酸、谷氨酷胺、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、 脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和鄉氨酸任一的簇基末端侧处的切割的特异性的至少3倍、优选至 少5倍。
[0096] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶对于在来自由酪氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸组成的组的至少=种氨基酸每一种的簇基末端侧 处的切割具有比在精氨酸的簇基末端侧上的切割更高的特异性。
[0097] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶对于在来自由酪氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸组成的组的至少=种氨基酸每一种的簇基末端侧 处的切割具有比在赖氨酸的簇基末端侧上的切割更高的特异性。
[0098] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶对于在酪氨酸、苯丙氨酸、色 氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸每一种的簇基末端侧处的切割具有比在精氨酸和赖氨酸 二者的簇基末端侧上的切割更高的特异性。
[0099] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶具有至少3、优选至少5的糜 蛋白酶比例。至少5的糜蛋白酶比例表示在化e、Leu或Met (无论哪个更大)之一后面切割时 酶的活性是在Ala、Arg、Asp、Glu、lie、Lys或Val (无论哪个更大)任一后面切割时的活性的 至少5倍。即，该至少一种其它内肤酶对于在化e、Leu或Met(无论哪个更大)之一后面的切割 具有特异性，其为在41曰、4'旨、439、6111、116、1^73或化1(无论哪个更大)任一后面的切割的特 异性的至少3倍、优选至少5倍。此类测定糜蛋白酶比例的活性测量应当在内肤酶的活性为 该内肤酶在其最适pH时的活性的至少一半的抑值实施。糜蛋白酶比例可W如本申请实施例 1所述来测定。
[0100] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶是细菌内肤酶。在一个更优 选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的菌株、优选 自拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NR化18262(先前记载于例如WO 88/03947)。例如，它可 具有本申请的SEQ ID N0:8的成熟多肤的氨基酸序列。源自拟诺卡氏菌NR化18262的蛋白 酶的DNA和氨基酸序列先前已经公开于例如DK专利申请No. 199600013。
[0101] 在另一个更优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶源自绿僵菌属 (Metarhizium)、优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，例如具有本申请的SEQ ID ^:10的成熟多肤的氨基酸序列的（13618^99￥843)。在另一个更优选的实施方案中，该至 少一种其它内肤酶源自小枝抱属、优选美丽小枝抱(Brachysporiella gayana)，例如具有 本申请的SEQ ID NO: 12的成熟多肤的氨基酸序列(CGMCC 0865)。源自金龟子绿僵菌和美丽 小枝抱的蛋白酶的DNA和氨基酸序列先前已经公开于例如W004072279。
[0102] 在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肤酶是自细菌生成的。
[0103] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶选自下组：
[0104] i)包含氨基酸序列的多肤，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:8、10或12任一的成熟多 肤具有至少60 %同一性；
[0105] ii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸在至少低严格条件下与下述杂交：（i) SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多 肤编码序列的基因组DNA序列，或QiiKi)或（ii)的全长互补链；
[0106] iii)由多核巧酸编码的多肤，所述多核巧酸包含与SEQ ID N0:7、9或11任一的成 熟多肤编码序列具有至少60%同一性的核巧酸序列;和
[0107] iv)SEQ ID NO: 8、10或12任一的成熟多肤的包含一个或多个(几个)氨基酸的取 代、缺失、和/或插入的变体。
[010引 SEQ ID NO: 10的成熟多肤可W是氨基酸187-374dSEQ ID NO: 12的成熟多肤可W 是氨基酸190-375。
[0109] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含与SEQ ID N0:8 的成熟多肤具有至少60 %、优选至少70%或至少80 %、更优选至少85%或至少90 %、甚至更 优选至少95%、和最优选至少98%同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案 中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID N0:8的成熟多肤的氨基酸序列。在本发明的另一个 更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID N0:8的氨基酸1至188。在本发明的 一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID N0:8的成熟多肤的氨基酸 序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID N0:8的氨基酸1至188组成。
[0110] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含与SEQ ID NO: 10 的成熟多肤具有至少60%、优选至少70%或至少80%、更优选至少85%或至少90%、甚至更 优选至少95%、和最优选至少98%同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案 中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID NO: 10的成熟多肤的氨基酸序列。在本发明的另一 个更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID NO: 10的氨基酸187至374。在本 发明的一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID NO: 10的成熟多肤的 氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID NO: 10的氨基酸187至374组成。
[0111] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含与SEQ ID NO: 12 的成熟多肤具有至少60%、优选至少70%或至少80%、更优选至少85%或至少90%、甚至更 优选至少95%、和最优选至少98%同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案 中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID NO: 12的成熟多肤的氨基酸序列。在本发明的另一 个更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶包含SEQ ID NO: 12的氨基酸190至375。在本 发明的一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID NO: 12的成熟多肤的 氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由SEQ ID NO: 12的氨基酸190至375组成。
[0112] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述寡核巧酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格 条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：（i)SEQ ID N0:7的成 熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:7的成熟多肤编码序列的基因组DNA序列，或（iii) (i)或（ii)的全长互补链。
[0113] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述寡核巧酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格 条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：（i)SEQ ID N0:9的成 熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:9的成熟多肤编码序列的基因组DNA序列，或（iii) (i)或（ii)的全长互补链。
[0114] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述寡核巧酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格 条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：（i)SEQ ID NO: 11的 成熟多肤编码序列，（ii)包含SEQ ID N0:11的成熟多肤编码序列的基因组DNA序列，或 QiiKi)或（ii)的全长互补链。
[0115] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述多核巧酸包含与SEQ ID N0:7的成熟多肤编码序列具有至少60%、优选至少70%或至少 80 %、更优选至少85%或至少90 %、甚至更优选至少95 %、和最优选至少98 %同一性的核巧 酸序列。
[0116] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述多核巧酸包含与SEQ ID N0:9的成熟多肤编码序列具有至少60%、优选至少70%或至少 80 %、更优选至少85%或至少90 %、甚至更优选至少95 %、和最优选至少98 %同一性的核巧 酸序列。
[0117] 在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肤酶由多核巧酸编码，所 述多核巧酸包含与SEQ ID NO: 11的成熟多肤编码序列具有至少60%、优选至少70%或至少 80 %、更优选至少85%或至少90 %、甚至更优选至少95 %、和最优选至少98 %同一性的核巧 酸序列。
[011引在本发明的另一个优选实施方案中，膜蛋白酶样内肤酶是SEQ ID NO:8、10或12任 一的成熟多肤的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
[0119] 该至少一种其它内肤酶的浓度优选为100-100，000、更优选500-50，000、和最优选 1，000-20，OOOUSP糜蛋白酶单位每g基于乳的蛋白质。
[0120] 一个USP糜蛋白酶单位为使用N-乙酷基-レ酪氨酸乙基醋(ATEE)作为底物，在pH 7.0和25°C，引起237nm处的吸光度改变0.0075的活性。
[0121] 比活性在不同内肤酶间可相当显著地变化，但是技术人员会轻易地能够确定要使 用的该至少一种其它内肤酶的量，例如基于水解程度。
[0122] 该至少一种其它内肤酶对基于乳的蛋白质的比例优选为0.001-1%重量/重量、更 优选0.0 Ol-0.5%、更优选0.005-0.25%、甚至更优选0.02-0.1 %、和最优选0.05%左右。
[0123] 优选地，基于内肤酶的重量，W膜蛋白酶样内肤酶添加浓度的2%-50%，更优选 5 % -20 %，甚至更优选5 % -15 %，和最优选约10 %的浓度添加该至少一种其它内肤酶。
[0124] 优选地，WUSP膜蛋白酶单位测量的膜蛋白酶样内肤酶活性为WUSP糜蛋白酶单位 测量的该至少一种其它内肤酶活性的5倍-500倍、更优选10倍-200倍。
[0125] 在水解之前的一个任选初步步骤是预加热基于乳的蛋白质材料的溶液或悬浮液， 例如为了确保乳清蛋白质级分，例如血清清蛋白（BSA)、a-乳清蛋白、0-乳球蛋白和免疫球 蛋白（特别是IgG)的变性。此步骤通常导致在通过免疫化学评估时残余抗原性降低(如下所 述）。在一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在约75-95°C加热蛋白质材料约5-30分钟。在另一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在135°C W上加热蛋白质材 料约1-5秒钟。在另一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在约13(TC加热蛋白质 材料约30-60秒钟。
[0126] 技术人员会知道优选将哪些条件应用于水解反应。例如，可W如US5039532或 EP063173IAl中披露的那样进行。例如，可W在约40°C至60°C的溫度，在6.5至8.5，优选6.5 至8范围内的pH值在1至6小时的过程中进行。
[0127] 在一个优选的实施方案中，在用肤酶进行第一处理之后，对蛋白质材料进一步进 行第二蛋白水解，之后是内肤酶灭活。在一个更优选的实施方案中，在第一和第二蛋白水解 之间对蛋白质材料进行热处理，如US5039532中披露的。
[0128] 不管水解的条件，优选对水解产物进行灭活内肤酶的额外步骤。在一个优选的实 施方案中，此肤酶灭活包括在约70至110°C、优选75至95°C的溫度约0.1至30分钟的热处理。 或者，可通过超高溫灭菌(例如在约130°C约30-60秒钟)来灭活内肤酶。
[0129] 可进一步澄清获得的蛋白质水解产物。它可W液体状态胆藏。也可将水解产物超 滤，可将它浓缩，例如通过蒸发，而且可将它干燥，例如通过喷雾干燥或冻干。
[0130] 在一个优选的实施方案中，获得的蛋白质水解产物具有中等(moderate)水解程 度。在另一个优选的实施方案中，获得的蛋白质水解产物是部分水解产物。在另一个优选的 实施方案中，获得的蛋白质水解产物具有5-30%、优选10-25 %和更优选12-20%的水解程 度。特别优选的水解程度是14%左右。另一种特别优选的水解程度是15%左右。
[0131] 水解程度(DH)表示通过该方法获得的蛋白质水解的程度。在本发明的语境中，水 解程度(DH)定义如下：
[01创 DH=(被切割肤键的数目/肤键的总数)x 10