专利名称：Cpn20蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种CPN20蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术：
陆生植物在整个生长发育阶段都可能受到逆境胁迫的影响，其中干早是强烈制约植物生长和作物产量的一个重要因素。植物为生存进化出一系列抵抗、耐受以及躲避逆境胁迫的策略。有关植物抗逆性的研究一直是植物学领域的热点。传统的育种技术改良耐胁迫性状难度较大，而随着分子生物学技术的发展及对植物抗逆分子机制的深入研究，分子水平抗逆基因工程取得重大进展。采用转基因技术向植物导入抗逆性外源基因已成为改良植物抗逆性的新途径。植物抗逆机制及相关基因工程的研究具有非常广阔的前景和十分重要的意义。Chaperones (分子伴侣)是一类功能性伴侣蛋白，具有平衡蛋白质折叠、装配、定位和降解的作用。大部分分子伴侣在高温或其它胁迫条件下表达量上调，因此它们也被称为热激蛋白(HSPs)。在植物中，根据蛋白分子量不同将分子伴侣分为五个家族，分别为HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族，伴侣蛋白(HSP60)和小HSP家族。共伴侣蛋白能够与分子伴侣例如HSP60、HSP70或HSP90相互作用，辅助特异底物折叠。近期有研究表明，共伴侣蛋白与其相应的分子伴侣也参与了一些信号转导过程。例如，HSP40是HSP70的共伴侣蛋白，它在植物适应高盐环境中发挥重要作用。HSP40类蛋白J3通过调控PSK5活性参与拟南芥耐盐信号转导过程，J3能够通过抑制PKS5激酶活性进而促进质膜H+-ATP酶的活性。SGTl是HSP70/HSP90复合体的支架蛋白，其在植物生长素和茉莉素以及SCF E3泛素连接酶依赖的信号转导中发挥重要作用。近期研究表明，HSP90及SGTlb在ABA调控种子萌发和气孔运动中发挥负调控作用。
分子伴侣/共伴侣蛋白中研究比较深入的是伴侣蛋白HSP60，或称CPN60/CPN10。伴侣蛋白HSP60/CPN60包括两组。第一组存在于细菌和真核生物的叶绿体和线绿体中。在大肠杆菌(E.coli)中，桶装伴侣蛋白GroEL/CPN60具有一个顶端疏水区，其在共伴侣蛋白GroES/CPNIO帮助下形成亲水笼，辅助蛋白质折叠。折叠后蛋白在GroES/CPNIO与GroEL/CPN60解离后从亲水笼中被释放。第二组伴侣蛋白存在于真核细胞的胞质中，其具有的外延的帽状结构在功能上与共伴侣蛋白GroES/CPNIO。CPN20是CPN60的共伴侣蛋白，其在豌豆的叶绿体基质中首次被发现。CPN20由一个前导肽和两个同源性为46%的CPN10类似结构顺次连接构成。对拟南芥伴侣蛋白相应基因表达进行分析，发现CPN20表达量远高于其相应的CPN60家族，且其表达量也高于叶绿体中另外两个共伴侣蛋白(CPNIOs)。由此推测，CPN20可能具有独立于其共伴侣蛋白功能的其它功能。而最近的报道表明，拟南芥叶绿体CPN20调节铁超氧化物歧化酶(FeSOD)活性的功能独立于共伴侣蛋白功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种CPN20蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的蛋白质(命名为CPN20)或其编码基因(命名为CPN20)在如下al) _a3)中的应用:al)调控植物抗旱性；a2)选育抗旱性提高的植物品种；a3)选育抗旱性降低的植物品种。在上述应用中，al)中的所述调控植物抗旱性具体体现在:所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在所述植物中的表达量越低，所述植物的抗旱性越高；所述由序列表中序列3所的氣基酸序列组成的蛋白质在所述植物中的表达量越闻，所述植物的抗旱性越低。在上述应用中，a2)中的所述选育抗旱性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述CPN20蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。在上述应用中，a3)中的所述选育抗旱性降低的植物品种的方法，均具体可包括将所述CPN20蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。本发明还提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。本发明所提供的培育抗旱性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:
a)在目的植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性提高的转基因植物。在上述培育抗旱性提高的转基因植物方法中，所述在目的植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，可通过RNA干扰的方式干扰所述目的植物中所述CPN20基因的表达。当然，任何可降低所述目的植物中所述CPN20基因的表达的方法均可。当然，培育抗旱性降低的转基因植物的方法也属于本发明的保护范围。所述培育抗旱性降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:c)向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性降低的转基因植物。在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即CPN20基因)是如下I)至5)中任一所述的DNA分子:I)编码序列为序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列I所示的DNA分子；4)在严格条件下与I) -3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；5)与I) -4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由1813个核苷酸组成，为所述CPN20基因在拟南芥基因组中序列，其中第 80-339 位、第 519-788 位、第 971-1069 位、第 1229-1315 位、第 1393-1514 位为 5 个内含子序列；序列2由975个核苷酸组成，为所述CPN20基因的cDNA序列，其中第87-848位为编码序列(ORF);序列I和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由253个
氨基酸残基组成。在上述培育抗旱性降低的转基因植物的方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载 体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子(具体为花椰菜花叶病毒35S启动子)。更为具体的，所述重组表达载体为将所述CPN20基因插入到pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点XbaI和Kpn I之间后得到的重组质粒。在上述培育抗旱性提高或降低的转基因植物的方法中，将携带有所述CPN20基因的所述重组表达载体或所述CPN20基因的RNA干扰载体导入所述目的植物，具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。在上述应用或方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-Ο生态型)。实验证明，本发明所得的CPN20基因过表达的转基因植株，相比未转基因的对照植株，对干旱的耐受性降低，同时CPN20基因表达下调的T-DNA插入突变体植株cpn20_l，相比未转基因的对照植株，对干旱的耐受性提高。本发明对植物抗逆性分子机制以及分子育种研究方面具有重要意义，对于粮食和经济作物的遗传改良，提高作物对干旱的耐受性等方面具有重要的实用价值和广阔的市场前景。
图1为CPN20基因相关T-DNA插入突变体的鉴定。测序比对结果，cpn20_l突变体中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子(ATG)上游第393bp到第376bp之间，插入导致18bp缺失。图2为各遗传材料CPN20基因表达量的分析结果。其中，(a)为CPN20相关突变体的实时荧光定量PCR检测结果，CPN20基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-Ο生态型)CPN20基因的表达为100 ； (b)为CPN20相关突变体免疫印迹检测结果。图3为CPN20各遗传材料失水实验结果。其中，Ca)为叶片经过6小时失水后的状态；(b)为CPN20各遗传材料的离体莲座叶放置6小时期间的失水率统计结果。图4为CPN20各遗传材料抗旱实验结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pCAMBIA-1300-221 载体:由清华大学提供(记载文献:Li jing Liu, YiyueZhang, Sanyuan Tang，et a 1.An efficient system to detect proteinubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The PlantJournal, 2010(61):893-903.)。在 pCAMBIA-1300-221 载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息；http://www.cambia.0rg/daisy/cambia/materials/vec tor s/585, html。拟南芥野生型(Col-0生态型):拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia-0)，购自拟南芥生物研究中心(ABRC)。CPN20基因相应T-DNA插入突变体cpn20_l种子:购自拟南芥生物研究中心(ABRC)0背景为拟南芥野生型(Col-Ο生态型)，cpn20-l为CPN20基因表达降低的T-DNA插入突变体。种子编号信息:SAIL—888—A09。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献:R.Berres，L Otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports，1992(11):192-195.)。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a (DE3)感受态，购自全式金生物有限公司。CPN20蛋白抗体:以序列表中序列3所示CPN20蛋白作为免疫原，免疫兔子所得的兔源多克隆抗体。 实施例1、CPN20各遗传材料的获得及鉴定
本实施例中所涉及的CPN20基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana),其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列I所示，序列I由1813个核苷酸组成，其中第80-339位、第519-788位、第971-1069位、第1229-1315位、第1393-1514位为5个内含子序列；所述CPN20基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由975个核苷酸组成，其中第87-848位为编码序列(ORF);序列I和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质(CPN20蛋白)，序列3由253个氨基酸残基组成。一、重组表达载体 pCAMBIA-1300-221-CPN20 的构建提取拟南芥野生型(Col-Ο生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物I与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约760bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第87-848位核苷酸序列(CPN20基因的编码序列，0RF) ο引物I:5，-GGTCTAGAATGGCGGCGACTCAACT-3，(下划线部分为 XbaI 的识别位点，其后的序列为序列2的第87-103位)；引物2:5’-CGGGGTACCCTAAGAAAGTATAGCCATCACATCTG-3’ (下划线部分为 Kpn I 的识别位点，其后的序列为序列2的第823-848位的反向互补序列)。用限制性内切酶XbaI和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点XbaI和Kpn I之间插入了序列表中序列2所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-CPN20。在重组表达载体PCAMBIA-1300-221-CPN20中，启动所述CPN20基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。
在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的CPN20基因为模板。二、CPN20基因表达降低突变体的鉴定CPN20基因表达降低的T-DNA插入突变体，将其命名为cpn20_l，购自拟南芥生物研究中心(ABRC)，遗传背景为拟南芥野生型(Col-Ο生态型)。通过分子生物学方法鉴定出各自的纯合体，并通过测序对突变体T-DNA插入位点进行分析。测序比对结果如图1所示:cpn20-l突变体中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密码子(ATG)上游第393bp到第376bp之间,插入导致18bp缺失。三、CPN20转基因拟南芥的获得及鉴定1、CPN20转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CPN20通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物I和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有CPN20基因(PCR目的条带大小为760bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-CPN20 ;将转入pCAMBIA-1300-221 空载体的农杆菌GV3101 命名为 GV3101/pCAMBIA-1300-221o采用农杆菌花序侵染的方法(SJClough, AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal, 1998，16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌 GV3101/PCAMBIA-1300-221-CPN20 (或 GV3101/pCAMBIA-1300_221)转化拟南芥野生型(Col-0)。转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入PCAMBIA-1300-221-CPN20的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株(T1 代)。2、CPN20转基因拟南芥鉴定(I) PCR 鉴定从步骤I获得的T1代CPN20转基因拟南芥，以及转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于CPN20转基因拟南芥，以引物I和引物2 (序列同步骤一所述)进行PCR扩增，经鉴定同时得到大小约为760bp (外源插入的序列2所示CPN20基因)和1800bp (拟南芥内源的序列I所示CPN20基因)两个目的条带的植株即为CPN20转基因阳性植株，而鉴定只得到大小为1800bp目的条带的植株为CPN20转基因阴性植株。对于转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，用GFP引物GFP-Fl和GFP-Rl (引物序列如下)进行PCR鉴定，经鉴定表明含有GFP基因的(PCR产物大小约为700bp)植株即为pCAMBIA-1300-221空载体转入阳性的植株。所用引物序列如下:GFP-Fl:5’ -AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3，；
·
GFP-Rl:5’ -GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中两个CPN20转基因拟南芥株系分别记作0E2 和 0E3。(2)转基因拟南芥0E2和0E3纯合系的筛选经上述鉴定分析后，选择其中两个代表性CPN20转基因拟南芥株系0E2和0E3 (T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥0E2和0E3的纯合系植株，作为实验材料进行以下抗旱试验分析。四、转基因拟南芥0E2和0E3纯合系中CPN20基因表达量分析提取拟南芥野生型(Col-Ο生态型)与T-DNA插入突变体cpn20_l，过表达植株0E2和0E3的总RNA和总蛋白，利用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，分别检测材料中CPN20基因在转录水平和翻译水平上的RNA和蛋白表达情况。具体如下:1、转录水平分析(RNA表达量)以上述获得的转基因拟南芥0E2和0E3纯合系，T-DNA插入突变体cpn20_l，以及拟南芥野生型(Col-Ο生态型)生长10天的幼苗为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析CPN20基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增CPN20基因的引物序列为:引物CPN20-F:5’ -ATGGCGGCGACTCAACTTACAGCG-3’(序列 2 的第 87-110 位)；引物CPN20-R:5’-GACAACCAAACGACGGAACTGGCTC-3’(序列 2 的第 209-233 位的反向互补序列)。以Act in2/8作为内参基因，扩增内参Act in的引物序列为:Actin-F:5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，，
Actin-R:5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。上述引物的反应条件如下:( I)反应体系的建立实时荧光定量PCR反应体系
权利要求
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下al)_a3)中的应用: al)调控植物抗旱性； a2)选育抗旱性提高的植物品种； a3)选育抗旱性降低的植物品种。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下al)_a3)中的应用: al)调控植物抗旱性； a2)选育抗旱性提高的植物品种； a3)选育抗旱性降低的植物品种。
3.培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤: a)在目的植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物； b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性提高的转基因植物。
4.培育抗旱性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤: c)向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； d)从步骤c)所得 转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性降低的转基因植物。
5.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列I所示的DNA分子； 4)在严格条件下与I)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 5)与I)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种CPN20蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)或a2)中的应用a1)调控植物抗旱性；a2)选育抗旱性提高的植物品种。实验证明，本发明所得的CPN20基因过表达的转基因植株，相比未转基因的对照植株，对干旱的耐受性降低，同时CPN20基因表达下调的T-DNA插入突变体植株cpn20-1，相比未转基因的对照植株，对干旱的耐受性提高。本发明对植物抗逆性分子机制以及分子育种研究方面具有重要意义，对于粮食和经济作物的遗传改良，提高作物对干旱的耐受性等方面具有重要的实用价值和广阔的市场前景。
文档编号A01H5/00GK103224552SQ201310188699
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月21日 优先权日2013年5月21日
发明者张大鹏, 张晓枫, 姜涛, 王小芳 申请人:清华大学