枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法
【专利摘要】一种枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法，按如下五个步骤进行：一是分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列，二是分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全长序列，三是枇杷EJPFPb基因双元表达载体的构建，四是烟草的遗传转化，五是转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定。采用本方法获得的转基因烟草植株生长快，叶片中蔗糖含量明显下降，葡萄糖含量基本不变，果糖含量提高3%-10%，实现了利用EJPFPb基因调控糖组成及糖水平，改善烟草风味品质的目的，而且利用这种新获得的枇杷EJPFPb基因，拓宽至用于转接至其它蔬菜、果树和粮食作物，具有有望改善受体作物品质风味的前景。
【专利说明】枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物转基因【技术领域】，具体涉及一种枇杷(iZrioAoirja japonicaLindl.) EJPFPb及其编码基因改善烟草(Ai'coiiaaa tabacum)糖水平的方法。
【背景技术】
[0002]糖酵解是调控植物糖代谢的最重要途径。糖酵解途径有三个限速位点，这三个位点分别是由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶这三种酶作用。这三种酶催化的反应都是不可逆反应，因此这三种酶是糖酵解的限速酶。其中，磷酸果糖激酶是一类激酶，可作用于果糖-6-磷酸，反应产物为果糖-1，6- 二磷酸或果糖_2，6- 二磷酸。植物中的磷酸果糖激酶分为两种，一种是依赖ATP的ATP:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(ATP:Fru-6-P1-phosphotransferase, EC 2.7.1.11),简称为ATP-PFK ;另一种是依赖焦磷酸的焦磷酸:果糖 _6_ 憐酸 1-憐酸转移酶(pyrophosphate: Fru-6-P 1- phosphotransferase, EC2.7.1.90)，简称为PFP。PFP通常由α和β两个亚基组成，这两个亚基由不同的基因编码，α亚基具有调节活性功能，而β亚基具有催化活性。研究表明，通过调控PFP基因的表达，可以调节植株组织中的糖水平，例如，在甘蔗中下调PFP基因表达使蔗糖水平提高，果糖水平下降(Groenewald et al.Transgenic research, 2008,17:85 -92 ；van der Merweet al.Planta，2010，231:595-608)。糖是水果风味的重要组成物质，其中果糖对风味构成起更为关键的作用，因此，如能通过PFP基因实现对糖组成及糖水平的调控，可为水果风味的改善提供技术依据；糖类与烟草的品质关系密切，是影响烟草吸味的最重要化学组分之一，对烟气的酸碱平衡和焦油含量有直接影响，无疑，利用PFP实现烟草糖分的调控，对改善烟草品质是有益的、可行的，但至今未见相关的资料报道和新植株问世。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法。
[0004]解决上述技术问题采用如下技术方案:
本枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法按如下步骤进行:
(1）分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列:提取枇杷叶片总RNA，反转录合成cDNA,通过与GenBank已知的植物焦磷酸:果糖_6_磷酸1_磷酸转移酶pyrophosphate:Fru-6-P 1- phosphotransferase β亚基序列进行比对设计简并引物，利用反转录PCR获得扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到PMD18-T载体中并测序，利用分子生物学工具分析测序结果，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，确定为枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因EJPFPb的保守区片段；
(2)分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全长序列:根据上述枇杷焦磷酸:果糖_6_磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因cDNA片段序列设计引物，通过cDNA末端快速扩增技术获得基因的全长cDNA序列，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，通过分析基因编码区及焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基特有的功能域确定分离到枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基全长cDNA序列，并命名为EJPFPb，EJPFPb基因编码区核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2 所示；
(3)枇杷EJPFPb基因双元表达载体的构建:根据上述基因EJPFPb的完整编码区设计引物，进行PCR扩增，利用无缝克隆技术将扩增产物与经过酶切的植物表达载体pCAMBIA-1302进行连接，将EJPFPb正向插入pCAMBIA-1302，获得植物过量表达重组双元表达载体，命名为 pCAMBIA-1302-EJPFPb ；
(4)烟草的遗传转化:将上述表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb利用农杆菌介导法转化烟草，获得具有特异抗生素抗性的转基因植株，提取转基因植株叶片DNA，利用特异引物进行PCR扩增鉴定，确定成功获得转基因植株，单株收种子，对其后代进行观察鉴定；
(5)转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定:将转基因烟草种子进行播种，转基因烟草与未转基因烟草进行生长速度的对比试验，生长速度明显加快；定期采集叶片进行糖含量的高效液相色谱分析，转基因烟草叶片的蔗糖水平显著降低，而果糖水平显著提高，说明EJPFPb基因既加快烟草生长速度，又能提高叶片的果糖水平，烟草品质明显改
[0005]本发明的有益效果是，从枇杷中分离克隆到EJPFPb基因全长cDNA序列，将该基因的编码区以正向方式插入到植物双元表达载体并转入烟草中，与未转基因植株相比，转基因植株生长加快，叶片中蔗糖含量明显下降，而果糖含量提高3%-10%，因此，本发明实现了利用EJPFPb基因调控糖组成及糖水平，对改善烟草的风味品质具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1为本申请所用植物双元表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb构建示意图。
[0007]图2为转基因烟草不同时期的生长形态图。
[0008]图3为转基因烟草叶片的PCR检测电泳图。
[0009]图4为转基因烟草与对照烟草叶片糖含量对比图 图5为烟草叶片糖含量测定的HPLC峰形图。
【具体实施方式】
[0010]本发明下面结合实施例并参照附图作进一步详述。下述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的试剂，如无特殊说明，均为购自生化试剂公司的常规试剂。所述的对照烟草或野生型烟草均系未转基因烟草。
[0011](I)分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列
采用改良CTAB法提取枇杷叶片总RNA，具体步骤如下:提前预热RNA提取液500μ1 (2%CTAB, 2% PVP, IOOmM Tris, 25mM EDTA, 2M Nacl, ρΗ8.0)于 65°C水浴锅中；将 0.2g 枇杷叶片加入液氮中研磨成粉末，迅速将粉末转入预热好的提取液中，然后快速加入40μ1的巯基乙醇和少量亚精胺涡旋混匀；在65°C水浴锅中培养15min ;加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),润旋混匀，1000Orpm,4°C, 20min ;取上清,加入等体积的氯仿异戍醇，润旋混匀，1000Orpm, 4°C，20min ;取上清，加入1/4体积的IOM Licl,倒转混匀，放于4°C冰箱过夜(8-16 小时)；1000Orpm, 4°C，35min,弃上清，加入 500μ1 的 SSTE (1.45g NaCl,0.125gSDS, 50μ1 0.5Μ EDTA(pH 8.0) ,0.25mlIM Tris (pH8.0)，定容至 25ml)和 2 倍体积的100%的乙醇，-70°C放置30min，取出，12000rpm，4°C，20min ;弃上清，加入Iml 75%的乙醇，12000rpm, 4°C, IOmin ;弃上清，常温干燥；加入30μ1 DEPC水溶解，进行电泳及紫外分光光度计检测；
利用反转录酶将总RNA反转录合成第一链cDNA，具体步骤如下:在DEPC处理过的1.5mL离心管中加入约IKg总RNA和?μ? 0.5Kg/Kl的Oligo (dT) 18 primer,小心混匀，70°C保温5 min,立即置于冰上；按次序分别加入下列试剂:5μ1 5 XM-MLV RT Buffer, 2μ1dNTP mix (2.5mM), IM-1 RNase 抑制剂(30U/ML),1M<1 M-MLV Reverse Transcriptase,然后加DEPC水到25μ1 ;小心混匀，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底，37°C保温I小时；90°C5 min，冰上冷却，_20°C保存备用；
通过与GenBank已知的植物果糖_6_磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因序列进行比对设计简并引物，具体步骤如下:在NCBI查找并下载植物果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基序列，将所下载序列保存为fasta格式，利用Clustalx进行序列比对，根据序列相似性判断植物果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因的保守区，根据保守区序列设计简并引物，弓丨物序列如下:上游引物:5’ -TATGCAGAAATGATTGG(A/G)AATGT-3’ ;下游引物 5’ -ACATT (G/C/T) CC (G/A) TGTGGATCTCT-3 ’。以上述cDNA为模板，通过此对引物进行PCR扩增，回收扩增片段并测序，获得枇杷果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基EJPFPb基因保守区片段；
(2)分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全长序列
根据上述测序信息设计引物用于cDNA末端快速扩增(RACE)，用于5’ RACE扩增的引物为:5，-CATTCACGATGTGGTCAGTGACAT-3，(SEQ ID No:3)和 5，-TAATGTGTGAAGCTGCACGTCC-3，(SEQ ID No:4);用于 3’RACE 扩增的引物为:5’ - GCGTGCTGACCTTGGTTATAACTATGG-3’(SEQID(SEQ ID No:6);参考 5’-Full RACE Kit
和3’-Full RACE Kit (TaKaRa)进行RACE扩增，通过RACE技术获得基因未知区域的序列，进行序列拼接获得基因的全长序列，将该基因命名为EJPFPb，该基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；按照拼接序列的两端设计引物，扩增得到该基因的完整序列，并克隆到PMD18-T载体，获得pMD18-T-EJPFPb。
[0012](3)枇杷EJPFPb基因双元表达载体的构建
根据(2 )中获得的枇杷EJPFPb基因编码区设计引物，上游引物为EJPFPb-F: 5 ’ -CGGGGGACTCTTGACATGGCTGCACCATCACTGGTTGC-3，(SEQ ID No: 7 ):下游引物为 E TPFPb-R: 5，-ACTAGTCAGATCTACCATGGAAACAGAAACTCCGAGTTCCAAGAGTAGCG -3’ (SEQ ID No:8).下划线区域的序列为附加序列，用于和表达载体的无缝克隆。以步骤(2)的载体pMD18-T-EJPFPb质粒DNA为模板，扩增编码区序列，PCR体系如下:
10 X AccuPrime pfx Reaction mix 5M-1
10 X enhancer 5M-1
EJPFPb-F (10μΜ) ?μ?
EJPFPb-R (10μΜ) ?μ?
pMD18-T-EJPFPb 质粒 DNA (20ng/^L) ?μ?AccuPrime pfx polymerase (2.5U /M-L) 0.5M-1
PCR water 36.5M-1
扩增条件为:94 °C 3min lcycle ；94 °C 30sec, 58 °C 30sec,68 °C 2min IOsec,28cycles ；68 °C IOmin lcycle ；4 °C forever lcycle。PCR 反应结束后按照 TaKaRaAgarose Gel DNA Extraction Kit 回收目的片段。
[0013]用AfcoI单酶切pCAMBIA-1302载体，酶切体系如下: pCAMBIA-1302 载体质粒(200ng/^l) 5μ1
NcoI ?μ?
lOXFastDigest? Green Buffer 5M-1
ddH20 39μ1
37度酶切2小时后电泳切胶回收；
将目的片段和载体进行无缝克隆和重组(GENEART? Seamless Cloning and AssemblyKit, Invitrogen),反应体系如下:
5 X Reaction buffer 4M-1
DNA 片段(lOOng/μΙ) 2μ1
pCAMBIA-1302 vector (NcoI) (50ηδ/μ1) 2μ1
ddH20 ΙΟμΙ
10 X Enzyme Mix 2M-1
25°C连接30min后置于冰上，取8μ1反应液转化感受态细胞DH5 α。测序验证重组克隆插入片段的序列信息，含有目的基因序列的正确质粒命名为pCAMBIA-1302-EJPFPb(双元表达载体结构见图1)。
[0014](4)烟草的遗传转化
将上述构建的植物双元表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb转化至农杆菌菌株LBA4404，28°C培养，挑取携带植物表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb质粒的农杆菌单菌落，接种在3-5ml含50mg/L rif和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过夜，直至对数生长OD6tltl为0.6-0.8 ;活化过夜的农杆菌按1:100-1:50的比例接种在相同的20_50mlYEB液体培养基中，继续培养至对数生长期；取烟草无菌叶片，切成4-6mm的叶盘到无菌瓶中,加入农杆菌菌液,感染IOmin,期间轻微振荡,取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液；将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d-4d ;将共培养的外植体转移到分化培养基上，25°C，光照培养。每隔3-4周继代一次，待转化后的外植体长出大量丛生芽即转入生根培养基，培养筛选的抗性芽长1-1.5cm时，从基部将芽切下，并转入含有适宜抗生素的生根培养基上诱导生根，获得具有潮霉素抗性的转基因植株；待植株长到一定高度时移出组培瓶，在含有蛭石、珍珠岩等的基质中继续培养；选择抗性植株，单株收种子，对其后代进行观察鉴定(转基因烟草不同时期的生长形态图见图2)。
[0015]对获得的抗性植株进行进一步的鉴定，主要步骤如下:取0.2 g幼嫩叶片，加入研钵中，加入 2% CTAB 提取液(2% CTAB, 1.4M NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, pH8.0, 2%β -巯基乙醇)700μ1研磨，研磨好后转入1.5ml离心管中，65°C保温20min ;冷却后加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀，1000Orpm lOmin，取上清液至一新离心管，加入100μ15Μ NaCl和Iml乙醇，沉淀DNA，离心去上清，70%乙醇洗沉淀，干燥后溶解于100μ1 TE中。以35S CaMV序列设计引物，上游引物为5’ -GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3’，下游引物为5’-CCCCGTGTTCTCTCCAAAT-3’，以上述提取到的DNA为模板，进行PCR扩增，检测到有条带(500bp)的即为阳性植株，即转基因植株(转基因烟草的PCR检测电泳图见图3)。转基因植株单株收种子，播种。
[0016](5)转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定
将转基因烟草种子进行播种，转基因烟草与未转基因烟草进行生长速度的对比试验，定期测定植株高度，与未转基因植株相比，转基因植株的生长速度明显加快；定期采集叶片进行糖含量的高效液相色谱分析，步骤如下:
糖的提取及测定:提取液为乙醇:氯仿:水(E:C:W) = 12:5:3。取上述(4)获得的转基因植株叶片Ig剪碎研磨3-5 min,加入5倍体积(w/v)的提取液,5000g离心5 min.取上清液，重复3次。合并提取液，转入分液漏斗，加入水和氯仿使E:C:W = 10:6:5，分层，去掉氯仿相。用0.1 mol/L NaOH调pH值至7.0,40°C减压真空蒸干,超纯水定容，WatersSep-Pak-C18固相萃小柱预分离，过滤灭菌。糖含量测定用Waters高效液相色谱仪(HPLC)进行。色谱条件为:柱温为90°C，流动相为超纯水，流速0.5ml/min。蔗糖、葡萄糖和果糖通过出峰时间及峰面积与标样比较来定性和定量。转基因烟草叶片的蔗糖水平显著降低，而果糖水平显著提高，说明EJPFPb基因既加快烟草生长速度，又能提高叶片的果糖水平，烟草品质明显改善。(转基因烟草与对照烟草叶片糖含量对比图见图4，样品HPLC峰形图见图5)
下面，将与本申请有关的试验情况介绍如下:
尚需说明的是图1表示本申 请所用植物双元表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb构建示意图，其中所标记的(I)表示潮霉素抗性标记基因，(2)表示35S CaMV启动子，(3)表示EJPFPb，(4)表示绿色荧光蛋白，(5)表示NOS终止子，(6)表示NocI酶切插入位点。EJPFPb位于35S CaMV下游，GFP绿色荧光蛋白上游。
[0017]图2为转基因烟草不同时期的生长形态图，其中所标记的(I)为侵染后的愈伤诱导后烟草生长形态图，(2)为生根诱导后烟草生长形态图，(3)为转基因烟草移栽入土壤后的烟草生长形态图。
[0018]图3为转基因烟草叶片的PCR检测电泳图，从左侧起第一泳道为DL2000 MARKER、转基因植株1、2、3、野生型植株、阴性对照(不含模板、只加扩增引物)、阳性对照(含有EJPFPb的质粒DNA)。图3显示出，阳性对照和转基因植株均可扩增出500bp条带，而阴性对照和未转基因植株均未扩增出这一条带，说明EJPFPb基因在转基因植株1、2、3中成功表达，而在未转基因植株中不表达。
[0019]图4为转基因烟草与对照烟草叶片糖含量对比图，纵坐标表示糖含量(单位mg/g.Fff),葡表示葡萄糖,果表示果糖,鹿表示鹿糖,横坐标从左侧起分别表示野生型烟草、转基因烟草1、2、3。每一横坐标对应3种糖含量，从左向右分别为:葡萄糖、果糖、蔗糖。图4显示出转基因烟草叶片中的蔗糖含量均低于野生型烟草，果糖含量均高于野生型烟草，说明EJPFPb基因可以提高烟草叶片的果糖水平。
[0020]图5为烟草叶片糖含量测定的HPLC峰形图，从左侧起分别为蔗糖、葡萄糖、果糖，说明HPLC检测烟草叶片的蔗糖、葡萄糖、果糖水平方法可行。
【权利要求】
1.一种枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法，其特征是按如下步骤进行: (O分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列:提取枇杷叶片总RNA，反转录合成cDNA，通过与GenBank已知的植物焦磷酸:果糖_6_磷酸1_磷酸转移酶β亚基序列进行比对设计简并引物，利用反转录PCR获得扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到PMD18-T载体中并测序，利用分子生物学工具分析测序结果，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，确定为枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因EJPFPb的保守区片段； (2)分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全长序列:根据上述枇杷焦磷酸:果糖_6_磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因cDNA片段序列设计引物，通过cDNA末端快速扩增技术获得基因的全长cDNA序列，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，通过分析基因编码区及焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基特有的功能域确定分离到枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基全长cDNA序列，并命名为EJPFPb，EJPFPb基因编码区核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2 所示； (3)枇杷EJPFPb基因双元表达载体的构建:根据上述基因EJPFPb的完整编码区设计引物，进行PCR扩增，利用无缝克隆技术将扩增产物与经过酶切的植物表达载体pCAMBIA-1302进行连接，将EJPFPb正向插入pCAMBIA_1302，获得植物过量表达重组双元表达载体，命名为 pCAMBIA-1302-EJPFPb ； (4)烟草的遗传转化:将上述表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb利用农杆菌介导法转化烟草，获得具有特异抗生素抗性的转基因植株，提取转基因植株叶片DNA，利用特异引物进行PCR扩增鉴定，确定成功获得转基因植株，单株收种子，对其后代进行观察鉴定； (5)转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定:将转基因烟草种子进行播种，转基因烟草与未转基因烟草进行生长速度的对比试验，生长速度明显加快；定期采集叶片进行糖含量的高效液相色谱分析，转基因烟草叶片的蔗糖水平显著降低，而果糖水平显著提高，说明EJPFPb基因既加快烟草生长速度，又能提高叶片的果糖水平，烟草品质明显改盡口 ο
【文档编号】C12N15/10GK103789345SQ201410050704
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】秦巧平, 崔永一, 林飞凡 申请人:浙江农林大学