专利名称：用BAC-retrieve的方法同时构建条件基因打靶载体和传统打靶载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术模型小鼠构建领域，具体涉及到用BAC-retrieve的方法同时构建条件基因打靶载体和传统打靶载体。
背景技术：
基因敲除(gene knockout)是目前研究基因功能最普遍的技术平台，近年来技术逐步成熟；其原理是利用同源重组(homologous recombination)的技术原理，按照研究者的设计意图，在小鼠整体水平上进行的可时空调控的灭活特定靶基因的理论和技术；涉及分子生物学，分子遗传学，胚胎学，实验动物学等多学科领域。目前基因敲除可以分为以下几步1.设计并构建目的基因打靶载体(targeting vector)；2.将线性化的打靶载体通过电转的方法转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)；3.小鼠胚胎于细胞(ES细胞)的体外培养以及转染后阳性ES细胞的筛选；4.将筛选出的中靶阳性克隆显微注射到小鼠囊胚；5.假孕母鼠接受囊胚移植产生出嵌合体小鼠；6.嵌合体小鼠再与囊胚供体小鼠杂交，即可得到杂合型的基因敲除小鼠。在获得敲除小鼠的步骤中，设计和构建打靶载体是关键环节，其构建的好坏直接影响到敲除的成功与否；构建速度对获得敲除小鼠也有很重要的影响。打靶载体一般由载体骨架、左右同源臂及正负筛选基因组成。生物学家们根据自己的需要不断改进它，现在甚至可以让特定的基因到了预定的时间便开始在生物体内停止行使其功能，以避免敲除对发育至关重要的基因时引起动物死亡；还可以让基因敲除只在特定的组织内发生，使基因的功能研究更具有针对性。条件性基因敲除获得纯合子小鼠的交配过程比较繁琐，需要构建在特定阶段特定组织或细胞中表达Cre或FLP重组酶的转基因小鼠，通过与在基因组中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配，可导致子代鼠中特定组织或细胞中的靶基因被删除。另一方面，IoxP的引入也难免会破坏基因组本身的稳定性。因此，对于那些并不致死的基因，我们仍然可以采用传统型的基因打靶方法。
发明内容
本发明的目的第一是提供用BAC-retrieve的方法构建条件型打靶载体和传统型打靶载体的方法；本发明的第二个目的是提供一种能由条件性打靶载体转变为传统打靶载体的方法。本发明的目的通过如图1的技术方案实现自Sanger研究所定购的U9BAC克隆被装入DH108菌株以琼脂为载体进行邮寄。 为使后续操作易于进行，我们首先从100 2001Λ的BAC中将包含左右同源臂的目的片段 (约10 201Λ)套取下来(见图2-A)。pL253载体中的两段同源序列各长500bp，是以129基因组DNA为模板，用PCR的方法获得，经内切酶消化后连接克隆入PL253载体。利用介于两段同源序列之间的线性化位点进行线性化的PL253载体在EL350中与BAC发生同源重
组，阳性克隆可用氨苄青霉素筛选获得。 插入IoxP位点的原理如图2-B所示。包含两段各长约70bp同源序列的IoxP-NEO/ Kan-IoxP片段同样以PCR制备，所不同的是该同源序列包含在PCR的引物进行合成。同源重组后的质粒同时具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性。重新将质粒抽提物转入EL350中可以去除菌株中其它未发生重组的质粒。加入阿拉伯糖后Cre重组酶的表达可以将IoxP位点间的NEO剪切掉，从而只留下一个ΙοχΡ。同样道理我们可以在EL250中插入第二个ΙοχΡ。 FRT-NEO/Kan-FRT留在载体中可用于ES细胞的筛选。最终的载体用测序的方法进行验证。
图1利用BAC-retrieve系统构建条件性打靶载体的基本步骤示意图
图2用PCR的方法来验证订购的BAC(bMQ-373N20，bMQ-53016)的正确性
图3小鼠基因TNFAIP1编码的蛋白质结构信息
图4小鼠TNFAIP1基因的外显子信息和敲除部位的选择，套索载体构建示意图
图5用PCR的方法检测第一个LoxP中neo片段是否已经去掉
图6用PCR的方法检测第二个LoxP是否已经插入合并纯化情况
图7用酶切的方法验证载体的正确性
表1』用酶切的方法验证载体的正确性
权利要求
1.一种两用型基因打靶载体的构建方法，其特征在于，该方法选用BAC-retrieve的方法构建条件型打靶载体，所构建的载体含有正选基因(neo)和负选基因(tk)，其中，正选基因的两端各有FRT序列，LoxP序列分别插入到被去掉的目的序列的两端，该载体在体外表达重组酶Cre的情况下，可以诱导产生传统型打靶载体，所产生的传统型打靶载体含有正选基因(neo)和负选基因(tk)，其中，正选基因的两端各有FRT序列，负选基因(tk)位于 3’同源臂外侧。
2.根据权利要求1中所述的两用型打靶载体的构建方法，其特征在于，该方法具体包括下列步骤A，129小鼠品系BAC克隆的查询及订购B，含有两段目的基因同源序列PL253载体的构建C，PL253载体与BAC的同源重组D，第一个LoxP位点的插入E，将IoxP位点间的NEO剪切掉，从而只留下一个IoxPF，第二个LoxP位点，以及FRT-NEO-FRT的插入G，用测序的方法验证载体H，由条件性敲除载体诱导产生传统型敲除载体
3.一种如权利要求2所述的第一个LoxP序列来自载体pMD18-T-Loxp-Neo-LoxP，通过 PCR的方法将Loxp-Neo-LoxP扩增出来
4.一种如权利要求2中所述的第二个LoxP序列来自载体pMD-18T-frt-neo-frt-loxp， 通过PCR的方法将frt-neo-frt-loxp扩增出来
5.一种如权利要求2所述的由条件性敲除载体诱导产生传统型敲除载体是通过原核表达Cre重组酶的方法实现
6.一种如权利要求1所述的两用型打靶载体含有线性化位点Notl。
全文摘要
本发明公开了一种用噬菌体的大肠杆菌同源重组系统(BAC-retrieve)的方法同时构建含有Cre-LoxP的条件敲除载体(conditional targeting vector)和传统打靶载体(convetional targeting vector)，用来同时制作条件基因敲除小鼠和传统敲除小鼠。该方法摆脱了传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的局限性，更有利于筛选用于后期Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶的选取，更好区分重组和野生型染色体，而且更有利于我们对打靶区域的选择，具有高效、省时、灵活的三大特点。
文档编号C12N15/85GK102277382SQ20111013578
公开日2011年12月14日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者任凯群, 张健, 高翔 申请人:南京大学