读框 AR19G-166
[0186] 开放阅读框AR19G-166编码由474氨基酸残基组成的多肽（SEQ ID N0:5)，但 其为缺失了起始密码子的长度不完整序列，仅由连接的部分序列与GH6催化剂区域构 成。AR19G-166的GH6催化剂区域作为基因 AR19G-166RA及AR19G-166QV而被PCR克隆， 显示出与绿弯菌门中温性好氧性细菌橙色滑柱菌DSM 785的GH6糖苷水解酶（基因库： ABX04776. 1)具有66%的氨基酸序列同源性。
[0187] 通过使用了由SEQ ID NO :7所示的碱基序列所组成的正向引物（5' -CACCA TGTTGGACAATCCATTCATCGGAG-3' ：在SEQ ID NO :6所示的碱基序列的5'末端侧添加 有7个碱基（CACCATG)。所述添加序列中，3'侧的ATG为起始密码子，5'侧的CACC 为用于插入到载体的序列）与由SEQ ID NO :8所示的碱基序列所组成的反向引物 (5' -TTAGGGTTGGATCGGCGGATAG-3'）的 PCR 克隆，从 AR19G-166 中得到了 2 个基因克隆 (AR19G-166RA 与 AR19G-166QV)。在 AR19G-166RA 与 AR19G-166QV 所编码的氨基酸序列中， 只有299位和351位的2个氨基酸残基不同。AR19G-166RA的299位的氨基酸残基为精氨 酸，351位的氨基酸残基为丙氨酸。AR19G-166QV的299位的氨基酸残基为谷酰胺，351位的 氨基酸残基为缬氨酸。
[0188] < 6 > 自然变异体（natural variant)的 PCR 克隆
[0189] 相对于所述的5个宏基因组DNA(AR19、0JS2、0JS4、0JS7、0JS9)，使用由SEQ ID NO :7所示的碱基序列所组成的正向引物和由SEQ ID NO :8所示的碱基序列所组成的反向 引物，进行纤维二糖水解酶基因的PCR克隆。采用桑格测序对符合的克隆进行序列解读，各 克隆的基因型与氨基酸变异示于表1及表2。通过对多个宏基因组DNA样本进行PCR克隆， 共计得到46个克隆具有多个SNP的自然变异体。这些变异体表现出 C6t、g51a、a69g、a201g、 c259t、c433t、c450t、g456c、c531t、a627g、a896g、clll6t、c98t(A33V)、t251c(I84T)、 c262t(P88S)、g497a(R166H)、c683t(T228I)、c688t(L230F)、a762t(E254D)、a761g(E254G)、 c805t(R269C)、 a896g(R299Q)、 a916g(S306G)、 cl052t(A351V)、 gl078a(E360K)、 gl216a(A406T)、tl241c(F414S)共计27处SNP(SNP以小文字表示，括号内表示由SNP引起 的氨基酸取代）。该27处的SNP，其中的14处引起了氨基酸变异（表1、表2)。所显示的 这些SNP的克隆，全部都未确认到IN/DEL突变（DNA碱基序列的插入及缺失）。
[0190] [表 1]
[0191]
[0192] [表 2]
[0193]
[0194] 如此得到的46个克隆中，半数以上的29个克隆为变异体AR19G-166QA(以下略称 为QA，SEQ ID NO :3)，其所编码的氨基酸序列中299位的氨基酸残基为谷酰胺、351位的氨 基酸残基为丙氨酸；1个克隆为变异体AR19G-166QV (以下略称为QV，SEQ ID NO :9)其所编 码的氨基酸序列中299位的氨基酸残基为谷酰胺、351位的氨基酸残基为缬氨酸；4个克隆 为变异体AR19G-166RA(以下略称为RA，SEQ ID N0:10)，其所编码的氨基酸序列中299位 的氨基酸残基为精氨酸、351位的氨基酸残基为丙氨酸（表1)。
[0195] 其它的12个克隆为这些QA、RA或QV中的1~3个氨基酸残基变异了的变异体。 12个克隆中，9个克隆为AR19G-166QA所编码的氨基酸序列中1~2个氨基酸残基发生取 代的变异体（表1)。它们是：2个克隆为33位的丙氨酸取代为缬氨酸的QA/A33V ; 1个克隆 为228位的苏氨酸取代为异亮氨酸的QA/T228I ;1个克隆为269位的精氨酸取代为半胱氨 酸的QA/R269C ;1个克隆为254位的谷氨酸取代为甘氨酸的QA/E254G ;2个克隆为306位的 丝氨酸取代为甘氨酸的QA/S306G ;1个克隆为166位的精氨酸取代为组氨酸、360位的谷氨 酸取代为赖氨酸的QA/R166H/E360K ;1个克隆为84位的异亮氨酸取代为苏氨酸、406位的 丙氨酸取代为苏氨酸的QA/I84T/A406T。
[0196] 此外，其它3个克隆为AR19G-166RA所编码的氨基酸序列中1个或3个氨基酸残基 发生了取代的变异体，它们是个克隆为254位的谷氨酸取代为天门冬氨酸的RA/E254D ; 2个克隆为88位的脯氨酸取代为丝氨酸、230位的白氨酸取代为苯丙氨酸、414位的苯丙氨 酸取代为丝氨酸的RA/P88S/L230F/F414S(也称"AR19G-166RASFS"，SEQIDN0 :1)。
[0197] 图 1 表示 AR19G-166RA、AR19G-166QV、AR19G-166QA 及 AR19G-166RASFS 编码的氨 基酸残基的序列的校准。这4种基因为：通过相同的引物试剂盒由高温土壤宏基因组的5 个样本进行PCR克隆的基因。图中，" ?"表示相同的氨基酸残基，被取代的氨基酸残基用 背景标黑的字母表示。
[0198] 出现最频繁的克隆为AR19G-166QA，5种宏基因组DNA共获得29个克隆（表2)。 这 29 个 AR19G-166QA 克隆，在碱基序列中含有 7 处 SNP (c6t、a201g、c259t、c450t、g456c、 c531t、a627g)〇
[0199] 若与AR19G-166QA基因进行比较，AR19G-166RA基因的碱基序列有3处SNP(a51g、 a201g、a896g)(表2)。其中的2处为静默突变，碱基序列51位和201位均是鸟嘌呤取代为 腺嘌呤。剩下的1处为伴随氨基酸取代的SNP，896位的腺嘌呤变异为鸟嘌呤，通过该SNP， 氨基酸序列中的299位氨基酸残基在AR19G-166RA中被精氨酸取代。
[0200] AR19G-166QV基因的碱基序列有1处SNP (表2)。碱基序列1052位的胞嘧啶变异为 胸腺嘧啶，因此，AR19G-166QA所编码的氨基酸序列的351位的氨基酸残基在AR19G-166QV 中由丙氨酸取代为缬氨酸。
[0201] 在这12种AR19G-166SNP变异体中，表现出最高耐热性的AR19G-166RASFS与 AR19G-166QA 相比较，具有 5 处 SNP(a201g、c262t(P88S)、c688t(L230F)、a896g(Q299R)、 tl241c(F414S))(表2)。其中的4处伴随有氨基酸取代，其中的I处与AR19G-166RA相同， 896位的腺嘌呤变异为鸟嘌呤，AR19G-166RASFS所编码的氨基酸序列中，299位的氨基酸残 基取代为精氨酸。另外3处为262位的胞嘧啶变异为胸腺嘧啶、688位的胞嘧啶变异为胸腺 嘧啶、1241位的胸腺嘧啶变异为胞嘧啶，通过这些SNP，分别地在AR19G-166RASFS所编码的 氨基酸序列中，88位的脯氨酸取代为丝氨酸、230位的白氨酸取代为苯丙氨酸、414位的苯 丙氨酸取代为丝氨酸。
[0202] < 7 >氨基酸取代自然变异体的表达及提纯
[0203] 使用热冲击法，将由PCR克隆所得到的质粒导入至蛋白质表达用大肠杆菌 Rosetta-gamiB(DE3)pLysS株（Merck社制）。将携带有目标基因的大肠杆菌接种到含 100mg/L氨苄西林的LB培养基中，培养至OD 6tltl= 0. 2~0. 8左右后，添加 IPTG(异丙 基-β -d-硫代半乳糖苷、Isopropyl- β -D (_) -thiogalactopyranoside)，进一步培养 20 小 时，由此诱导目标蛋白质的表达。培养后，进行离心分离，回收大肠杆菌，加入培养液的1/20 容量的200mM醋酸缓冲液（pH5. 5)，进行悬浮。之后，使用超声波粉碎装置非接触式超声波 破碎仪UCD-200T (BioruptorUCD-200T) (CosmoBio社制），在进行30秒粉碎后停止30秒， 重复该处理程序10次，获得含有氨基酸被取代的目标蛋白质的上清液，将其作为粗酶样本 液。
[0204] 通过SDS-PAGE解析，确认了粗酶样本液中的目标蛋白质。图2所示为AR19G-166 基因的自然变异体所编码的纤维二糖水解酶酶蛋白质的SDS-PAGE解析（CBB染色）的结 果。
[0205] 将粗酶样本液填充到用50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH8. 0)进行平衡化的离子交 换柱HiTrap Q HP (GE HEALTHCARE社制）中，使用中高压液体层析系统AKTA design (GE HEALTHCARE社制），以0~50%的浓度制备，通过含有IM的NaCl的50mM Tris-HCl缓冲溶 液（PH8.0)对蛋白质进行分级。具有纤维二糖水解酶活性的级分在集中混合后，通过离心 式超过滤膜VIVASPIN 20(赛多利斯（SARTORIUS STEDM)社制），向含750mM硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH8. 0)中进行溶液交换。将溶液交换后的纤维二糖水解酶活性级分填 充到用相同液体进行平衡化的疏水性相互作用分离柱HiTrap Phnenyl HP (GE HEALTHCARE 社制）中，以100~〇%的浓度制备，用50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH8. 0)将蛋白质溶出。 具有纤维二糖水解酶活性的级分在集中混合后，用VIVASPIN 20进行浓缩，直至液量为8mL 左右。将浓缩的样本添加到用含有150mM的NaCl的50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH8. 0)进 行平衡化的凝胶过滤柱Hiload26/60superdex200PG (GE HEALTHCARE社制）中，使体积为柱 体积的1~1. 5倍的相同缓冲溶液以流速2~3mL/min流动，由此进行分级。具有纤维二 糖水解酶活性的级分在集中混合后，向50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH8. 0)进行溶液交换并 浓缩，得到最终浓度约为lmg/mL的提纯酶样本液。
[0206] < 8 >以PSA作为底物的纤维二糖水解酶活性测定（PSA水解活性）
[0207] 在纤维二糖水解酶活性测定中，将磷酸膨润纤维素（PSA)用作底物。PSA按照以下 方法制备：首先，在磷酸溶液中溶解Avicel粉末（微结晶性纤维素粉末，MERCK社制），之后 加入灭菌蒸馏水使其析出后，清洗至PH5.0以上。此外，在之后的实验中所使用的PSA均按 此法制备。
[0208] 用于PSA活性测定的反应溶液的组成是由最终浓度为0. 5%的PSA溶液、50mM醋 酸缓冲溶液（PH5. 5)、适当进行稀释的粗酶样本液（上述< 7 >中制备的）组成，在50~ 90°C下使该反应溶液反应20分钟。反应完成后，通过分光光度计（540nm)测定使用3, 5-二 硝基水杨酸试剂（3,5-dinitrosalicylic acid reagent，DNSA)进行水解的还原端量，使用 由葡萄糖制成的校正曲线来计算还原糖量，通过与对照组的差来计算出通过酶的水解而生 成的还原糖量。将最高的还原糖量的值设为100,以相对值测绘各温度下的还原糖量。
[0209] PSA活性测定结果如图3所示。由高温土壤宏基因组DNA克隆的所有纤维二糖 水解酶酶基因 AR19G-166的氨基酸取代变异体，显示出PSA水解活性。AR19G-166QV及 AR19G-166QA的氨基酸取代变异体的最适温度，比AR19G-166RA及AR19G-166RA的氨基 酸取代变异体要低。在QA/T228I中为T_= 80°C，QA/S306G中为Ttjpt= 70°C，其余的 AR19G-166QA的氨基酸取代变异体中为Ttjpt= 75°C。另一方面，AR19G-166RA及其氨基酸取 代变异体RA/E254D中为Ttjpt= 80°C，AR19G-166RA的氨基酸取代变异体AR19G-166RASFS 中显示为Ttjpt > 90 °C。
[0210] 在人为引起突变的DE法中，产生庞大数量的功能缺失变异体，徒劳性质的功能试 验非常多。然而，通过本发明涉及的自然变异体获取方法克隆的多个变异体均具有酶活性， 从由比较少的克隆所构成的变异体库中，可得到在15°C以上也具有高的热稳定性的纤维二 糖水解酶 AR19G-166RASFS。
[0211] < 9 >酶特性的探讨
[0212] 对于在PSA水解活性试验中显示出最高最适温度1^的AR19G-166RA的3个氨基 酸（P88S/L230F/F414S)变异体AR19G-166RASFS，提纯酶蛋白质，对于底物特异性、pH特性、 温度特性（最适温度及热稳定性），详细地测定了酶特性。
[0213] (底物特异性）
[0214] 底物特异性通过使用PSA、Avicel粉末、羧甲基纤维素（CMC，Sigma社制）、木聚糖 (from Beechwood，Sigma 社制）、地衣多糖（Lichenan，MP Biomedicals 社制）、海带多糖 (from Laminaria digitata，Sigma社制）进行测定。反应溶液由100 μ 1各底物的1 %水 溶液、50 μ 1的200mM醋酸缓冲溶液（ρΗ5. 5)、40 μ 1提纯水及10 μ 1提纯酶样本液组成，使 反应溶液在70°C下反应20分钟。通过与所述<8 >相同的方法，求出通过酶的水解而生成 的还原糖量，计算比活性（U/mg)。各自的计算通过三次独立的试验来进行，求出平均值和标 准误差。
[0215] 测定结果如图4所示。AR19G-166RASFS相对于水溶性磷酸膨润纤维素 PSA显示出 高的水解活性，此外，相对于β_1，3键和β-1，4键葡聚糖组成的地衣多糖，显示出分解活 性（0. 12553U/mg)。另一方面，相对于由CMC或β-1，3键和β-1，6键葡聚糖组成的海带多 糖，几乎不显示分解活性。相对于结晶性纤维素 Avicel，水解活性非常弱（0. 08606U/mg)， 但在2小时反应时间的试验中，显示出明显的水解活性（0. 18001U/mg)。相对于木聚糖不显 示水解活性（〇. 〇15U/mg)。
[0216] (温度依存性）
[0217] 对基于AR19G-166RASFS的PSA水解活性的温度依存性进行考察。PSA水解活性为， 以100 μ I 1 % PSA溶液、50 μ 1醋酸缓冲溶液（pH5. 5)、40 μ 1提纯水、10 μ 1提纯酶样本液 作为反应溶液的组成，在50、60、65、70、75、80、85、90、95或99°C下使其反应20分钟。求出 由酶的水解反应而生成的还原糖量，将在1分钟内生成1 μ mol还原