酶的自然变异体的获取方法及超耐热性纤维二糖水解酶的制作方法

酶的自然变异体的获取方法及超耐热性纤维二糖水解酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶的自然变异体的获取方法，以及通过该方法获得的超耐热性纤 维二糖水解酶（celIobiohydrolase)。
[0002] 本申请要求2014年3月13日在日本提出的特愿2014-050083号申请的优先权， 并将其内容引用在本申请中。
【背景技术】
[0003] 在地球上存在有丰富的木质纤维素生物质，人们期待以将其作为原料的乙醇等生 物燃料来替代化石燃料成为运输用能源。将木质纤维素转变成乙醇，需要纤维素、半纤维素 的糖化。在纤维素糖化中，有硫酸糖化和酶糖化两种方法。通常，基于统称为纤维素酶的糖 苷水解酶的糖化与硫酸糖化相比，具有不产生硫酸淤渣、能源投入量少以及不会引起过分 解、收率高等优点。
[0004] 另一方面，构成植物细胞壁的纤维素，其具有相互由坚固的氢键连接的结晶结构， 因此几乎不溶于水，基于酶的纤维素水解为固液反应。固液反应是在固体表面上进行结晶 性纤维素的水解，因此，基于酶的糖化效率非常低。例如，作为主要的纤维素水解酶的纤维 二糖水解酶（CBH)与其它多糖类分解酶相比，水解速度要慢一位数至两位数左右，因此，纤 维素生物质的糖化需要大量的酶，这形成纤维素类生物燃料的主要的成本因素。为了降低 纤维素乙醇的成本，需要格外提高纤维素酶的糖化效率。
[0005] 提尚酶效率的一种方法为提尚酶蛋白质的耐热性。为了提尚酶蛋白质的耐热性， 人们尝试了随机替换氨基酸序列的定向进化（directed evolution，DE)法、限定特定部位 进行氨基酸取代的定点突变（site-directed mutagenesis，SDM)法、将多个基因在多处进 行切断并通过改组制成嵌合序列的方法等导入氨基酸变异的各种酶的改良方法。
[0006] 基于DE法的酶改性在理论上效率极差。其原因在于伴随点突变的数量，变异体的 数量呈天文数字级增长，即会产生"组合爆炸问题"。若想得到最适合的氨基酸排列，则需要 针对全部氨基酸残基的组合制作突变体库并进行功能检验，这在原理上是不可能的。此外， 突变的大部分几乎为丧失功能的功能不全型（loss of function)，获得中立突变或有利的 功能的功能获得型（gain of function)十分稀有，基于DE法的最优选氨基酸序列的探索 效率差。
[0007] 由于必须对庞大数量的突变体库进行筛查才能获得有效的突变体、没有有效的高 通量（high-throughput)筛查法或稳定基因表达系统等原因（例如，参照非专利文献1。）， 该基于DE法的纤维素酶的功能改良无法充分进行。
[0008] 例如，中泽等提出了将木材腐朽菌里氏木霉（Trichoderma reesei)的内切葡聚糖 酶EGIII通过DE法进行改良的报告（参见非专利文献2)。该EGIII为由218氨基酸残基 构成的具有比较小的分子量的蛋白质。但是，即使是这种小的蛋白质，任意一处发生氨基酸 取代引起的突变造成的变异体数量为4, 360种（20X218)、任意两处突变造成的变异体数 量为946万种（20 X 20 X 218 X 217 + 2)，更进一步地，任意三处突变造成的变异体数量发生 爆炸性组合，为 136 亿 2413 万种（20 X 20 X 20 X (218X217X216 + 6))。
[0009] 只是获得两三处变异的变异体，就需要制作数千万~数百亿个的突变库及其功能 筛查，这并不现实。中泽等人对第一代及第二代共11，〇〇〇个突变体个体进行了功能筛查， 但仅限于将最适温度作了+5°C的改善，并未实现耐热性的大幅提高。若突变体库的规模小， 显然无法发现有效的变异体。此外，在进行功能筛查的第一代突变库9, 000个群落中，只获 得了 46个具有CMC水解活性的变异体群落。8, 954个残余的突变体被认为是氨基酸变异导 致的功能丧失或基因的表达不全，因 DE法的误差（error) PCR引发的随机突变大部分都导 致了酶蛋白质的功能丧失。如此，DE法由于产生大量的功能丧失变异体，因此筛查效率非 常差。
[0010] 基因改组法，迄今为止还无法获得在耐热性上超过亲本基因的嵌合基因。例如， Heinzelman等人提出，在多处切断多个纤维二糖水解酶基因，通过改组制成嵌合基因，以谋 求酶功能的改善的方法（参见非专利文献3)。根据该方法，以提高里氏木霉的内切葡聚糖 酶CBH II的耐热性为目的，通过基因改组将嗜热丝状菌特异腐质霉（Humicola insolens) 与嗜热毛壳菌（Chaetomium thermopHilum)的CBH II酶基因进行组合，制作嵌合酶，但所 述嵌合酶的耐热性未超过作为亲本的嗜热丝状菌嗜热毛壳菌的CBH II，无法获得有效的基 因改组效果。
[0011] 相对于靠随机突变的氨基酸取代的DE法，SDM法则为根据酶蛋白质的三维立体结 构数据而引发氨基酸取代、缺失或插入等突变的方法。虽然不需要DE法那样庞大的突变体 筛查，但一般情况下难以预测出与提高酶功能相关的部位的确定，通过SDM法而使纤维素 酶功能得到显著改善的例子并不多。
[0012] 例如，纤维二糖水解酶在N末端和C末端上分别有环状结构，形成覆盖活性中心的 洞形（tunnel)结构。人们着眼于该结构，正在尝试取代环内的氨基酸的SDM法。在张等 人的报告中指出，他们尝试推算出嗜热放线菌（Thermobifida fusca)的纤维二糖水解酶 TfCe 16B的三维立体结构，在形成活性部位的洞状结构的N末端、C末端的环上通过双重突 变导入二硫键，提高耐热性，但是与期待相反，所得变异体的酶活性的半衰期温度T 5tl减少 了 l〇°C (参见非专利文献4)。张等人进一步将四处的甘氨酸残基取代为丙氨酸、丝氨酸、 脯氨酸，但均未获得因突变而使耐热性得到提高的纤维二糖水解酶，大部分的突变体的耐 热性都降低了 5~10°C。
[0013] 此外，沃尔法特等人的报告中指出，他们为了提高属于丝状菌T. reesei的GH6家 族的纤维二糖水解酶TfCe 16A的热稳定性，在N末端环及C末端环上和位于其附近的氨基 酸残基上加入变异，制备变异体，该变异体虽然在PH7.0下热变性温度（Tm)上升，但在野生 型TfCe 16A的最适pH，即pH5.0下，Tm值反而变差（参见非专利文献5)。另一方面，冯?奥 斯托夫斯基（Von ostrowski)等人为了使形成属于丝状菌T. reesei的GH7家族的纤维二 糖水解酶TfCe 17A活性中心的洞状环的exo-loop结构的稳定，在所述环内导入SS (二硫） 键而制作变异体，但未确认出所述变异体有任何热稳定性的改善（参见非专利文献6)。如 此，在形成认为与纤维二糖水解酶酶功能密切相关的环结构的C末端环上，进行了多次导 入氢键或SS键的尝试，但迄今为止，耐热性的提高等、酶功能改善并不成功。
[0014] 若对相同的基因进行生物种间比较，则可知具有充分保存的区域和频繁进行氨基 酸变异的区域，该保存区域为赋予特定范畴的蛋白质特征的共通的序列，因此被称为"共用 序列"。该共用序列中的氨基酸残基若变异则为易失去酶功能的部位，因此其能在漫长进化 过程中得到良好保存。因此，在共用序列发生氨基酸变异引起突变，功能丧失的可能性高。 在此，人们尝试了避开共用序列而加入突变的SDM法。但是，能适用该方法的仅限于通过X 射线结晶结构解析等来确定蛋白质的三维结构的酶，而这种明确了三维结构的酶蛋白质很 少。
[0015] 现有技术文献
[0016] 非专利文献
[0017] [非专利文献 1]Himmel，et al.，Current Opinion in Biotechnology，1999， vol. 10, p. 358 ~364 ;
[0018] [非专利文献 2]Nakazawa，et al.，Applied Microbiology and Biotechnology， 2009, vol. 83, p. 649 ~657 ;
[0019] [非专利文献 3] Heinzelman， et al. ?Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009,vol. 106,p.5610 ~5615;
[0020] [非专利文献 4] Zhang，et al.，European Journal of Biochemistry，2〇00， vol. 267, p. 3101 ~3115 ;
[0021] [非专利文献 5] Wohlfahrt，et al.，Biochemistry，2003，vol. 42，ρ· 10095 ~ 10103 ；
[0022] [非专利文献 6] Von Ossowski，et al.，Journal of Molecular Biology，2003， vol. 333, p. 817 ~829。

【发明内容】

[0023] 本发明要解决的技术问题
[0024] 本发明的目的在于，提供一种高效地获取功能获得型变异体的方法。
[0025] 更进一步地，本发明的目的在于，提供一种由上述方法获得的新型超耐热性纤维 二糖水解酶、编码所述超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表达所述超耐热性纤 维二糖水解酶的表达载体、编入了所述表达载体的转化体，以及使用所述超耐热性纤维二 糖水解酶的纤维素分解物的制备方法。
[0026] 解决技术问题的技术手段
[0027] 本发明人为了解决上述问题，经认真研宄后发现，通过使用由高温土壤中所含的 微生物菌丛的宏基因组DNA中分离出的纤维二糖水解酶的碱基序列设计的引物，对高温 土壤微生物菌丛的宏基因组DNA，实施多个，例如300个以内的群落PCR，伴随多个氨基 酸的取代，或能够获取具有包含静态（silent)的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的多个超耐热性纤维二糖水解酶活性的自然变异体，从而完成了本发 明。
[0028] 此外，本发明中的"自然变异体"，是指通过人为手段产生的突变体以外的一切突 变体。
[0029] "超耐热性"是指酶活性的最适温度或酶蛋白质的热变性温度为80°C以上。
[0030] 即，作为本发明涉及的酶的自然变异体的获取方法、酶的变异体的制备方法、超耐 热性纤维二糖水解酶、编码所述超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表达所述超 耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、编入所述表达载体的转化体、超耐热性纤维二糖水解 酶的制备方法、纤维素酶混合物及纤维素分解物的制备方法，可列举为如下[1]~[13]。
[0031] [1] 一种选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法，该方法包括以下工 序：
[0032] (1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA的碱基序列组成的基因组数据库中，检测 具有酶活性的蛋白质ORF(以下也称作开放阅读框）序列的工序；
[0033] (2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA 进行PCR克隆，获得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF 序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基 序列所组成的PCR克隆的工序；
[0034] (3)对在所述工序（2)中得到的各PCR克隆，确定碱基序列及该碱基序列所编码的 氨基酸序列的工序；
[0035] (4)测定在所述工序（2)中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性，选择具有 活性的酶的自然变异体的工序。
[0036] [2] -种具有活性的酶的变异体的制备方法，该方法包括以下工序：
[0037] (1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA的碱基序列组成的基因组数据库中，检测 具有酶活性的蛋白质ORF序列的工序；
[0038] (2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA 进行PCR克隆，获得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF 序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基 序列所组成的PCR克隆的工序；
[0039] (3)对在所述工序（2)中得到的各PCR克隆，确定碱基序列及该碱基序列所编码的 氨基酸序列的工序；
[0040] (4)测定在所述工序⑵中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性的工序；
[0041] (5)在所述工序（3)及所述工序（4)后，考察所述ORF序列编码的氨基酸序列的差 异与所述酶活性的关系的工序；
[0042] (6)基于所述工序（5)中得到的氨基酸序列的差异与酶活性的关系性，通过使所 述ORF序列编码的氨基酸序列至少缺失、取代或添加一个氨基酸残基，从而制备所述酶活 性得到提高的变异体的工序。
[0043] [3]上述[2]所述的酶的变异体的制备方法，其中，所述环境微生物菌丛的宏基因 组DNA为来自高温土壤的宏基因组DNA，所述酶为至少在70°C以上显示酶活性的耐热性酶。
[0044] [4]上述[2]或[3]所述的酶的变异体的制备方法，其中，所述酶为纤维素酶。
[0045] [5] -种具有纤维二糖水解酶催化剂区域的超耐热性纤维二糖水解酶，其中，该纤 维二糖水解酶催化剂区域由下述组成：
[0046] (A)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所组成的多肽；
[0047] (B)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残 基（除了缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、230位的苯 丙氨酸、414位的丝氨酸）的氨基酸序列所组成，且至少在80°C、pH5. 5的条件下具有纤维 二糖水解酶活性的多肽；
[0048] (C)由与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸序 列（88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸）所组成，且至少在80°C、pH5. 5的 条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
[0049] [6] -种含有对纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域的多聚核苷酸，其中， 所述对纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域由下述组成：
[0050] (a)对由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所组成的多肽进行编码的碱基序列；
[0051] (b)对由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸 残基（除了缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、230位的 苯丙氨酸、414位的丝氨酸）的氨基酸序列所组成且至少在80°C、pH5. 5的条件下具有纤维 二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；
[0052] (c)对由与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸 序列（88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸。）所组成且至少在80°C、pH5. 5 的条件下具有纤维二糖水解酶活