用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法
【专利说明】用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法
[0001 ] 本发明申请是基于申请日为2010年3月31日、申请号为"201080014596.0"(国际申 请号为PCT/EP2010/054290)，名称为"用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法"的发明专 利申请的分案申请。
[0002] 关于序列表
[0003] 本申请包括计算机可读形式的序列表。通过述及将该计算机可读形式收入本文。 发明领域
[0004] 本发明设及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的酶促方法及此类水解产物 的用途，例如在婴儿配方组合物中。
[0005] 发明背景
[0006] 已经开发了婴儿配方，其容许取代母乳喂养婴儿。
[0007] 此类婴儿配方应当完全满足婴儿的营养要求，直到引入适宜的补充喂食。另外，味 道是重要的，因为至少家长更喜欢没有苦味的婴儿配方。代替普通牛奶，包含水解的乳蛋白 质(例如部分水解的乳清蛋白质或广泛水解的酪蛋白）的婴儿配方常常用作此类配方，变应 原性较低且仍具有可接受的味道。
[000引文献中记载的用于制备部分水解产物的方法常常包括使用膜酶，诸如通过对猪膜 组织的提取生产的膜蛋白酶制备物(参见例如W09304593A1，US5039532A)。记载的一些方法 包括使用膜蛋白酶和糜蛋白酶的混合物。例如EP0353122A披露了一种使用膜蛋白酶和糜蛋 白酶的混合物来制备低变应原性乳清蛋白质水解产物的方法，其中糜蛋白酶/膜蛋白酶活 性的比例为1.5-3.0。在EP0631731A1中，WUSP单位计，具有1.3至18、更优选4至6的膜蛋白 酶对糜蛋白酶比例的膜蛋白酶和糜蛋白酶混合物据说通常产生具有期望特性的水解产物。
[0009] 出于几个原因，使用自微生物生成的蛋白水解酶可赋予益处。例如，自微生物生产 酶高效且易于控制。因此，可大量地且高纯度地生产此类酶。还有，使用微生物酶会有助于 克服在自动物来源提取酶方面与QA升高有关的困难。
[0010] 本发明的发明人的一个目标是开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的基于 乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的蛋白质水解产物具有低变应原性。另一个目标是 开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的基于乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的 蛋白质水解产物具有与用包含膜蛋白酶和糜蛋白酶的提取制备物制备的水解产物的蛋白 质片段谱相似的蛋白质片段谱。另一个目标是开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的 基于乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的蛋白质水解产物具有可接受的味道。特别地， 非常希望获得如下的部分乳清蛋白质水解产物，其具有低变应原性，具有与用包含膜蛋白 酶和糜蛋白酶的提取制备物制备的水解产物的蛋白质片段谱相似的蛋白质片段谱，和/或 具有可接受的味道，特别是在苦味方面。
[00川发明概述
[0012]本发明的发明人令人惊讶地发现由微生物生成的酶可用于生产基于乳的蛋白质 水解产物，例如供包括在婴儿配方中。
[0013] 因此，本发明设及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，其包括用a)自 微生物生成的膜蛋白酶样内肤酶和b)至少一种自微生物生成的其它内肤酶处理基于乳的 蛋白质材料(proteinaceous material)的溶液。
[0014] 具体地，本发明设及如下各项：
[0015] 1.-种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，其包括用a)自微生物生成的膜 蛋白酶样内肤酶和b)至少一种自微生物生成的其它内肤酶处理基于乳的蛋白质材料的溶 液。
[0016] 2.依照项1的方法，其中该膜蛋白酶样内肤酶源自镶抱属(Fusarium)的菌株。
[0017] 3.依照前述项任一项的方法，其中该膜蛋白酶样内肤酶选自下组：
[0018] i)包含氨基酸序列的多肤，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:2、4或6任一的成熟多肤 具有至少60 %同一性；
[0019] ii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸在至少低严格条件下与下述杂交：（i) SEQ ID NO: 1、3或5任一的成熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID NO: 1、3或5任一的成熟多肤 编码序列的基因组DNA序列，或QiiKi)或（ii)的全长互补链；
[0020] iii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸包含与SEQ ID N0:l、3或5任一的成熟 多肤编码序列具有至少60%同一性的核巧酸序列;和
[0021] iv)SEQ ID NO: 2、4或6任一的成熟多肤的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、 缺失、和/或插入的变体。
[0022] 4.依照前述项任一项的方法，其中膜蛋白酶样内肤酶对基于乳的蛋白质的比例为 0.01-10%重量/重量、优选0.01-5%、更优选0.05-2.5%、甚至更优选0.5-1 %。
[0023] 5.依照前述项任一项的方法，其中该至少一种其它内肤酶对在酪氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸的簇基末端侧处的切割具有比在精氨酸和赖氨酸的簇 基末端侧上的切割更高的特异性。
[0024] 6.依照前述项任一项的方法，其中该至少一种其它内肤酶具有至少3的糜蛋白酶 比例。
[0025] 7.依照前述项任一项的方法，其中该至少一种其它内肤酶是源自拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)、绿僵菌属(Metarhizium)或小枝抱属(Brachysporiella)的菌株。
[0026] 8.依照前述项任一项的方法，其中该至少一种其它内肤酶选自下组：
[0027] i)包含氨基酸序列的多肤，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:8、10或12任一的成熟多 肤具有至少60 %同一性；
[0028] ii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸在至少低严格条件下与下述杂交：（i) SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多 肤编码序列的基因组DNA序列，或QiiKi)或（ii)的全长互补链；
[0029] iii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸包含与SEQ ID N0:7、9或11任一的成 熟多肤编码序列具有至少60%同一性的核巧酸序列;和
[0030] iv)SEQ ID NO: 8、10或12任一的成熟多肤的包含一个或多个(几个)氨基酸的取 代、缺失、和/或插入的变体。
[0031] 9.依照前述项任一项的方法，其中至少一种其它内肤酶对基于乳的蛋白质的比例 为0.001-1 %重量/重量、优选0.OOl-0.5%、更优选0.005-0.25%、甚至更优选0.02-0.1 %。
[0032] 10.依照前述项任一项的方法，其中基于内肤酶的重量，W膜蛋白酶样内肤酶添加 浓度的2%-50%的浓度添加该至少一种其它内肤酶。
[0033] 11.依照前述项任一项的方法，其中在约40°C至60°C的溫度，在范围6.5至8.5的抑 值在1至6小时的过程中进行水解。
[0034] 12.依照前述项任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物具有5-30 %、优选10-25 %和更优选12-20 %的水解程度。
[0035] 13.依照前述项任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物由肤构成，其中W重量 计，少于1 %具有20，OOOkDa W上的分子量。
[0036] 14.依照前述项任一项的方法，其中根据化ISA的测量，获得的蛋白质水解产物的 抗原性相对于相应的未水解的基于乳的蛋白质材料具有至少约80%、优选至少约85%、更 优选至少约90 %或至少约95 %、最优选至少约98 %、和甚至最优选至少约99 %的降低。
[0037] 15.依照前述项任一项的用于制备婴儿配方组合物的方法，其进一步包括将获得 的基于乳的蛋白质水解产物包括在婴儿配方组合物中的步骤。
[003引附图简述
[0039] 图1显示与猪膜蛋白酶(上部描记线）相比，镶抱属(Fusarium)膜蛋白酶(底部描记 线）的UV层析图，而且显示了一些主峰的肤序列身份。
[0040] 图2显示与牛糜蛋白酶（上部描记线）相比，小枝抱属（Brachysporiella)蛋白酶 (底部描记线）的UV层析图，而且显示了一些主峰的肤序列身份。
[0041] 发明详述
[0042] 在依照本发明的方法中，使用基于乳的蛋白质材料作为起始材料。此类基于乳的 蛋白质材料可例如由基于乳清的蛋白质材料、酪蛋白或基于乳清的蛋白质材料和酪蛋白的 混合物组成。基于乳清的蛋白质材料可来源于自奶酪制备获得的乳清，特别是甜乳清诸如 用粗制凝乳酶(rennet)使酪蛋白凝固而产生的。基于乳清的蛋白质材料也可W在35-80% 蛋白质的范围中的浓缩物的形式使用，如通过超滤(UF乳清）或自乳清蛋白质分离物获得 的。任选地，此基于乳清的蛋白质材料也可通过离子交换和/或电渗析化D乳清)来去除矿物 质。在一个优选的实施方案中，基于乳的蛋白质材料是乳清蛋白质浓缩物(WPC)。
[0043] 酪蛋白来源可W是酸性酪蛋白或无脂乳固体。
[0044] 基于乳清的蛋白质材料和/或该酪蛋白可W如液体浓缩物或粉的形式使用。
[0045] 在一个优选的实施方案中，基于乳的蛋白质材料是基于乳清的蛋白质材料。在一 个更优选的实施方案中，此类基于乳清的蛋白质材料的来源是已去除酪蛋白-糖-巨肤 (CGMP)的甜乳清或乳清蛋白质分离物。在一个甚至更优选的实施方案中，此类基于乳清的 蛋白质材料的来源是已去除酪蛋白-糖-巨肤的甜乳清。
[0046] 自甜乳清去除CGMP产生苏氨酸含量接近人乳的蛋白质材料。然后可给此经修饰甜 乳清补充含量低的那些氨基酸(主要是组氨酸和精氨酸）dEP880902中记载了一种用于自甜 乳清去除CGMP的方法。
[0047] 对于本发明的方法，将蛋白质材料稀释或重建成溶液或悬浮液，优选地包含W重 量计2-35 %左右、更优选W重量计5-30 %左右的蛋白质材料。
[004引在本发明的方法中，用至少两种均自微生物生成的内肤酶处理基于乳的蛋白质材 料。
[0049] 要在本发明的方法中使用的此类内肤酶可W是自任何属的微生物生成的。就本发 明而言，如本文中与给定生物体联合使用的，术语"自…生成"应当表示依照本发明使用的 多肤是通过给定生物体的细胞的发酵而生成的。多肤对于生成它的生物体可W是天然的， 或者它可W自其中插入有编码该多肤的核巧酸序列的宿主生物体异源生成。
[0050] 要在依照本发明的方法中使用的内肤酶之一是膜蛋白酶样内肤酶。术语"膜蛋白 酶样内肤酶"在本文中定义为优先在精氨酸和/或赖氨酸的心异构体的C端侧处切割肤或蛋 白质的内肤酶。
[0051 ]在一个优选的实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶优先在精氨酸和赖氨酸的C端侧处 切割肤或蛋白质。运表示内肤酶对于在精氨酸和赖氨酸二者后面的切割具有比在任何其它 氨基酸后面的切割更高的特异性。
[0052] 在另一个优选的实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶优先在精氨酸或赖氨酸的C端侧 处切割肤或蛋白质。运表示内肤酶对于在精氨酸或赖氨酸任一后面的切割具有比在任何其 它氨基酸后面的切割更高的特异性。
[0053] 在另一个优选的实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶优先在精氨酸的C端侧处切割肤 或蛋白质。运表示内肤酶对于在精氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更 高的特异性。
[0054] 在另一个优选的实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶优先在赖氨酸的C端侧处切割肤 或蛋白质。运表示内肤酶对于在赖氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更 高的特异性。
[0055] 在另一个优选的实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶特异性地在精氨酸和赖氨酸的C 端侧处切割肤或蛋白质。
[0056] 在一个优选的实施方案中，依照本发明的膜蛋白酶样内肤酶具有超过100的膜蛋 白酶比例，其中该膜蛋白酶比例是W在Arg或Lys(无论哪个更大)后面切割时酶的活性除W 在八1日、439、6111、11日、1^日11、]\1日1:、陆日或￥日1(无论哪个更大)任一后面切割时酶的活性测定的。 良P，在一个优选的实施方案中，依照本发明的膜蛋白酶样内肤酶对于在Arg或Lys(无论哪个 更大）后面的切割具有特异性，其为在41日、439、6111、11日、1^日11、1日*、？11日或￥日1(无论哪个更 大)任一后面的切割的特异性的至少100倍。此类测定膜蛋白酶比例的活性测量应当在内肤 酶的活性为该内肤酶在其最适抑时的活性的至少一半的抑值实施。膜蛋白酶比例可W如本 申请实施例1所述来测定。
[0化7] 通常，此类膜蛋白酶样内肤酶在约6.0至约11.0的抑、优选在约8至约10的抑，及在 约40°C至约70°C的溫度、优选在约45 °C至约65 °C或约45 °C至约60°C的的溫度具有最佳蛋白 水解活性。
[0058] 在一个优选