专利名称：OsPP18基因在控制水稻抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高干旱耐受能力的水稻OsPPlS基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗旱基因0SPP18，通过共分离检测表明0SPP18突变体与干旱敏感表型是紧密关联的，超量表达OsPPlS基因，可以提高转基因水稻抗干旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术：
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold,drought and salt stress. Plant Cell. 14 (suppl), S165-S183, 2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵 抗不良环境条件胁迫的效果。大多数类型的转录因子都参与了植物的非生物逆境应答反应，包括 AP2/EREBP，bZip、HD-ZIP、MYB、MYC、NAC 和 Zinc finger 类转录因子(Yamaguch1-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcript ional regulatory networksin cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annu RevPlant Biol, 2006, 57 :781-803) 0通过基因工程，部分逆境应答转录因子已经成功应用于水稻抗逆遗传育种。利用SNACl培育的转基因水稻植株在大田干旱环境下能提高结实率30%左右，而在正常条件下产量不受影响且没有其他表型变化。转基因植株在营养生长期对干旱和高盐的抗性也显著提高(Hu等· Overexpressing a NAM, ATAF, and QJC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 :12987-12992)。这些抗逆转录因子是通过调控大量下游基因的表达来体现其功能。这些下游基因中往往含有参与信号转导和基因表达的调控蛋白，它们又进一步形成次级的调控网络。这些下游基因同样可以用于作物抗逆境的遗传改良。拟南芥中抗高温转录因子DREB2A的下游基因HsfA3同样可以提高转基因超表达植株对高温的抗性(Yoshida 等· Functional analysis of an Arabidopsis heat-shocktranscription factor HsfA3in the transcriptional cascade downstream of theDREB2A stress-regulatory system. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 368 :515-21)。植物对外界环境做出及时而精确的反应，除了相关转录因子，还有很多其他调控因子参与了逆境信号的感知与传递。蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质可逆磷酸化是信号转导过程中发生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一个磷酸基团；而蛋白磷酸酶通过去除底物的磷酸基团行使相反的功能。在一个酶上添加或去除一个磷酸基团一般会导致酶的激活或失活，正是通过这样的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性调控中发挥着重要的作用，进而调控着酶参与的生物学过程。蛋白磷酸酶2C是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，作为蛋白激酶的中和物，它们在逆境和发育相关信号转导途径中发挥着重要的作用(Rodriguez. Protein phosphatase 2C (PP2C) function in higherplants. Plant Mol Biol，1998，38 :919-27)。水稻蛋白磷酸酶2C家族共有90个成员，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻蛋白磷酸酶2C被报道，本发明涉及的OsPPlS基因是SNACl下游基因之一。水稻是重要的粮食作物和模式植物，在极端气候条件频发的今天，培育抗逆性增强的水稻具有重要的意义。鉴于0SPP16基因是抗旱转录因子SNACl的下游基因，是否能提闻水稻的抗逆性目如尚无相关报道。因此，从水稻中分尚出0sPP18基因，并鉴定它在提闻水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个蛋白磷酸酶2C家族成员0sPP18基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。在SNACl超表达植株上升表达的基因中挑选候选基因，因为其属于蛋白磷酸酶2C家族，申请人将该基因命名为0sPP18。本发明分离和应用一种包含0sPP18基因的DNA片段，该片段赋予水稻在干旱条件下抗旱性增强的能力。其中，所述的含有OsPPlS基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列长度为1162bp，它对应的氨基酸序列如SEQID NO :1所不,其对应的氣基酸序列为348个。它的蛋白质序列如SEQ ID N0:2所不。携带有本发明0sPP18基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化,微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ；Geiserson andCorey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本发明的OsPPlS基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱植物品种。本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
序列表SEQ ID NO :1是本发明分离克隆的包含有0sPP18基因的核苷酸序列，序列长度为1162bp，从38-1084位是它的编码区，编码348个氨基酸。序列表SEQ ID NO :2是0sPP18基因的蛋白质的序列。图1 :是osppl8突变体中0sPP18基因的表达情况。途中WT为转基因家系分离出的阴性对照，osppl8为0sPP18T-DNA插入突变体。图2 :是OsPPlS基因在多种逆境和激素处理下的表达情况。各处理样品为干旱(drought)处理 0d, 3d, 5d, 7d,复水 Id ;高盐(salt)处理 Oh, lh, 3h, 6h, 12h, 24h ;低温(cold)处理 Oh, lh, 3h, 6h, 12h, 24h ;高温(heat)处理 Omin, IOmin, 30min, lh, 3h, 6h ;氧化胁迫(H2O2)处理 Oh，lh，3h，6h，12h ;紫外线(UV)处理 0h，3h，6h，12h ;伤害(wound)处理 0h，lh, 3h, 6h ;淹水胁迫(submerge)处理Oh, 6h, 12h, 24h, 72h。激素处理脱落酸(ΑΒΑ),茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)处理011，111，311，611，1211。图3 :是水稻osppl8突变体苗期干旱胁迫表型和osppl8突变体苗期干旱胁迫后存活率的统计。图中A为水稻osppl8突变体苗期干旱胁迫表型。osppl8#l，#2，#3为3个0sPP18T-DNA插入突变体纯合家系。WT#1，#2，#3为杂合突变体分离出的3个阴性家系。B为水稻osppl8突变体苗期干旱胁迫后存活率的统计结果。osppl8#l，#2，#3为3个0sPP18突变体纯合家系。WT#1，#2，#3为杂合突变体分离出的3个阴性家系。图4 :是水稻osppl8突变体成株期大田干旱胁迫表型、osppl8突变体成株期大田干旱胁迫后生物量统计结果、ospplS突变体成株期大田干旱胁迫后株高统计结果及osppl8突变体成株期大田干旱胁迫后相对结实率统计结果。图中A为水稻osppl8突变体成株期大田干旱胁迫表型。osppl8为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。B为水稻osppl8突变体成株期大田干旱胁迫后生物量统计结果。ospplS为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。C为水稻osppl8突变体成株期大田干旱胁迫后株高统计结果。osppl8为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。D为水稻osppl8突变体成株期大田干旱胁迫后相对结实率统计结果。osppl8为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。图5 :是水稻osppl8突变体渗透胁迫表型和osppl8突变体渗透胁迫后株高的统计结果。图中A为水稻osppl8突变体渗透胁迫表型。osppl8为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。B为水稻osppl8突变体渗透胁迫后株高的统计结果。osppl8为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。图6 0sPP18 超表达载体构建示意图、0sPP18超表达植株中0sPP18基因的表达情况、0sPP18超表达植株渗透胁迫表型及0sPP18超表达植株渗透胁迫后株高的统计结果。图中A为0sPP18超表达载体构建示意图。B为0sPP18超表达植株中0sPP18基因的表达情况。中花11 (ZHll)为野生型家系。C为0sPP18超表达植株渗透胁迫表型。0sPP18-0X_4，-7为2个独立超量表达转基因Tl代家系，中花11 (ZHll)为野生型家系。D为0sPP18超表达植株渗透胁迫后株高的统计结果。0sPP18-0X-4，-7为2个独立超量表达转基因Tl代家系，中花Il(ZHll)为野生型家系。图7 :是pCAMBIA1301载体的质粒图谱。图8 :是pU1301载体及0sPP18超表达载体的质粒图谱。
具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离0sPP18T_DNA插入突变体，克隆包含有OsPPlS基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsPPlS基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。1、分离 0sPP18T_DNA 突变体从水稻突变体库Rice T-DNA Insertion Seqence Database (RISD)(本发明的起始材料即突变体 2D-21407,检索地址http://signal, salk. edu/cg1-bin/RiceGE,韩国植物功能基因组实验室(Plant Functional Genomics Laboratory)管理)中挑取0sPP18基因位点相应的T-DNA插入突变体2D-21407。产生这个突变体株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Jeong等· Generation of a flanking sequence-tag database foractivation-tagging lines in japonica rice. Plant J. 2006,45 :123-32.),限于篇幅本说明书不再展开描述。其中在上述网站突变体库中所登录的0sPP18T-DNA突变体2D-21407的侧翼序列(该序列长度为480bp)如下所示GNNATNCCCCAGTTGTCATGTATTAGCCACATAGCAAAAAAAATAGCACCGTGGTAGTAAGAATGGAACTCACCTGGTACCTGGTACCTCGGATCCGTGTTTTCGTGTTAGGGGGAAGATCCAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGAAGGATGACAAGTTTTTCATGGCGCGGTCAGGGGCTTTGTGCTTGATTTGATTGGCGGCTAACTATCGAGTAGTGATTCTTGAATCAGAGGCTAGGACATGAGGTTTCAGTGGCGGATTTTGAATTAGATCTGCCCGATTTTGCTCTGAATTAGCTTAGCCTAATCGGGTTCCAGCTCCTGGCTGGTGTGAGGATGTGGCCATGATTTTGAATTTGAGGAGTGTTTGAAAACNAAAAGTCTAATCCTTTGTAAGGGCATATGGTANAGGAATTAACCTTTTTCTTGTTTGATGTGTCTGTGTGNANCANCTGATTTTTATGGANTGTTNTTANTT根据T-DNA插入位点，设计引物，对突变体中OsPPlS基因的表达量进行检测。用引物(0sPP18-F :5，-CACAAACCCGACCAGTCAGA-3，和 0sPP18_R :5，-CGTCCCAGCCCACATCA-3，)对OsPP18基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(AF :5’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR :5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。表达量检测结果显示，在osppl8T-DNA插入纯合突变体中，0sPP18基因的表达显著低于分离出的阴性对照(图1)。即osppl8突变体中0sPP18基因被显著抑制。2、检测水稻内源0sPP18基因的表达水平申请人:选用粳稻品种“中花11号”(中国农业科学院作物科学研究所培育的一个公开推广应用的水稻品 种)作为表达谱分析的材料。生长至4叶期幼苗进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是不浇水让其自然干燥，0d, 3d，5d，7d及复水Id后取样；高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液，Oh, lh, 3h，6h，12h，24h后取样；低温胁迫是将幼苗放入4°C人工气候室，0h，lh，3h，6h，12h，24h后取样。高温胁迫是将幼苗放入42°C人工气候室，Omin，I Omin, 30min, lh, 3h，6h后取样。紫外线处理是将幼苗置于紫外灯下，0h，3h,6h, 12h后取样。伤害处理是用镊子对幼苗进行机械损伤,Oh, lh, 3h, 6h后取样。氧化胁迫是将幼苗根部浸泡在1%11202溶液中，011，111，311，611，1211后取样。淹水胁迫是将幼苗置于装满水的四面透光容器内，011，611，1211，2411，7211后取样。激素处理是用ΙΟΟμΜ的脱落酸(ABA)，茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)分别均匀的喷洒水稻植株表面后并加到幼苗根部，011，111，311，611，1211后取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII (购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为65°C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(OsPP18-F :5，-CACAAACCCGACCAGTCAGA-3’ 和 OsPP18-R :5，-CGTCCCAGCCCACATCA-3，)对OsPP18基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(AF :5’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR :5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，OsPP18基因(SEQ NO 1)在干旱，高盐，低温，高温，紫外线和氧化胁迫后诱导上升表达。OsPPlS基因受茉莉酸和水杨酸的快速诱导，不受ABA的诱导(图2)。3、鉴定ospp 18突变体干旱胁迫表型将已鉴定好基因型的纯合突变体(osppl8)和野生型家系(WT)催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2 3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型，为了验证该突变体与干旱表型共分离情况，将Tl代杂合单株收获的种子播种得到T2代纯合和阴性种子繁殖成家系。随机选取3个纯合突变体家系(osppl8#l，#2，#3)和3个分离出的野生型家系(WT#1，#2, #3)，同样进行上述胁迫实验，结果纯合突变体较阴性对照对干旱敏感(图3中A)。复水后，纯合家系存活率低于25%，而野生型家系仍有40%以上的存活率(图3中B)。该试验设3次生物学重复，结果一致。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。为了鉴定突变体成株期的表型将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土大田中南方水稻土与粗沙按体积比为1: 2混合而成，每行10株每家系种植2行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再复水生长。与杂合家系分离出的阴型对照相比，纯合突变体植株生长明显受到抑制表现为干旱敏感表型(图4中A)，对株高，生物量和结实率等性状进行考察，发现成株期突变体干旱胁迫条件下地上部分生物量(图4中B)和株高(图4中C)显著低于对照。因为在正常生长条件下，突变体植株与对照的结实率不一致，用相对结实率(干旱胁迫下植株的结实率除以正常条件下生长植株的结实率)进行比较。结果显示突变体相对结实率显著低于对照(图4中D)。为了鉴定突变体对渗透胁迫的表型，将突变体及其对照发芽后，置于含有IOOmM甘露醇(形成高渗透环境，模拟渗透胁迫)的1/2MS培养基中生长，结果突变体的长势明显弱于对照(图5中A)。对株高进行测量，突变体的株高显著低于对照(图5中B)。4、0sPP18基因超量表达载体的构建和遗传转化为了能更好的分析OsPPlS基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下:首先通过查找在水稻基因组注释网站RGAP(http://rice, plantbiology. msu. edu/) 0sPP18 基因注释号L0C 0s02g05630,与 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go.1p/cDNA/) 0sPP18 沣释号AK066016,预测为一个 PP2C 家族某闵,以此为参考设计引物。以水稻品种“中旱5号”(由中国上海农业科学院提供的商业品种)的愈伤总RNA反转录得到的cDNA 为模板，用引物0SPP18FLF(5’ -ATCGGTACCCTCCTCCATCCATTCCC-3’，序列特异引物外加接头 KpnI 位点)和 0SPP18FLR(5’ -ATCGGTACCGGTGCCGCCACTGTAA-3’，序列特异引物外加接头KpnI位点)，扩增出包含0sPP18基因完整编码区的cDNA片断，扩增产物就是本发明SEQ ID NO :所示的序列(l-1162bp)。PCR反应条件为94°C预变性 5min ；94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 70sec,32 个循环；72°C延伸 5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。将该克隆命名为PGEM-0sPP18。阳性克隆PGEM_0sPP18质粒用KpnI酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301 (pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(图7)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体，图谱见图8)，酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比24 I)抽提，纯化酶切产物。用包含OsPPlS基因的酶切片段和酶切的PU1301载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DHlOii (该大肠杆菌DHlOii菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为0sPP18-0X-pU1301 (载体上的0sPP18基因序列就是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，序列长度为1162bp，见图6A)。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体0sPP18-0X-pU1301转入到水稻品种“中花11” (中国农业科学院作物科学研究所培育的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在 Hiei 等人 艮道的方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice, Oryzasativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA, Plant J,6 :271-282,1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转 化步骤如下(I)电转化将最终超表达目标载体0sPP18-0X_pU1301(质粒图谱见图8)，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的常用的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。(2)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70%的乙醇处理I分钟，O. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基(成分见后)置于黑暗处培养4周,温度25± 1°C。(3)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度25 ± I °C。(4)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度25± 1°C。(5)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于澳大利亚CAMBIA实验室商用菌株，携带有本发明的超表达载体0sPP18-0X-pU1301)两天，培养温度28°C ;将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28°C摇床上培养2-3小时。(6)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至0D6000. 8-1. O ;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(7)愈伤洗漆和选择培养灭菌水洗漆愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次及以后为250ppm,潮霉素浓度为250ppm)。(8)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周 ’转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26°C。(9)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。(10)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。培养基组分及其配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表不如下6_BA (6-Benzy IaminoPur ine, 6-节基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧节青霉素)；KT(Kinetin,激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid, Π引哚乙酸)；2,4_D(2,4_Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH (Casein EnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制
硝酸钾(KNO3)28. 3 g
磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0 g
硫酸铵((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸镁(MgSO4 · 7H20)1.85 g
氯化钙(CaCl2 · 2H20)1.66 g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0. 16 g
硫酸锰(MnSO4 · 4H20)O. 44 g
硫酸锌(ZnSO4 · 7H20)O. 15 g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinic acid)0.1 g
维生素 BI (Thiamine HCl)0.1 g
维生素 B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)O. 2 g
肌醇(Inositol)10 g加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸铵(NH4NO3)16. 5 g
硝酸钾19. O g
磷酸二氢钾1. 7 g
硫酸镁3. 7 g
氯化钙4. 4 g室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾0.083 g
硼酸O. 62 g
硫酸锰O. 86 g
钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20)O. 025 g
硫酸铜(CuSO4 · 5H20)O. 0025 g室温下溶解并定容至1000ml。7) 2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液I均为 mg/ml ο8)葡萄糖贮存液0. 5g/ml。9) AS 贮存液的配制秤取 AS O. 392g，DMSO 10ml。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方I)愈伤组织诱导培养基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)10 ml
维生素贮存液(100X)10 ml2, 4-D 贮存液2. 5 ml
脯氨酸(Proline)0. 3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6raix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA C存液(100X)10 ml
维生素贮存液(100X)10 ml
2, 4-D 贮存液2. O ml
脯氨酸O. 5 g CHO. 6 g
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基
N6max 母液(IOX)12. 5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2, 4-D 贮存液O. 75 ml
CHO. 15 g
蔗糖5 g
琼脂粉(Agarose)1. 75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1. 25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2, 4-D 贮存液O. 75 ml
CHO. 2 g
蔗糖5 g
琼脂粉1. 75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA Jt存液(100X)0.5 ml
维生素贮存液(100X)I ml
2，4-D 贮存液O. 2 ml
CHO. 08 g
蔗糖2 g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 μ I AS贮存液。6)选择培养基
N6raax 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2，4-D 贮存液O. 625 ml
CHO. 15 g
蔗糖7. 5 g
琼脂粉1. 75 g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 μ IHN和400ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6raax 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml Fe2+EDTA Jt存液(100X) 2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
6-BA贮存液0. 5 ml
KT贮存液0. 5 ml
NAA It存液50 μ
IM It存液50 μ
CH0. 15 g
蔗糖7. 5 g
琼脂粉1. 75 g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 μ I HN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/ M )。8)分化培养基
N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)10 ml
Fe2+EDTA Jt存液(100X)10 ml
维生素贮存液(100X)10 ml
6-BA贮存液2 ml
KT贮存液2 ml
NAA贮存液O. 2 ml
IAA It存液0_ 2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基
MSraax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)5 ml
维生素贮存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。5、0sPP18超量表达转基因T1代家系渗透胁迫下的生长状况本发明采用荧光检测实时定量的方法对部分转基因水稻植株中OsPPlS基因的表达进行检测，RNA的提取，反转录和荧光实时定量PCR的具体步骤同实施例2 (图6B为表达量检测结果)，结果显示，获得了 OsPPlS基因的表达量相对于野生型显著提高的转基因植株。本实施例选取了转0sPP18基因(序列见序列表SEQ NO 1)的超量表达的2个T1家系(编号为0sPP18-0X-4，0sPP18-0X-7)进行了渗透胁迫实验。具体步骤如下将超量表达转基因家系(0sPP18-0X-4，0sPP18-0X-7)种子去壳消毒(用浓度为70%的酒精处理lmin，再用O. 15%氯化汞处理lOmin，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，中花11 (ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有或不含150mM甘露醇的1/2MS培养基中继续生长。10天后拍照并调查植株的株高(见图6中C)。因为在不含甘露醇培养基(图6中C上部)上超量表达植株与对照的长势不一致，用相对株高(甘露醇培养基(图6中C下部)上生长植株的株高除以正常培养 基(图6中C上部)上生长植株的株高)进行比较。超量表达植株的相对株高显著高于野生型(见图6中D)，该试验每个家系设3次生物学重复，结果一致。说明超表达0sPP18基因的确具有提闻转基因植株抗干旱的能力。
权利要求
1.一种控制水稻抗旱性的基因OsPPlS在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.一种控制水稻抗旱性的基因OsPPlS在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的蛋白质的序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
全文摘要
本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高干旱耐受能力的水稻OsPP18基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsPP18，通过表达量检测和干旱胁迫表型鉴定表明该突变体与干旱敏感表型是共分离的。超量表达OsPP18基因能提高转基因水稻抗干旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
文档编号A01H5/00GK103060285SQ20111032166
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者熊立仲, 游均 申请人:华中农业大学