专利名称：Oxhs4基因在控制水稻抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够通过控制根的生长，提高干旱耐受能力的水稻基因0XHS4在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗旱基因0XHS4，通过苗期和成株期干旱胁迫实验发现超量表达0XHS4基因可以提闻转基因水稻抗干旱的能力，而突变体oxhs4表现出对干旱敏感，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术：
水稻作为我国乃至世界主要的粮食作物，其产量和品质受到干旱、盐溃和低温等非生物逆境严重制约，对农业生产、甚至对社会生活有极其重要的影响。发掘一些与逆境相关的新基因，深入了解它们的抗逆机制，对提高水稻的抗逆性，改良水稻品种具有重要的实 际意义。根系是植物直接吸收水分的重要器官，它对植物的耐旱功能具有至关重要的作用。作物根系的发展与改善有利于干旱条件下水分的吸收，发达的根系有利于增加植株的生存和复原抗性的能力。因此根系深度及阔度的发展是作物躲避干旱的主要策略之一。纵深发达的根系系统可使植物充分吸收利用贮存在土壤中的水分，使植物度过干旱期。随着对根结构认识的深入，发现皮层通气组织(RCA)发达程度直接影响着植株的抗旱能力，发达的通气组织在干旱条件下可以使植株减弱代谢消耗，用于增强根的生长来获取更多的水分(Zhu et al.，2010)。为了更好的了解根系在干旱条件下的生长机制，在转录水平上，对玉米初生根的根冠以及伸长区的基因在水分充足和胁迫下的的表达分析发现，在遭遇水分胁迫后，不同途径相关基因的表达在空间上存在着很大差异，在根冠中，活性氧和碳代谢类的基因在水分胁迫前后差异最大；在伸长区，细胞伸长相关基因的表达差异最大(Spollen etal.，2008)，这揭示了相关基因在植物遭遇水分胁迫后在各自不同的区域发挥着重要的功能，这也为我们研究在根中不同区域特异表达的基因功能以及根发育相关突变体在干旱中的作用指明了方向。随着QTL的运用，芯片数据的开发和突变体的大量筛选，许多与根的发育相关同时又影响植物抗旱性的基因被发现。拟南芥中，激活基因HDGll表达的EDTl和超表达植株HDG11，相比野生型都具有更长的主根和更多的侧根，发达的根系显著地增强了植物的抗旱性(Yu et al.，2008)。水稻中的OsNACIO在根特异表达启动子RCc3的驱动下，相比野生型植株，转基因植株的根径增加了 I. 25倍，由此而给正常生长条件下的转基因植株带来了 5% -14%的增产，根系增强而带来抗旱性的增加使超表达植株在干旱条件下增产了 25%-42% (Jeong et al.，2010)。在棉花中超量表达拟南芥基因AVPl激活了生长素在根中的运输而刺激了根的迅速生长，增强了根在干旱条件下的吸收水分的能力(Pasapulaet al. ,2010)。在拟南芥中超表达一个来自木本植物的亲环蛋白(cyclophilin)显著增强了根在渗透胁迫下的生长(Sekhar et al. ,2010) AtSQE负责根中固醇的生物合成，SQEl的缺失导致根的生长出现了缺陷，抗旱性明显下降(Pose et al.，2009)。拟南芥突变体hrd-D的次生根增多，根皮层增厚，因而增加了植物的水分利用效率而导致的抗旱性增强(Karabaet al. ,2007) 由上可知，根的生长对植物的抗旱能力具有重要的作用。同时，激素对根发育的调控不仅仅体现在正常条件下，在逆境条件下这种联系更是加强了。抗旱机制的差别我们可以发现将这些基因分为两类，一类是调控着根系的生长发育，而其本身并不受干旱胁迫的诱导的基因；另一类是控制着根系的生长同时又受到干旱的诱导的基因，这类基因的改良对提高作物的抗旱性具有更重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个XHS蛋白家族成员0XHS4基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。0XHS4编码62 8个氨基酸，是一个结构域完整的典型XHS蛋白，包含Zf_XS、XS、Coiled-Coil和XH结构域。本发明分离和应用一种包含0XHS4基因的cDNA片段，该片段赋予水稻在干旱条件下抗旱性增强的能力。其中，所述的含有0XHS4基因的cDNA序列如序列表SEQ NO: I所示，序列长度为2215bp，其中ORF (编码区)为1887bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO :1中63-1949位所示，编码628个氨基酸。它的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。携带有本发明0XHS4基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接 DNA转化,微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998,Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp. 411-463 ；Geiserson andCorey，1998，Plant Molecular Biology (2ndEdition)。可使用包括本发明的0XHS4基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱植物品种。本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
序列表SEQ ID NO :1是本发明分离克隆的包含有0XHS4基因编码区的核苷酸序列，它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，氨基酸序列为628个。图I. 0XHS4基因在多种逆境和激素处理下的表达情况。各处理样品为干旱(drought)处理 Oh (CK) ,0. 5h, 2h, 4h, 8h ；高盐(salt)处理 Oh, 0. 25h, 0. 5h, lh, 2h ；低温(cold)处理 0h，0. 5h，lh，3h，6h ;脱落酸(ABA)处理 0h，0. 5h，2h，4h，8h。图2. 0XHS4超表达、突变体以及互补植株的鉴定。A，0XHS4超表达植株的Northernblot检测(5和14为鉴定的超表达家系，WT为野生型对照)；B，突变体oxhs4中T-DNA插入位置确定(M5和M8为鉴定的纯合家系)；C，0XHS4表达量的检测；D_E，互补植株(CP)的阳性(D)和表达量(E)检测(1-17为17株突变体互补植株，WT和oxhs4作为检测的对照)。图3. 0XHS4超表达、突变体以及互补植株在苗期干旱胁迫下的表型鉴定。A-B，转基因植株在胁迫前(A)以及胁迫复水后(B)的生长状态；C，胁迫后的存活率统计；D，胁迫前后的游离脯氨酸测定，CK表示胁迫前的脯氨酸含量；Dr表示胁迫后的脯氨酸含量。标准误基于三次生物学重复。(U5和U14为超表达家系，M5和M8为突变体纯合家系，CP为互补植株阳性家系，HY和ZHll分别为突变体和超表达的野生型对照)
图4. 0XHS4超表达和突变体植株成株期的干旱胁迫以及根长和根体积的测定。A和D为干旱胁迫前的生长状态，B、C、E和F为干旱胁迫后的生长状态。G-L，正常生长和不同干旱胁迫程度下的根的表型。M-0,正常生长(M)，中等程度干旱胁迫下(N)和严重干旱胁迫下(0)的相对根长和相对根体积的统计。和‘**’分别表示t-测验的P值小于0. 05和0. 01。(U5和U14为超表达家系，M5和M8为突变体纯合家系，HY和ZHll分别为突变体和超表达的野生型对照)图5. 0XHS4超表达以及突变体植株在成株期中度程度干旱胁迫下的相对产量(A)和相对结实率(B)的统计。‘**’表示t-测验的P值小于0. 01。(0X表示超表达家系，oxhs4表示突变体纯合家系，HY和ZHll分别为突变体和超表达的野生型对照)
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有0XHS4基因完整编码区段的DNA片段，分离0XHS4的T-DNA插入突变体，以及验证0XHS4基因功能的方法。根据以下的描述的全部或部分实施步骤，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例II、检测水稻内源0XHS4基因受逆境诱导水平为初步判断0XHS4基因是否与抗逆相关，本发明首先检测了水稻内源基因0XHS4是否受逆境诱导。选用籼稻品种明恢63(0ryza sativa L. ssp. Indica,来自福建省农科院)作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在正常生长条件下至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将幼苗直接从暴露于空气中失水，在0h、0.5h、2h、6h取样。高盐胁迫是将幼苗移入含有200mmol/L NaCl的水培液中，在Omin、15min、30min、lh、2h取样。低温胁迫是把幼苗放入4°C冷处理，在0h、0. 5h、lh、6h取样。激素处理是分别用100 u mol/L脱落酸(ABA)均匀的喷洒植株表面后，按时间点取样。所有的处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行的。水稻总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII (购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为650C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(0XHS4-1F 5’-TGACGAGGTCTACAAGGCCGT-3’和 0XHS4-1R : 5 ’-ACACCACGTAGCTGCCGCT-3 ’)对 0XHS4 基因进行特异的 PCR 扩增。同时用引物(AF : 5 ’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3 ’和 AR : 5 ’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actin基因(登录号X16280)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明(图1)，0XHS4基因(SEQ NO I)在干旱胁迫后诱导上升表达，在其它处理中表达变化不明显。2、0XHS4基因超量表达载体的构建和遗传转化为了能确认0XHS4基因的抗逆功能，申请人首先将其在水稻中超量表达，期望从转基因植株的表型来研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下首先通过查找在水稻基因组注释网站RGAP(http://rice, plantbiology. msu. edu/) 0XHS4 基因注释号L0C_0s02gl9130,与 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/) 0XHS4注释号AK242745 (该基因的完整核苷酸序列见SEQ IDN0:1所示，序列全长为2215bp。该基因的编码区的核苷酸序列长度为1887bp，其对应的氨基酸序列为628个)。以该编码区序列为参考设计引物。以籼稻品种明恢63幼穗cDNA为模板 ，用引物0XHS40XF (5，-AGGAGGCGCTTCAGGTCT-3，，序列特异弓I物外加接头KpnI位点)和0XHS40XR(5’ -GCATAATCTTCCAGTITCAG-3’，序列特异引物外加接头BamHI位点)，扩增出包含0XHS4基因完整编码区的cDNA片断，本扩增产物就是本发明的序列42-2063bp。反应条件为94°C 预变性 5min ；94V 40sec,50°C 40sec,72°C 2min，32 个循环；72°C 延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。选取阳性克隆质粒用KpnI+BamHI酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在国际上常用的植物遗传转化载体PCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24 I)抽提，纯化酶切产物。用包含0XHS4基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA1301U载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DHlO ^ (该大肠杆菌DHlO ^菌株购自Promega公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为0XHS4-0X-pl301U(载体上的0XHS4基因序列就是SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，序列长度为2215bp，其中第63-1949位为编码区(序列长度为1887bp)。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体0XHS4-0X-pl301U转入到水稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficienttransformation of rice, Oryza sativa L. , mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J,6 :271-282,1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下(I)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6_苄基腺嘌呤)；CN();KT(Kinetin，激动素);NAA(萘乙酸);IAA(吲哚乙酸):2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)HN(潮霉素)；二甲基亚砜(DMSO) ;N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制
硝酸钾(KNO3)28.3 g
磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0 g
硫酸铵((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸镁(MgSO4 .7H20)1.85 g
氯化钙(CaCl2CH2O)1.66 g
逐一溶解,然后室温下定容至1000ml。2) N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16 g
硫酸锰(MnS04.4H20)0.44 g
硫酸锌(ZnS04.7H20)0.15 g室温下溶解并定容至1000ml。 3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)0.1 g
维生素BI (Thiamine HCl)0.1 g
维生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制 硝酸铵(NH4NO3)16.5 g
硝酸钾19.0 g
磷酸二氢钾1.7 g
硫酸镁3.7 g
氯化钙4.4 g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸猛0.86 g
钥酸钠(Na2MoOJH2O)0.025 g
硫酸铜(CuS04.5H20)0.0025 g室温下溶解并定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至IOOml,于室温下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取NAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取IAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁 (FeSO4 7H20) 2. 78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制秤取AS 0. 392g, DMSO 10ml,分装至I. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液秤取氢氧化钾5. 6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方I)诱导培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2,4-D 贮存液2_5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2.4-D贮存液2.0 ml 脯氨酸0.5 g CH0.6 g 蔗糖30 g Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D贮存液0.75 ml CH0.15 g 蔗糖5g 琼脂粉(Agarose)1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D贮存液0.75 ml CH0.2 g 蔗糖5g
琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)0.5 ml
维生素贮存液(100X)I ml
2,4-D 贮存液0.2 ml
CH0.08 g
蔗糖2g 加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 u I AS贮存液。6)选择培养基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2,4-D IC存液0.625 ml
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 ylHN和400ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
6-BA贮存液0.5 ml
KT贮存液0.5 ml
NAA JC存液50
IAA贮存液50 |il
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 u IHN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/ M )。
8)分化培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
6-BA贮存液2 ml
KT贮存液2 ml
NAA贮存液0.2 ml
IAA贮存液0.2 ml
CHI g
鹿糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)5 ml
维生素贮存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤4. I愈伤诱导(I)将成熟的水稻种子去壳，依次用70%的乙醇处理I分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；(2)用灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°C。4. 2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度 25±1°C。4. 3预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1°C。
4. 4农杆菌培养(I)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105 (华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军教授赠送)两天，培养温度28°C ；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。4. 5农杆菌侵染(I)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20。。。4. 6愈伤洗涤和选择培养(I)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm,第二次以后为250ppm)4. 7 分化将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26°C。4. 8 生根(I)剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至生根培养基中，光照下培养2-3周，温度26°C。4. 9 移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田生长至收种。3、0XHS4超量表达转基因水稻干旱胁迫实验本发明采用Northern杂交方法对上述第2步获得的转基因水稻植株中0XHS4基因的表达进行检测。提取叶片的总RNA(Trizc)I试剂，购自Invitrogen公司)后按《分子克隆》(科学出版社，1999)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以0XHS4为探针进行Northern杂交。表达量检测结果显示(图2A)，绝大部分转基因植株中0XHS4基因的表达量相对于野生型(中花11)显著提高。为了验证这一推测，申请人对0XHS4的超表达植株进行了苗期的干旱胁迫。将2个超表达家系(U5和U14)以及所对应的野生型植株中花11在1/2MS培养基上发芽(超量表达转基因家系种子在含有50mg/L的潮霉素的培养基发芽，排除转基因阴性植株)，将发芽一周的植株移栽到装有等量砂土的小红桶中，每桶种植转基因植株和野生型(中花11号)水稻各20株，生长到三、四叶期时(图3A)对每个小红桶中的植株进行断水处理。断水至叶片全卷，叶尖开始发白时给植株复水，统计转基因家系及其对应野生型植株的存活率。从图3B可以看到，复水7天后野生型植株中花11几乎都枯死而超量表达家系(本发明的转基因植株)部分植株仍然活着。进一步对存活率统计发现(图3C)，野生型中花11只有不到20%的存活率，而转基因超表达家系的存活率则在50%左右，显著(t-测验P值小于、0.05)高于同桶种植的野生型对照。植物在受外界逆境胁迫时体内脯氨酸的含量会显著上升，脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性强的植物往往会积累更多的脯氨酸，因此 测定脯氨酸的含量可以作为反映植物抗逆性的重要生理指标。脯氨酸含量的测定与干旱胁迫结果是吻合的，在胁迫前，所有植株体内的脯氨酸含量是一致的，干旱胁迫后，超表达植株体内的脯氨酸含量的增幅要显著(t-测验P值小于0.05)高过野生型植株(图3E)。干旱胁迫实验结果都说明0XHS4超表达转基因植株在苗期比野生型对照有更强的抗旱性。在PVC管中对0XHS4的超表达家系(U5和U14)进行了不同程度的成株期干旱胁迫。将超表达植株移植到PVC管中，同时每根PVC管中种入对应的野生型植株(中花11号)做对照，每个家系种4棵，重复3次。由于在水稻成株期幼穗分化至花粉母细胞减数分裂期即幼穗约5-lOcm时对环境条件反应最为敏感，是决定颖花能否健全发育及谷粒容积大小的关键时期，缺水会导致颖花大量退化，出穗延迟、结实率下降。考虑到断水到植株感受到缺水需要一段时间，所以我们一般在花粉母细胞减数分裂前期开始断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再复水生长。在正常生长条件下超表达植株的各项农艺性状和野生型中花11没有明显的差别，PVC管中的生长情况也是一样的(图4A)。但是在严重干旱胁迫复水后申请人发现对照中花11号即“ZH11”都已经枯黄，而超表达植株仍然保持绿色，维持继续生长的活力(图4B和C)。对0XHS4超表达植株在正常条件和中度干旱胁迫下的单株产量和结实率进行统计(严重干旱胁迫下植株难于结实，所以没有考察产量和结实率)。由于环境影响，我们选择相对产量(胁迫植株的单株产量/正常生长下的植株单株产量)和相对结实率(胁迫植株的结实率/正常生长下的结实率)作为比较指标。结果显示，超表达植株的相对产量(图5A)和相对结实率(图5B)都显著高于野生型ZH11。以上结果表明，超表达0XHS4能提高水稻的耐旱能力。除了对地上部分的各项农艺性状的考察外，还对根进行了根长和根体积两项指标的考察。0XHS4的启动子在渗透胁迫下根中的表达是显著增强的，因此进一步探讨0XHS4的抗旱机制是否与根的生长有联系是非常重要的。结果如图4G-L所示，在正常生长条件下，超表达植株的根的生长要好过野生型ZHll (图4H);而这些差异随着干旱胁迫程度的加重后就变得越来越明显，特别是在严重胁迫下(图4L)。对正常生长(图4M)，中等程度(图4N)和严重干旱胁迫(图40)下的相对根长和相对根体积的统计也证实了上述表型(相对水平是指转基因植株在根长和体积上与同一 PVC管中野生型的比值，对应的比值在图4M-0中的柱状图上已标注)。在根的生长过程中，根尖的伸长主要是依赖于伸长区细胞的延伸，使得根尖不断向土壤深处推进，能够获取更多的水分和营养以度过干旱时期。结果表明，0XHS4可能通过控制根的生长来介导水稻的抗旱性。4、分离基因0XHS4突变体为了进一步验证0XHS4在干旱中的功能，申请人对0XHS4突变体进行了干旱胁迫实验。从水稻突变体库 Rice T-DNA Insertion Sequence Database (RISD)中挑取 0XHS4基因位点相应的T-DNA插入突变体1C_03064(本发明的起始材料即突变体1C-03064，检索地址http://signal, salk. edu/cgi-bin/RiceGE，韩国 P0STECH 植物功能基因组实验室(Plant Functional Genomics Laboratory)。产生这个突变体株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Jeong 等 Generation ofa flanking sequence-tag databasefor activation-tagging lines injaponica rice. Plant J. 2006,45 :123-32.),限于篇幅本说明书不再展开描述。其中在上述网站突变体库中所登录的0XHS4T-DNA突变体1C-03064的侧翼序列(该序列长度为560bp)如下ATCAACTCACCTGGTACCTGGTACCTCGGATCCGTGACCTCAAGCTCTGGGAANCCAGGTGGATGAGTCGTAGGCAATGAAAAGTTCANATGCCCATTC TGTCATGGGTGAAGTAAGAATGCAGGACTACCGTTNCAACNAGCTACTTCANCATGCCATTGGGGTATGGCGCATCCAATCGCTCTCCAAAGGTGAAGGCANACCANNTGGNCTTGGCCANTCTTCTCMGAACNACTATGCTGATGCANCAGGCTCATTGCCATCACGACAGGCCATTGGACCAAGTAATCCTCCAAGGCCATTGCAAGATCAGGAAGCGTATGTTTGGCCATGGATGGGCATCCTTGCAAATGTTCCAGCTGAGAAAACAAAGGAGGATGGANCTAGTCTGATGCANCAGCTANCTAATTTCAATCCCTTGCAGTTTACTGCTG CGCTCTGCTCCCAGGTAGGTATACTGGTTATGCAGTTGTCCGTTTCNCANANATNGGATTGGGTTCACGAACNCCTTG剛NTTNCANAACTNCTTNAAATCNNACGTCTGGNNANAAAGATTGCC (注N 表示测序不确定的核苷酸)。根据T-DNA插入位点，在插入位点两侧设计引物(A :5’ -TGAACACACATCAGTGAGTT-3’ 和 B :5’ -CACCAAATACTTGCTCTTAG-3’ )及载体边界引物(T 5’ -TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’ )，通过PCR检测其插入位点的正确性，结果显示插入位点位于ATG下游IOObp处(见图2B)，分离出两个纯合家系M5和M8。RT-PCR检测了纯合突变体植株的表达量，结果发现0XHS4被完全抑制住(见图2C)，所用引物为(0XHS4RTF 5’-CCGTGTCTGGTCTGGAAAA-3’和 0XHS4RTR :5' -TCTTGAGTCCGATGGTGCT-3')，同时以 Actin作为内对照进行定量分析。5、突变体干旱胁迫表型的鉴定将已鉴定好基因型的突变体oxhs4纯合家系M5和M8以及野生型Hwayoung (购自韩国P0STECH植物功能基因组实验室)催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2 3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型(图3B)。复水后，纯合家系存活率低于30%，而野生型家系仍有60%以上的存活率(图3C)。干旱胁迫后，纯合突变体植株体内的脯氨酸含量的增幅要显著(t-测验P值小于0.05)小于野生型植株(图3E)。为了鉴定这些表型是否真是由于0XHS4的缺失造成的，还是由于其他插入位点或是功能获得性导致的，申请人通过超表达0XHS4转入oxhs4纯合愈伤组织中检测上述表型能否得到恢复来验证上述的推测。将0XHS4的全长连接到PCAMBIA1301U上，转入到oxhs4纯合种子诱导的愈伤组织中，共得到转基因互补植株(CP) 17棵。利用本施例步骤4的引物A、B和T进行阳性检测发现这17棵TO代转基因植株全是阳性的(图2D)，表明0XHS4的全长序列是已经转入oxsh4纯合植株中。通过Real-Time PCR检测了 0XHS4在1-17互补植株幼穗中的表达量，以野生型Hwayoung (简称HY)和纯合突变体 oxhs4 为对照，所用引物(0XHS4QF :5’-GTGACCCAGITGGTAGGTnTTG-3’和0XHS4QR :5’ -TTGCGAGACAGGTCATTTTCC-3J )。结果发现0XHS4在互补植株的表达量都明显高于在HY和oxhs4中的表达(图2E)，表明外源片段0XHS4全长的转入在突变体oxhs4中是表达的。苗期干旱胁迫实验显示互补植株相比突变体oxhs4表现出耐旱表型(图3B)，存活率显著增强(图3D)。这些结果表明0XHS4的缺失会造成水稻的耐旱性减弱。同时申请人也在PVC管中对突变体oxhs4进行了成株期的干旱胁迫实验，实验方法同实施例的第3部分所述。在中度干旱胁迫过程中，纯合突变体植株叶片已完全卷曲，而野生型植株HY叶片仍然展开着，表现出较oxhs4好的生长态势(图4E);严重干旱胁迫复水后，如图4F所示，野生型HY恢复迅速，生长良好；而0处84已经枯死(图4F)。根长和根体积的测定结果显示，在正常生长条件下，突变体根的生长要比野生型HY差一些(图4G); 而这些差异随着干旱胁迫程度的加重后就变得越来越明显，特别是在严重胁迫下(图41和K)。对正常生长(图4M)，中等程度(图4N)和严重干旱胁迫(图40)下的相对根长和相对根体积的统计也证实了上述表型。在中度干旱胁迫下，突变体oxhs4的相对产量(图5A)和相对结实率(图5B)都显著低于野生型HY。由此可见，0XHS4的缺失导致了根的生长减慢，在缺水的环境下变得更为明显，造成水稻的耐旱能力减弱。
权利要求
1.水稻0XHS4基因在控制水稻根系生长的抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第63-1949位所示。
2.水稻0XHS4基因在控制水稻根系生长的抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的编码的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所不。全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够通过控制根的生长，提高干旱耐受能力的水稻基因OXHS4在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗旱基因OXHS4，通过苗期和成株期干旱胁迫实验发现超量表达OXHS4基因可以提高转基因水稻抗干旱的能力，而突变体oxhs4表现出对干旱敏感，证实了该基因的功能及应用途径。
文档编号A01H5/00GK102732528SQ20111009403
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者熊立仲, 覃永华 申请人:华中农业大学