. 0. 32mm ；顶空进样，样品 平衡温度70°C ；平衡时间30min ；进样温度200°C ；检测器温度250°C ；程序升温 40°C (5min)-180°C，升温 10°C /min。目的菌株的筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、蛋 白胨10g/L、氯化钠10g/L PH 7.0)中富集，37°C 150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉 18g/LPH 7.0)上进行划线分离，37°C培养ld-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用；将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖 的发酵培养基中，然后置于37°C、150r/min条件下振荡培养130h。收集发酵液，离心，取上 清液以备检测。目的菌株的鉴定采用16S rDNA测序，将该序列与美国国家生物信息中心(NCBI) 收录的DNA序列进行比对，结果表明其与Bacillus subtilis strain BIHB332的16S rDNA序列相似性最高，为99%，为Bacillus subtilis的一个亚种，将其命名为:Bacillus subtilis JNA。产物的定性检测采用气质联用(GC-MS)来鉴定产物中是否含有3-羟基-2- 丁 酮。分别测定3-羟基-2- 丁酮标样GC-MS图谱，发酵液用乙酸乙酯萃取后的GC-MS图谱， 并进行图谱分析，确定转化液中是否含有3-羟基-2- 丁酮。产物的定量检测用气相色谱法(GC)检测发酵液中产物3-羟基-2- 丁酮的生成量。本发明的有益效果以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试菌株，将出发菌株在 斜面培养基上活化后，接种于装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，37°C，150r/min 的摇床上培养6h，然后按5%接种量加入初始发酵培养基中，在装液量为4L的7L发酵罐中 37°C、 350r/min、通气量为lL/min的条件下培养130h，收集发酵液，离心，取上清液以备 检测；取5ml上清液，用气相色谱法(GC)检测发酵液中3-羟基-2-丁酮含量。国内用微生 物发酵法产3-羟基-2- 丁酮还处于初级阶段，本发明为微生物法发酵产3-羟基-2- 丁酮 奠定基础。将较廉价底物葡萄糖转化成具有附加价值较高的3-羟基-2- 丁酮，其是重要的化 工原料和医药中间体；同时用微生物法生产3-羟基-2- 丁酮，其较之化学生产法具有反应
4条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护， 易于推广应用。
图 1 菌株 Bacillus subtilis JNA 电镜图片
图2 3-羟基-2- 丁酮标准品GC-MS图谱图3图1中2. 78min处解图结果图4 JNA以葡萄糖为底物130h发酵液的GC-MS图谱图5图4中3. 56min处解图结果图6 3-羟基-2- 丁酮标准品GC图谱图7 Bacillus subtilis JNA以葡萄糖为底物130h发酵液GC图谱具体实施方法实施例1 菌株的筛选目的菌株的筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、蛋 白胨10g/L、氯化钠10g/L PH 7.0)中富集，37°C 150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂 布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉 18g/L PH 7.0)上进行划线分离，37°C培养ld-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基， 作初筛备用。将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖的发 酵培养基中，然后置于37°C、150r/min条件下振荡培养130h。收集发酵液，离心，取上清液 以备检测。实施例2 3-羟基-2- 丁酮定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液 中是否含有3-羟基-2-丁酮。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在60°C 下保温lmin，然后以6°C /min的升温速率升至90°C并保持2min，最后以30°C /min的升温 速率升至180°C，恒温2min。进样口温度为250°C，进样量为1 y L，载气为高纯氦气，载气流 量1. 2mL/min，检测器温度为240°C ；TraceMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30 500amu，发射 电流为200 u A，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；标准品3-羟基-2- 丁酮标准品GC-MS图谱及解图结果如图2图3所示，菌株发酵 液GC-MS图谱如图4和图5所示。实施例3 菌株的合成3-羟基-2- 丁酮能力检测按实施例1方法将活化好的种子按5%接种量加入到含有15%葡萄糖的发酵 培养基中，在装液量为4L的7L发酵罐中37 °C、350r/min、通气量为lL/min的条件下培 养130h，收集发酵液，离心，取上清液采用气相色谱测定发酵液中3-羟基-2- 丁酮的含 量。日本岛津(Shimaduz)气相色谱仪，色谱柱PEG-20M 30M I. D. 0. 32mm ；顶空进样，样 品平衡温度70°C ；平衡时间30min ；进样温度200°C ；检测器温度250°C ；程序升温 40°C (5min) -—180°C，升温 10°C /min，样品保留时间为 12. 7min。3-羟基-2-丁酮标准品GC图如图6所示，Bacillus subtilis JNA以葡萄糖为底物130h发酵液GC图谱如图7所示；
筛选到的一株枯草芽孢杆菌7L发酵罐发酵130h后，发酵液中葡萄糖几乎检测不 到，3-羟基-2- 丁酮含量为50g/L左右。
权利要求
一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育，其特征是以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试株，以葡萄糖为底物微生物法生产3-羟基-2-丁酮，筛选得到的1株枯草芽孢杆菌菌株Bacllius subtilis JNA，该菌能以葡萄糖为底物进行发酵，在发酵液中测得3-羟基-2-丁酮；(1)菌株的筛选菌种筛选将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L PH 7.0)中富集，37℃150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉18g/L、PH 7.0)上进行划线分离，37℃培养1d-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基，作初筛备用；从斜面上挑取菌株到种子培养基中培养，将用种子培养基培养到对数期的种子，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养130h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测；(2)3-羟基-2-丁酮定性检测取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液中是否含有3-羟基-2-丁酮。气质联用检测条件采用的色谱柱温控程序为首先在60℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持2min，最后以30℃/min的升温速率升至180℃，恒温2min。进样口温度为250℃，进样量为1μL，载气为高纯氦气，载气流量1.2mL/min，检测器温度为240℃；TraceMS质谱条件EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；(3)菌株鉴定提取出发菌株的基因组DNA以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌16S rDNA的通用引物进行扩增正向引物为f5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’反向引物为r5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’PCR方法如下50μL反应体系中加入10mol/L的引物f和r各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coli JM109。经氨苄青霉素抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。
2.根据权利要求1所述菌株的16SrDNA分析，该菌株分类名称为Bacllius subtilis，将其命名为 Bacllius subtilis JNA。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征是将该菌株接种于50mL种子培养基 (蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L)的250mL的三角瓶中，37°C，150r/min,培养8h 后，按5%接种量加入到含有15%葡萄糖的发酵培养基中，在装液量为4L的7L发酵罐中 37°C、350r/min、通气量为lL/min的条件下培养130h。收集发酵液，离心，取上清液以备检 测，测得3-羟基-2- 丁酮的含量为50g/L。
全文摘要
一株以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮微生物菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。本发明筛选的菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌(Baclliussubtilis)JNA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M209309。从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵产3-羟基-2-丁酮的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为Bacllius subtilisJNA。对发酵产物进行了定性鉴定，并用气相色谱法(GC)检测到发酵液中3-羟基-2-丁酮含量约50g/L，为微生物发酵法生产3-羟基-2-丁酮的工业化提供了有益的指导。
文档编号C12R1/125GK101864381SQ20101016698
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者张显, 林清, 饶志明 申请人:江南大学