专利名称：一种基于dna水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统及其构建方法和应用。
背景技术：
RNA复制子是将RNA病毒基因组中的结构基因删除，而保留其非结构基因和非编码区的顺式作用元件，复制子利用正链RNA病毒的自主复制特性，能够在细胞中表达病毒的非结构蛋白和外源蛋白。以正链RNA病毒为基础的RNA复制子表达系统，已广泛地应用于新型疫苗、导向载体制备和基因治疗等领域。申请号为200910236832.2的中国发明专利申请公开了一种日本脑炎病毒JEV复制子载体及其应用，以及用于该复制子载体包装的细胞系及包装系统。但其中在结构基因缺失方面并不相同，另外在插入外源基因的多克隆位点区域的限制性内切酶识别位点并不相同，本研究选择的限制性内切酶为较为常用的同尾酶，可以避免外源基因插入一些特异 DNA片段带来很多困难。另外，在保留结构基因的序列和其它真核表达原件也不相同，这方面对载体本身的复制和表达效率有重要的决定作用。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统。本发明另一目的在于提供上述基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统的构建方法。本发明还有一个目的在于提供上述基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，是利用RT-PCR和融合PCR的方法，以改造过的低拷贝质粒POKM为骨架，在缺失绝大部分结构基因(第165-M02核苷酸) 的情况下，构建包括CMV启动子、5’ UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的 NS1蛋白的信号肽(E25 )、所有非结构蛋白、3，UTR、核酶(HDVr )和poIyA序列的基于DNA水平的JEV复制子载体系统。上述基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统的构建方法，包括如下步骤 设计引物，其序列如SEQ ID NO:广18所示，从质粒pWF-GFP中扩增片段A，再从JEV的基因
组RNA中扩增出片段B、C、D和片段II ,再以片段A和B为模板，通过融合PCR的方法扩增出片段I ；以片段C和D为模板，融合PCR扩增出片段III,将片段I JI和III定向克隆到低拷贝质粒中，得到基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统。作为一种优选方案，上述构建方法中，所述低拷贝质粒为pOKM。通过本发明的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，还可进一步构建出含报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，该系统是在权利要求1所述
的系统的缺失结构基因的位置引入了 SpeI和SalI两个酶切位点。 通过上述含报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，还可以进一步构建出含IRES元件和报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，该系
统是在含报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统中Mll酶切位点的3’
端插入IRES元件，通过插入IRES元件，从而允许在NSl信号序列的起点能够开始内部的翻译，可以提高翻译后的蛋白切割及加工效率。另外，这种情况下外源蛋白的表达不仅仅是依靠JEV亚基因组的表达，它同时获得CMV启动子赋予的瞬时表达的能力，从而更好地表达外源蛋白。作为一种优选方案，上述IRES元件为脑心肌炎病毒的翻译调控元件。本发明上述两种乙型脑炎病毒复制子载体系统中可以插入外源基因，得到重组表达载体，再转染真核细胞后，表达外源蛋白。IRES 序列如 SEQ ID NO: 19 所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
申请号为200910236832. 2的中国发明专利申请公开了一种日本脑炎病毒JEV复制子载体及其应用。该专利涉及的复制子载体在缺失结构基因PrM和E基因，并且保留了 C基因的编码区和NSl的信号肽编码区；而本发明缺失全部结构基因包括(C、prM和E基因)只保留了 C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)，和E蛋白C端的25个氨基酸(E25)。而Sang-Ln Yun 在 Journal of Neurovirology 杂志上发表的文章(Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: Implications for packaging capacity and RNA replication efficiency)己经表明JEV复制子在转染细胞48小时后，实时定量RT-PCRR的结果表明缺失三个结构基因的JEV复制子产生的复制子RNA是保留C基因6倍多，而在荧光素酶的表达量则高出大约6 倍。因此，JEV复制子在缺失全部结构基因(C、prM和E基因)在JEV复制子RNA的产量和外源蛋白表达量在JEV复制子RNA的产量和外源蛋白表达量明显效率更高，更优越。同时， 本发明还在NSl的信号肽编码区前加入IRES (内部核糖体进入位点)，在表达外源基因方面不仅拥有复制子的功能，同时具备瞬时表达的功能，可增能外源蛋白的表达量。本发明主要是针对基于DNA水平的JEV复制子与SangHm Yun等人发表的JEV复制子在传递方面有本质的不同；另外，本发明立足研发一种基于DNAI水平的疫苗载体，而DNA在保存和传递方面比RNA更稳定，操作也更方面。
图1为PCR扩增产物，其中，1为DL2，OOODNA Marker ;2为A片段；3为B片段；4为片段I ；5为片段Π ；6为片段III ；7为D片段；8为C片段；9为DL15, 000 DNA Marker ；
图2为JEV复制子构建的酶切鉴定，其中，1为DL15，000 DNA Marker ;2为pOK-JEV-REP 酶切产物(Notl/BamHI) ；3 为 pOK-JEV-REP 酶切产物(BamHI/ XbaI) ；4 为 pOK-JEV-REP 酶切产物(Xbal/Kpnl) ；5 为 λ-EcoT14 I digest Marker ；
图3为GFP和GFP-IRES的PCR扩增产物,其中，1为GFP-IRES片段PCR产物；2为EGFP 片段的PCR产物；3为以水为模板的PCR产物；4为以水为模板的PCR产物；5为DL2，000 DNA Marker ；
图 4 为 pJEV-REP-GFP-IRES 和 pJEV-REP-GFP 的酶切鉴定，其中，1 为 DL2, 000DNA Marker ；2 为 pJEV-REP-GFP 酶切产物；3 为 pJEV-REP-GFP-IRES 酶切产物； 图5为RT-PCR鉴定JEV复制子复制能力；
图6为RT-PCR鉴定JEV复制子正、负义链的合成，其中，1-4.为反转录后的cDNA作10 倍稀释；5-8为反转录后的cDNA作20倍稀释；9为DL2，000 DNA Marker ；
图7为含报告基因JEV-REP重组质粒转染细胞后非结构蛋白的表达(Χ400)，其中，A 为 pJEV-REP-GFP 转染细胞；B 为 pJEV-REP-GFP-IRES 转染细胞；C 为细胞；
图 8 为 pJEV-REP-GFP-IRES 与 pJEV-REP-GFP 转染细胞 48h 的结果(X 200)，其中， A 为 pJEV-REP-GFP 转染 BHK-21 细胞；B 为 pJEV-REP-GFP-IRES 转染 BHK-21 细胞；C 为 pJEV-REP-GFP 转染 293T 细胞；D 为 pJEV-REP-GFP-IRES 转染 293T 细胞。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1 JEV复制子各片段的扩增及鉴定
从质粒PWF-GFP中扩增片段A，大小约0. 7Kb ；然后以日本乙型脑炎病毒疫苗株
SA14-14-2基因组RNA的反转录产物cDNA为模板分别扩增出B、C和片段II ,大小分别为 3. 3Kb，1.8 Kb和3. 6Kb ；接着以质粒pWF_GFP为模板，扩增出D片段，大小0. 8Kb ；再以A与 B片段为模板，通过融合PCR的方法扩增出片段I，大小约为4KB，而以C和D片段为模板融
合PCR扩增出片段III,大小约为2. 7Kb (见图1)。全长JEV复制子cDNA的克隆与鉴定
片段I、II、III三个片段定向克隆到载体P0KM，得到的JEV复制子质粒命名为
ρJEV-REPο然后用限制性内切酶NotI和BamHI、BamHI和XbaI、XbaI和KpnI分别进行酶切鉴定，结果表明PJEV-REP酶切后得到的片段分别约为4 Kb和7 Kb,3. 6 Kb和7. 4 Kb、以及 2.7 Kb和8. 3 Kb (见图2)，片段大小与预期相符合。接着进行序列测定，确定构建的质粒无发生突变，表明片段I >11、III插入到低拷贝质粒pOKM中，这说明JEV复制子cDNA的克隆构建成功。实施例2含报告基因的JEV复制子的载体的构建。从质粒pWF-GFP通过PCR的方法扩增出EGFP片段，大小约为720bp。另外，以质粒pIRESl-neo为模板通过PCR的方法扩增IRES序列，再与片段EGFP通过融合PCR的方法扩增出EGFP-IRES片段，大小约为l，300bp，然后分别插入到pJEV-REP质粒中。通过限制性内切酶SpeI和MlI进行酶切鉴定，结果表明质粒pJEV-REP-GFP酶切后得到的片段约为 720bp 和 11，OOObp，而 pJEV-REP-GFP-IRES 酶切后得到约 1310bp 和 11，OOObp (见图 3)，与预期相符合，经测序证明无误，这表明含报告基因GFP的JEV复制子构建成功(结构图如4)。实施例3 基于DNA水平的JEV复制子pJEV_REP-GFP_IRES与pJEV-REP-GFP均能在细胞中实现自我复制
将pJEV-REP-GFP-IRES与pJEV-REP-GFP质粒的转染BHK-21细胞，48h后收集细胞进行总RNA提取，再利用不同的反转引物来检测其复制情况。RT-PCR结果表明(如图5)，两组含 EGFP报告基因的JEV复制子与JEV —样，正链与负链均能扩增出约300bp的特异性片段，而未经反转的RNA无法扩增出特异性片段，表明反转的RNA里没有质粒的污染；而且当cDNA 作10倍和20倍稀释后，结果显示正链合成的量比负链合成的量多(如图6)。实施例4可检测到JEV-REP非结构蛋白的表达
pJEV-REP-GFP-IRES与pJEV-REP-GFP质粒分别转染细胞4 后用间接免疫荧光的方法检测到两种JEV-REP均有JEV NSl蛋白的表达(见图7)。实施例5高效表达外源基因EGFP的表达
在转染pJEV-REP-GFP-IRES质粒的转染BHK细胞和细胞后的结果，随着时间的增加荧光的表达量逐渐增加(见图8)。
权利要求
1.一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，其特征在于该系统包括CMV启动子、5’ UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽、所有非结构蛋白、3’ UTR、核酶和polyA序列。
2.权利要求1所述基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID NO:广18所示，从质粒pWF-GFP中扩增片段A，再从JEV的基因组RNA中扩增出片段B、C、D和片段 II,再以片段A和B为模板，通过融合PCR的方法扩增出片段I ;以片段C和D为模板，融合 PCR扩增出片段III,将片段I、Π和!Π定向克隆到低拷贝质粒中，得到基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统。
3.根据权利要求2所述的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统的构建方法， 其特征在于所述低拷贝质粒为Ρ0ΚΜ。
4.一种含报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，其特征在于该系统是在权利要求1所述系统的缺失结构基因位置引入了 Spe I和Ml I两个酶切位点。
5.一种含IRES元件和报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，其特征在于IRES元件位于权利要求4所述乙型脑炎病毒复制子载体系统中酶切位点的 3，端。
6.根据权利要求5所述的含IRES元件和报告基因的基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统，其特征在于所述IRES元件为脑心肌炎病毒的翻译调控元件。
7.—种重组表达载体，其特征在于含有权利要求广6中任意一条权利要求所述的乙型脑炎病毒复制子载体系统。
8.权利要求7所述重组表达载体在蛋白表达中的应用。
9.权利要求7所述重组表达载体在真核细胞中表达报告基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统及其构建方法和应用。本发明是利用RT-PCR和融合PCR的方法，以改造过的低拷贝质粒pOKM为骨架，在缺失绝大部分结构基因(第165-2402核苷酸)的情况下，构建包括CMV启动子、5’UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的25个氨基酸(E25)、所有非结构蛋白、3’UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV复制子载体系统。为了检测构建的JEV复制子能否表达外源基因，构建含有报告基因EGFP的质粒pJEV-REP-GFP-IRES与pJEV-REP-GFP。
文档编号C12N15/85GK102250950SQ201110135709
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者亓文宝, 刘国乾, 廖明, 臧富玉, 陈孝明 申请人:华南农业大学