备物 中的酶浓度。在20mM皿PES/化0H，5mM CaCl2，pH 8中溶解PTN。在融化后"原态"使用其它 酶。
[0200] 水解：
[0201] 在抑 8.0的 1.0M 肥阳S/rM)H、50mM CaCb中悬浮84mg/ml WPCXLac巧rodanSO,来 自Arla,包含总干物质约80%的蛋白质），并用27 %化OH将pH调整至pH 8.0。在冰上在 Eppendo计管中放置1000山此悬浮液。添加肤酶溶液，并将化pendorf管转移至预热至 55°C的化pendorf热混合仪。将管在热混合仪(55°C，140化pm)上溫育120分钟。然后将管转 移至另一预热至90°C的化pendorf热混合仪，并在此热混合仪(90°C，140化pm)上溫育5分 钟。将管转移回第一 55°CEppendorf热混合仪，并在5分钟后(使水解混合物回至55°C)添加 25山肤酶溶液，并将管在该热混合仪(55°C，14(K)巧m)上溫育30分钟。最后，再次将管转移至 90°C热混合仪，在此热混合仪(90°C，140化pm)上溫育10分钟。
[0202] 通过SDS-PAGE(未显示）来分析水解产物(含64mg/ml乳清蛋白质）并使用OPA方法 来测量DH。
[020；3] SDS-PAGE:
[0204] 将水解产物在0.1%SDS中稀释5倍。将此稀释液与含还原剂的2x SDS-PAGE样品缓冲液混合。将此混合物煮沸并将IOiil应用于4-20%Tris-甘氨酸凝胶。
[0205] 用于测量DH的OPA方法：
[0206] 将水解产物在0.01 %化iton X-IOO中稀释80倍。将30iil此稀释液转移至微量滴定 板(MTP)并添加 22化1新鲜制备的OPA试剂并在2分钟后在MTP读数仪中读取340nm处的吸光 度。将未知样品的响应与丝氨酸标准稀释系列比较并表述为mg/ml丝氨酸。W "mg/ml水解产 物中的丝氨酸"相对于"mg/ml底物"来计算％PA响应"。为了计算DH，减去酶空白的％PA响 应，。
[0207] OPA 试剂：
[0208] 在80ml去离子水中溶解3.81g四棚酸二钢(Merck 6308)和1.00gSDS(BI0-RAD 161-0301)。临使用前，添加在2.Oml乙醇中溶解的SOmg邻献二醒(Merck 821027)和1.0ml 10% (w/v)DTE(Merck 24511)。最后，用去离子水将体积调整至100mL。
[0209]数据;
脚。结论;
[0213] 看来有可能使用微生物PTN代替物（剂量与PTN-样）给出相同的WPC水解程度 (DH)。根据结果显然的是，单独的膜蛋白酶样蛋白酶不能给出与PTN相同的DH。
[0214] 实施例3:镶抱属膜蛋白酶和小枝抱属内肤酶的切割特异性分析 脚引 引言;
[0216]将微生物膜蛋白酶样内肤酶，镶抱属膜蛋白酶的蛋白水解切割特异性与猪膜蛋白 酶进行了比较。而且，将来自小枝抱属的微生物糜蛋白酶样内肤酶的蛋白水解切割特异性 与经化CK处理的猪糜蛋白酶的蛋白水解特异性进行了比较。（化CK灭活膜蛋白酶活性，而对 糜蛋白酶没有影响）。
[0217] 实施了切割特异性分析，即，将所述内肤酶与变性模式底物牛0-乳球蛋白A-起溫 育。通过与用于蛋白质鉴定的串联质谱数据分析程序(SEQ肥ST)和只含有牛0-乳球蛋白A的 数据库组合的在线RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS来测定所得蛋白水解肤的序列。
[0218] 样品:
[0219]蛋白酶:猪膜蛋白酶(UniProt编号:P00761)
[0220] 镶抱属膜蛋白酶(来自尖镶抱的膜蛋白酶样蛋白酶，SEQ ID N0:2)
[0221] 牛经IlXK处理的糜蛋白酶（Sigma, C-3142)
[0222] 小枝抱属蛋白酶(来自美丽小枝抱，SEQ ID NO. 12)
[0223] 底物:0-乳球蛋白A，来自牛乳(Sigma L7880097K7010)
[0。4] 蛋白水解:
[02巧]0-乳球蛋白A的变性：
[0226] 在Iml缓冲液（IOOmM乙酸锭、ImM化C12P册）中溶解大约Ilmg量的来自牛乳（Sigma L7880097K7010)的(6-乳球蛋白A。通过添加二硫苏糖醇(DTT，CAS No. 3483-12-3)至终浓度 20mM来还原0-乳球蛋白的二硫桥。将混合物于室溫(25°C)溫育30分钟。随后，添加2-舰乙酷 胺(CAS No. 144-48-9)至终浓度55mM。将后一混合物在黑暗中在室溫溫育30分钟。
[0227] 在与蛋白酶一起溫育之前，将变性0-乳球蛋白A缓冲液交换至IOOmM乙酸锭、ImM CaCb抑8。缓冲液交换是在来自GE-healthcare的PD-IO脱盐柱（Sephadex G-25柱材料）上 实施的。首先，用25ml的IOOmM乙酸锭、ImM化C12P册平衡柱。用平衡缓冲液将0-乳球蛋白样 品体积调整至终体积2.5ml，并加载到柱上。用3.5ml的IOOmM乙酸锭、ImM化Cl2pH8洗脱0-乳球蛋白A。通过估算的消光(A280)系数1和280nm处的分光光度法分析，测定缓冲液交换的 e-乳球蛋白的蛋白质终浓度为2mg/ml。 帷引蛋白水解溫育:
[0229] 将与19化1溶液对应的40化g量的0-乳球蛋白与下述量的蛋白酶一起在40°C溫育： 猜膝蚕白:酶 8 Jig 嫌抱属肢蛋白酶 16 Hg
[0230] , 牛经化CK处理的履蛋白酶 4峭 小枝抱属蛋白酶 4腿
[0231] 18小时后通过添加10%S氣乙酸(TFA，CAS No.76-05-1)水溶液至样品中TFA终浓 度1 %来终止蛋白水解过程。在通过LC-MS/MS来分析之前，将所有样品胆藏于-20°C。 脚。LC-MS/MS 方法:
[023；3]在由WatersC18柱（ACQU^TLJPLC彩邸HC18，1.7皿，2.1x100 mm)、Accela液体 层析系统（来自T'hermo Scientific)和LTQ Orbitrap XL ETD混合质谱仪（来自！"Iiermo Scientific)组成的RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS系统上分析了所有蛋白水解样品。将20y 1体积注射到柱上。通过下述梯度将肤分开：
[0234]溶剂A:UHQ水中的0.1% 甲酸(CAS No.64-18-6)和溶剂B:乙腊(CAS No.75-05-8) 中的0.1%甲酸
[0236] 通过UV检测仪在214nm在线地，随后通过质谱仪WMS/MS模式在线地监测洗脱肤。 所得UV-层析图显示于图1和2。在质谱仪中，W30,000(FWHM)的分辨率检测前体离子，W15, OOO(FWHM)的分辨率检测片段离子。用SEQ肥ST软件（美国专利6,017,693和5,538,897的算 法）经Proteome DiscovererQ.0版，Thermo Fisher Scientific)针对0-乳球蛋白分析了 所得MS和MS/MS谱。切割酶定义为具有"非特异的"切割特异性的"无-酶"。鉴定了一些高强 度UV峰的蛋白水解片段，如图1和2所示。 脚7]
[0238]为了比较，在图1中，与猪膜蛋白酶测定法(上部描记线)一起显示了镶抱属膜蛋白 酶测定法的UV层析图（底部描记线），而且显示了一些主要肤的序列身份。类似地，在图2中， 与牛糜蛋白酶(上部描记线)一起显示了小枝抱属蛋白酶测定法的UV层析图（底部描记线）。 在所有情况中，在上部和底部描记线中都检测出所鉴定的肤。
[OZ39]结论;
[0240]在图1中，对镶抱属膜蛋白酶和猪膜蛋白酶检测出牛0-乳球蛋白A的常见蛋白水解 肤，因此运两种内切蛋白酶都具有膜蛋白酶样特异性。在图2中，对小枝抱属蛋白酶和牛糜 蛋白酶检测出牛e-乳球蛋白A的一些常见蛋白水解肤。
【主权项】
1. 一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，其包括用a)自微生物生成的胰蛋白 酶样内肽酶和b)至少一种自微生物生成的其它内肽酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液。2. 依照权利要求1的方法，其中该胰蛋白酶样内肽酶源自镰孢属(Fusarium)的菌株。3. 依照前述权利要求任一项的方法，其中该胰蛋白酶样内肽酶选自下组： i) 包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 2、4或6任一的成熟多肽具有 至少60 %同一*性； ii) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：（i)SEQ ID N0:l、3或5任一的成熟多肽编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:l、3或5任一的成熟多肽编码 序列的基因组DNA序列，或或（ii)的全长互补链； iii) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1、3或5任一的成熟多肽 编码序列具有至少60%同一性的核苷酸序列;和 iv) SEQ ID NO:2、4或6任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、 和/或插入的变体。4. 依照前述权利要求任一项的方法，其中胰蛋白酶样内肽酶对基于乳的蛋白质的比例 为0.01-10%重量/重量、优选0.01-5%、更优选0.05-2.5%、甚至更优选0.5-1 %。5. 依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶对在酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸的羧基末端侧处的切割具有比在精氨酸和赖氨酸的 羧基末端侧上的切割更高的特异性。6. 依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶具有至少3的糜蛋白 酶比例。7. 依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶是源自拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)、绿僵菌属(Metarhizium)或小枝抱属(Brachysporiella)的菌株。8. 依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶选自下组： i) 包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:8、10或12任一的成熟多肽具 有至少60 %同一性； ii) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：（i)SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多肽编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多肽编 码序列的基因组DNA序列，或或（ii)的全长互补链； iii) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多 肽编码序列具有至少60%同一性的核苷酸序列;和 iv) SEQ ID N0:8、10或12任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺 失、和/或插入的变体。9. 依照前述权利要求任一项的方法，其中至少一种其它内肽酶对基于乳的蛋白质的比 例为0.001-1 %重量/重量、优选0.001-0.5 %、更优选0.005-0.25 %、甚至更优选0.02-0.1%〇10. 依照前述权利要求任一项的方法，其中基于内肽酶的重量，以胰蛋白酶样内肽酶添 加浓度的2 % -50 %的浓度添加该至少一种其它内肽酶。11. 依照前述权利要求任一项的方法，其中在约40 °C至60 °C的温度，在范围6.5至8.5的 pH值在1至6小时的过程中进行水解。12. 依照前述权利要求任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物具有5-30 %、优选 10-25 %和更优选12-20 %的水解程度。13. 依照前述权利要求任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物由肽构成，其中以重 量计，少于1 %具有20，OOOkDa以上的分子量。14. 依照前述权利要求任一项的方法，其中根据ELISA的测量，获得的蛋白质水解产物 的抗原性相对于相应的未水解的基于乳的蛋白质材料具有至少约80%、优选至少约85%、 更优选至少约90 %或至少约95%、最优选至少约98%、和甚至最优选至少约99 %的降低。15. 依照前述权利要求任一项的用于制备婴儿配方组合物的方法，其进一步包括将获 得的基于乳的蛋白质水解产物包括在婴儿配方组合物中的步骤。
【专利摘要】本发明涉及用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，具体地涉及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的酶促方法及此类水解产物的用途，例如在婴儿配方组合物中。
【IPC分类】C12N9/52, C12N9/76, A23L33/18, C12N9/58, C12N9/64, A23L33/19
【公开号】CN105661553
【申请号】CN201610014090
【发明人】P.R.奥斯特加德, S.厄恩斯特, G.B.林格莱夫
【申请人】诺维信公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2010年3月31日
【公告号】CA2773686A1, CN102378581A, EP2413720A1, US9259023, US20100255153, WO2010112546A1