进行 PCR 扩增。
[0023] 2. 2PCR反应体系及程序 反应程序：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸I min，循环35 次；72 °C延伸10 min ; KTC保存。
[0024] 2. 3 PCR产物检测 PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现在小于500 bp处有一条带（图2)。
[0025] 2. 4目的片段回收纯化 将目的片段切胶回收，纯化采用Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0试剂盒 (TaKaRa公司），操作方法按说明书上的程序进行。
[0026] 2. 5重组质粒的构建 回收的PCR片段与载体连接，参照pGEM-T Easy Vector (Promega公司）提供的方法：
4°C连接过夜 2. 6重组质粒的转化 1) 将10 PL上述连接液加入到100 PL DH5a感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min; 2) 42 °C热激90 s，迅速置冰上冷却2 min ; 3) 加入 500 μL LB 液体培养基，37°C，190 rpm，l-1.5 h; 4) 涂抹于含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基(临用时表面涂抹X-gal 20 mg/ mL 40 μL 和 IPTG 24 mg/mL 30 μυ 上； 5) 37°C倒置培养12-16 h，4°C显色4-5 h，长出的白色菌落可能为含有重组质粒的转化 子。
[0027] 2.7质粒的提取 质粒的提取参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程上海有限公司） 中的说明书进行。
[0028] 2. 8插入片段酶切检测 选取I进行单酶双切，酶切体系为：
37°C，酶切4 h，以PCR产物、未转化质粒为对照，用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0029] 2. 9测序及序列比较 重组质粒经过鉴定后，挑选阳性克隆进行测序，测序结果见SEQ ID No. 1。
[0030] ITaPDMBCG^W RACE 和 5，RACE 结果 3. 1小麦总RNA的提取 将离心管、枪头用0.1%的DEPC水溶液处理12 h，121°C，高压灭菌40 min，灭菌两次， 灭活DEPC ;研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等在160°C干烘6 h以上；溶液均用DEPC水配制；电 泳槽、胶板及梳子等用DEPC水处理过夜。
[0031] 用BIOZOL总RNA提取试剂（BioFlux)提取叶片RNA，具体操作如下： 1) 取0.1 g新鲜的小麦叶片在研钵中用液氮迅速研磨成均匀的粉末，加入I mL BIOZOL 提取试剂（4°C)，混匀后在室温下孵育15 min，使样品充分裂解至较透明的匀浆液； 2) 加入200 PL氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡混匀并将其在冰上孵育15 min; 3) 4°C，12000 rpm 离心 5 min; 4) 将上清转入新的无 RNase离心管中，加入等体积的冰浴异丙醇，颠倒混匀，将混合样 品在-20°C条件下孵育20 min以上； 5) 4。。，12000 rpm 离心 10 min ; 6) 弃上清，加 I mL冰浴的75%乙醇，颠倒洗涤离心管壁，并漩涡震荡样品，尽可能让沉 淀悬浮以便更好的洗涤RNA ; 7) 4。。，12000 rpm 离心 5 min ; 8) 去除上清，在阴凉处适度干燥RNA沉淀； 9) 加30 PL无 RNase水，充分溶解RNA，_70°C保存。
[0032] 用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。
[0033] 利用分光光度计检测RNA样品纯度和浓度，测量OD26tl和OD28tl值，以OD 26tZOD28tl的 比值检测总RNA纯度，OD26ciAD 28tl值应介于1. 8-2. 0之间，浓度在分光光度计上可以直接读 出。
[0034] 3. 2 3' RACE 和 5' RACE cDNA 模板的制备 利用 SMART?RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 公司）提供的 PowerScript 逆 转录酶和寡聚（dT)引物，按照试剂盒所提供的方法进行3' RACE和5' RACE cDNA合成。 反应体系和反应程序如下： 1)在微量离心管中配制下列混合液：
2) 混匀后72°C，3 min ;42°C，2 min，瞬时离心收集反应液； 3) 在上面反应液中加入下列成分：
4) 轻轻混匀后 42°C 反应 1.5 h，70°C，10 min; 5) 在反应液中加入 60 KL Tricine-EDTA buffer。
[0035] 3. 3 3' RACE和5' RACE PCR反应程序和体系 根据电子克隆所得到的序列分别设计3 ' RACE引物GSPl :5 ' - CAAGAGCAAGAGCCATCCAGCAGC - 3 ' 和 5 ' RACE 引物 GSP2 :5 ' - AGCTCCTTTCTTATAGCTCTCCCGGTGT - 3 ^。
[0036] 反应体系：
反应程序：94°C，30 s，72°C，3 min，循环5次；94°C，30 s，70°C，30 s，72°C，3 min，循环 5 次；94°C，30 s，68°C，30 s，72°C，3 min，循环 25 次；72°C延伸 10 min;10°C保存。
[0037] 3· 4 PCR产物检测 PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现在大于2000 bp处有:V RACE的扩增产 物（图3)，在1000 bp左右有Y RACE扩增产物（图4)。
[0038] 3. 5目的片段回收纯化、重组质粒的构建和转化、质粒的提取、插入片段酶切检测 和测序及序列比较同实施例(一）中的2. 4-2. 9。
[0039] 3. 6 3' RACE 和 5' RACE 序列拼接 将所得到3' RACE和5' RACE序列用DNAMAN软件进行拼接，最终得到一个长4359 bp 的拼接序列（图5)。
[0040] 4. 7?/?/?汝7<?的 cDNA 和 DNA 验证 4. 1小麦基因组DNA的提取 参照CTAB法提取小麦的基因组DNA。
[0041] 4.2小麦总RNA的提取 小麦总RNA的提取同实施例(一）中的3. 1。
[0042] 4. 3第一链cDNA的合成 米用 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase !〇 (TaKaRa 公司）进行反转录。
[0043] 1)在微量离心管中加入以下成分： 2) 混匀以上成分，瞬时离心； 3) 70°C，10 min;冰上 2 min,瞬时离心；
4) 往离心管中加入以下成分（已含有6 μι): 5) 42〇C, I h ；70°C, 15 min ； 6) -20°C保存备用。
[0044] 4· 4 7?/?/?汝在 cDNA 和 DNA 中的扩增 根据3 ' RACE和5 ' RACE拼接得到的4359 bp的序列设计引物19ABC-F :5 ' - GGGTTGGGATTGAAATGCCGACG - 3，和 19ABC-R :5，一 CATTCGGGTGGTGCAAAATGT - 3，。
[0045] 反应体系：
反应程序：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸6 min，循环35 次；72 °C延伸10 min ; KTC保存。
[0046] 4. 5扩增产物检测 扩增产物用1. 〇%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现在CDNA和DNA中分别扩增出一条4000 bp和6000 bp左右的条带（图6)。
[0047] 4. 6目的片段回收纯化、重组质粒的构建和转化、质粒的提取和插入片段酶切检 测同实施例(一）中的2. 4-2. 8。
[0048] 4. 7测序及序列比较 经测序发现7?/?/?汝7(?的cDNA长4182 bp，测序结果见SEQ ID No. 2;DNA长6452 bp， 测序结果见SEQ ID No. 3;该基因编码1332个氨基酸，如SEQ ID No. 4所示。
[0049] 实施例(二)，7?/?/?汝沉默载体Y : TaPDRABCG的构建 通过病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS)技术使7?/?/?/??1 沉默，该技术是指携带一段靶基因表达序列的重组病毒侵染植物，引起植物内源基因沉默 与表型变异，通过表型变异进行基因功能分析的方法。用于小麦基因沉默的病毒载体是由 大麦条纹花叶病毒Siripe mosaic BSMV)所改造的，该病毒有由α、β和 Y 3个载体构成，在Y上带有限制性内切酶I和I的双酶切位点。在7