序列同源性最高的氨基酸序列为已知的属于 绿弯菌门中的温性好氧性细菌橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus)DSM 785的GH6 家族的糖苷水解酶（SEQ ID NO :11)，其序列同源性仅为66%。从底物特异性、PSA水解反 应产物的HPLC分析以及与已知的纤维二糖水解酶的氨基酸序列的序列同源性（相同性） 来看，AR19G-166RASFS为属于GH6家族的新型纤维二糖水解酶。
[0110] AR19G-166RASFS在至少80°C、pH5.5的条件下，具有纤维二糖水解酶活性。实 际上，如后述实施例1 < 9 >所示，AR19G-166RASFS在50~95°C的广阔温度范围内显 示出纤维二糖水解酶活性。以大肠杆菌为宿主来进行表达的AR19G-166RASFS的纤维二 糖水解酶活性，在50~95°C的范围内随温度变高而变高，耐热性远优于AR19G-166QA及 AR19G-166QA的氨基酸取代变异体。
[0111] 一般情况下，具有某些生理活性的蛋白质，在不损于其生理活性的情况下，可以缺 失、取代或添加至少一个氨基酸残基。即，对于AR19G-166RASFS，在不使其失去纤维二糖水 解酶活性的情况下，可以缺失、取代或添加至少一个氨基酸残基。
[0112] 即，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下述（A)~（C)中任意一项 组成的纤维二糖水解酶催化剂区域。
[0113] (A)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所组成的多肽；
[0114] (B)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残 基（除了至少1个氨基酸残基被缺失、取代或添加之前的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、 230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸）的氨基酸序列所组成，且至少在80°C、pH5. 5的条件下 具有纤维二糖水解酶活性的多肽；
[0115] (C)由与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序 列（88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸）所组成，且至少在80°C、pH5. 5的 条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
[0116] 所述（B)的多肽中，相对于SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，被缺失、取代或添加 的氨基酸残基的数量优选为1~20个，更优选为1~10个，进一步优选为1~5个。
[0117] 所述（C)的多肽中，与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的序列同源性只要为80% 以上则没有特别的限定，优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上。
[0118] 此外，氨基酸序列之间的序列同源性（相同性）可以通过以下方式求得。即，使 对应的氨基酸最多一致地将两个氨基酸序列并列设置，在相当于插入及缺失的部分引入空 隙（gap)，求出得到的校准（Alignment)中的相对于除去空隙的氨基酸序列整体来说一致 的氨基酸的比例。氨基酸序列之间的序列同源性，可使用该技术领域中公知的各种相同性 检索软件求出。本发明中的氨基酸序列的序列同源性的值以根据公知的相同性检索软件 BLASTP得到的校准为基础，通过计算而得到。
[0119] 作为所述⑶及（C)的多肽，可以是人工设计的，也可以是AR19G-166等同源或该 部分蛋白质。
[0120] 所述（A)~（C)的多肽可以分别基于氨基酸序列进行化学合成，也可以使用后述 本发明涉及的多聚核苷酸，通过蛋白质表达系生产。此外，所述（B)及（C)的多肽可以分别 基于SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成的多肽，使用导入氨基酸变异的基因改组技术进 行人工合成。
[0121] 所述㈧~（C)的多肽在至少80°C (可以为80°C以上）、ρΗ5· 5的条件下具有纤 维二糖水解酶活性。由于在80~KKTC下也显示出非常高的纤维二糖水解酶活性，因此通 过将所述（A)~（C)中的任意一种多肽作为纤维二糖水解酶催化剂区域而具有，可获得超 耐热性纤维二糖水解酶。
[0122] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶以PSA为底物。所述超耐热性纤维 二糖水解酶也可以以PSA以外的其它β葡聚糖为底物。作为所述的其它β葡聚 糖，可列举出β-1，3键和β-1，4键组成的地衣多糖、微晶纤维素、结晶性细菌纤维素 (Bacterial microcrystalline cellulose，BMCC)、滤纸等结晶性纤维素、羧甲基纤维素 (Carboxymethyl cellulose，CMC)、β -1，3 键和 β -1，6 键组成的葡聚糖、β -1，3 键组成的 葡聚糖、β-1，6键组成的葡聚糖、以及木聚糖等。作为本发明涉及的超耐热性纤维二糖水 解酶，除了 PSA，优选以β-1，3键和β-1，4键组成的葡聚糖及结晶性纤维素的至少一种作 为底物，更优选以PSA、β-1，3键和β-1，4键组成的葡聚糖及结晶性纤维素作为底物。
[0123] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的最适pH依存于反应温度而变化，其在 pH5. 0~6. 5的范围内。作为本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，优选至少在pH5. 0~ 6. 5的范围内显示纤维二糖水解酶活性，更优选在pH4. 0~7. 0的范围内显示纤维二糖水解 酶活性。
[0124] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶可以具有纤维二糖水解酶活性以外的纤 维素水解活性。作为其它的纤维素水解活性，可列举出内切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性或 葡糖苷酶活性等。
[0125] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，可以是仅由所述（A)~（C)的多肽的任 意一种组成的纤维二糖水解酶催化剂区域所组成的酶，也可以含有其它区域，作为该其它 区域，可列举出公知的纤维二糖水解酶具有的纤维二糖水解酶催化剂区域以外的区域。例 如，在本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶中，相对于公知的纤维二糖水解酶，可以含有 将纤维二糖水解酶催化剂区域取代为所述（A)~（C)的多肽而得到的酶。
[0126] 在本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶含有纤维二糖水解酶催化剂区域以外 的区域的情况下，优选含有纤维素结合模块。纤维素结合模块可以位于纤维二糖水解酶催 化剂区域的上游（Ν末端侧），也可以位于下游（C末端侧）。此外，纤维素结合模块与纤维 二糖水解酶催化剂区域可以直接结合，也可以通过适当长度的连接区域进行结合。作为本 发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，优选在纤维二糖水解酶催化剂区域的上游或下游， 存在有通过连接区域连接的纤维素结合模块，更优选在纤维二糖水解酶催化剂区域的上游 存在有通过连接区域连接的纤维素结合模块。
[0127] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶含有的纤维素结合模块，只要为具有与纤 维素的结合能力的区域即可，例如与PSA或结晶Avicel (结晶纤维素）的结合能力，其氨基 酸序列并不受特别的限定。作为所述纤维素结合模块，例如，可以使用已知的蛋白质所具有 的纤维素结合模块或对其进行适当改变的模块。此外，在本发明涉及的超耐热性纤维二糖 水解酶具有纤维二糖水解酶催化剂区域和纤维素结合模块的情况下，优选通过连接序列而 结合。所述连接序列的氨基酸序列或其长度等并不受特别的限定。
[0128] 本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，在其他方面，可以在N末端或C末端上， 具有转移至细胞内特定区域的可局部存在的信号肽或向细胞外分泌的信号肽。作为这类信 号肽，例如有质外体转移信号肽、内质网保留信号肽、核转位信号肽、分泌型信号肽等。作为 内质网保留信号肽，例如有由HDEL的氨基酸序列组成的信号肽等。
[0129] 此外，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，在其他方面，为了在使用表达系而 生产的情况下可进行简便提纯，例如可在N末端或C末端，添加各种标签。作为所述标签， 例如可以使用His标签、血球凝集素（Hemagglutinin，HA)标签、Myc标签及Flag标签等广 泛用于改组蛋白质的表达、提纯中的标签。
[0130] [编码超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸]
[0131] 本发明涉及的多聚核苷酸编码本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶。通过将编 入有所述多聚核苷酸的表达载体导入至宿主中，从而能够利用所述宿主的表达系生产所述 超耐热性纤维二糖水解酶。
[0132] 具体而言，本发明涉及的多聚核苷酸为，含有对由下述（a)~（e)的任意一种碱基 序列组成的纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域的多聚核苷酸。
[0133] (a)对SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列所组成的多肽进行编码的碱基序列；
[0134] (b)对由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸 残基（除了 88位的丝氨酸、230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸）的氨基酸序列所组成，且 至少在80°C、pH5. 5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；
[0135] (c)对由与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸 序列（88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸）所组成，且至少在80°C、pH5. 5 的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；
[0136] (d)对与SEQ ID NO :2所示的碱基序列具有80%以上的序列同源性，且至少在 80°C、pH5. 5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；
[0137] (e)对作为与SEQ ID NO :2所示的碱基序列所组成的多聚核苷酸在严格的条件进 行杂交的多聚核苷酸的碱基序列且至少在80°C、pH5. 5的条件下具有纤维二糖水解酶活性 的多肽进行编码的碱基序列。
[0138] 此外，作为本发明及本申请说明书中的"严格的条件"，可列举如Molecular Cloning-A Laboratory Manual Third Edition(Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所记载的方法。可列举出在由6XSSC(20XSSC的组成：3M氯化钠、 〇. 3M柠檬酸溶液、pH7. 0)、5X邓哈特溶液（Denhardt' s solution) (100X邓哈特溶液的组 成：2质量％牛血清白蛋白、2质量％?1(3〇11、2质量％聚乙烯吡咯烷酮）、0.5质量％的505、 0.1mg/ml鞋精子DNA，及50%甲酰胺组成的杂交缓冲液（hybridization buffer)中，通过 在42~70°C下进行数小时至一夜的孵育而使其杂交的条件。此外，作为在孵育后清洗时所 使用的清洗缓冲液，优选含有〇. 1质量％ SDS的I X SSC溶液，更优选含有0. 1质量％ SDS 的0.1 X SSC溶液。
[0139] 在所述（a)~（e)的碱基序列中，简并密码子，优选选择宿主的使用频率高的密码 子。例如，作为所述（a)的碱基序列，也可以是SEQ ID NO :2所示的碱基序列，也可以是不 变更编码的氨基酸序列，将SEQ ID NO :2所示的碱基序列改变为在宿主中使用频率高的密 码子的碱基序列。密码子的改变可通过公知的基因改组技术实施。
[0140] 由SEQ ID NO :2所示的碱基序列组成的多聚核苷酸可以基于碱基序列信息化学合 成，也可以通过对编码AR19G-166的基因（也称作"AR19G-166基因"）的全长或含纤维二 糖水解酶催化剂区域的部分区域进行基因改组技术，从而从自然界获取。AR19G-166基因的 全长或其部分区域，例如，可通过以下方法获得：从自然界中获取含微生物的样本，将从所 述样本中回收的基因组DNA作为模板，使用基于SEQ ID NO :2所示的碱基序列通过常规方 法而设计的正向引物和反向引物进行PCR。也可以将从所述样本中回收的mRNA作为模板， 将通过逆转录反应合成的cDNA作为模板。回收作为模板的核酸的样本，优选为在温泉土壤 等高温环境下获取的样本。
[0141] 所述（d)的碱基序列中，与SEQ IN NO :2所示的碱基序列的序列同源性，只要为 80%以上则没有特别的限定，优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以 上。
[0142] 此外，碱基序列间的序列同源性（相同性）可以通过以下方式求得。使对应的碱基 最多一致地将两个碱基序列并列设置，在相当于插入及缺失的部分引入空隙，求出得到的 校准中的相对于除去空隙的碱基序列整体来说一致的碱基的比例。碱基序列间的序列同源 性，可使用该技术领域中公知的各种相同性检索软件求出。本发明中的碱基序列的序列同 源性的值是以根据公知的相同性检索软件BLASTN得到的校准为基础，通过计算而得到的。
[0143] 例如，由所述（b)或（C)的碱基序列组成的多聚核苷酸，可以分别通过相对于由 SEQ ID NO :2所示的碱基序列组成的多聚核苷酸，至少缺失、取代或添加一个碱基的方式而 进行人工合成。此外，作为所述（b)或（c)的碱基序列，可以是AR19G-166基因的同源基因 的全长序列或其部分序列。AR19G-166基因的同源基因可通过获取碱基序列已知的基因的 同源基因时所使用的基因重组技术而获取。
[0144] 本发明涉及的多聚核苷酸可以只具有编码纤维二糖水解酶催化剂区域的区域，也 可以在所述区域的基础上，还具有编码纤维素结合模块、连接序列、各种信号肽、各种标签 等的区域。
[0145] [表达载体]
[0146] 本发明涉及的表达载体编入有所述本发明涉及的多聚核苷酸，其为：在宿主细胞 中，至少在80°C、pH5. 5的条件下，可表达具有纤维二糖水解酶活性的多肽的表达载体。艮P， 所述表达载体为，可表达所述本发明的超耐热性纤维二糖水解酶的状态编入所述本发明的 多聚核苷酸的表达载体。具体而言，需要从上游将由具有启动子序列的DNA、所述本发明涉 及的多聚核苷酸、具有终止子序列的DNA所组成的表达盒编入到表达载体中。此外，向表达 载体中编入多聚核苷酸时，可使用公知的基因重组技术进行，也可以使用市面出售的表达 载体制作试剂盒。
[0147] 作为所述表达载体，其可以是向大肠杆菌等原核细胞导入的载体，也可以是向酵 母、丝状菌、昆虫培养细胞、哺乳培养细胞、植物细胞等真核细胞导入的载体。作为这些表达 载体，可以根据各自宿主，使用通常所用的任意的表达载体。
[0148] 本发明涉及的表达载体，不仅可以编入所述本发明涉及的多聚核苷酸，优选进一 步编入有耐药性基因等的表达载体。其原因在于，容易进行通过表达载体而形态转化的宿 主与未转化的宿主的挑选。
[0149] 作为所述耐药性基因，例如有卡那霉素耐性基因、潮霉素耐性基因、双丙氨膦耐性 基因等。
[0150] [转化体]
[0151] 本发明涉及的转化体导入有本发明涉及的表达载体。在所述转化体中，可使本发 明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶进行表达。现有公知的纤维二糖水解酶，多为现宿主的 范围狭窄，即，大多难以异种表达。对此，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶能够在大 肠杆菌、酵母、丝状菌、高等植物叶绿体等广泛的表达宿主中表达。即，作为本发明涉及的转 化体，其为导入了本发明涉及的表达载体的大肠杆菌、酵母、丝状菌、高等植物叶绿体等。
[0152] 使用表达载体来制作转化