改善间充质干细胞成骨能力的rna分子及其作用靶点和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物【技术领域】的一种改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子及其作用靶点和应用。本发明的小RNA分子其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，该小RNA分子能够特异性抑制ICAM-1在间充质干细胞上的表达，并显著解除ICAM-1的对于骨形成的抑制作用，促进间充质干细胞向成骨细胞分化；有助于改善间充质干细胞在炎性微环境的成骨能力，促进骨再生，有利于骨修复。本发明还公开了小RNA分子在制备改善间充质干细胞成骨能力、治疗炎症因素引起的骨质疏松，骨质破坏，骨愈合缓慢药物中的应用。
【专利说明】改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子及其作用靶点和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子及其作用靶点和应用。
【背景技术】
[0002]创伤和疾病等原因导致的骨组织缺损是临床常见且较难处理的问题，如何促进骨组织缺损的修复一直是相关领域学者的研究重点。近年来，通过组织工程技术的应用，相关问题得到了一定程度的解决。通过给予受损部位填充模拟细胞外基质的生物材料，植入具有分化为新生组织能力的种子细胞，来实现受损伤组织的修复，已经被基础研究和临床应用证明为一项较为有效的治疗策略。
[0003]间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在适宜的条件下可以分化成为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等成熟细胞。间充质干细胞的这种多向分化的特性，使其有可能成为修复多种组织损伤的种子细胞。间充质干细胞还具有高度增殖的能力，可以在较短的时间内从较少数量扩增至临床治疗所需数量，满足临床治疗的需要。由于间充质干细胞便于扩增，在体内外可以分化为多种组织细胞，目前，它已经成为再生医学领域的研究热点。研究人员运用间充质干细胞治疗先天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常等疾病，并且取得了满意的效果(Chiu LH, Lai WF, Chang SF, Wong CC, Fan CY, FangCL，Tsai YH.The effect of type II collagen on MSC osteogenic differentiationand bone defect repair.Biomaterials.2014;35 (9):2680-2691.McCoy RJjWidaaA,Watters KMj Wuerstle M，Stallings RLj Duffy GP，O’Brien FJ.0rchestratingosteogenic differentiation of mesenchymal stem cells—identification ofplacental growth fac`tor as a mechanosensitive gene with a pro-osteogenicrole.Stem Cells.2013; 31 (11): 2420-2431.Pereira RF，0’ Hara MD，Laptev AVj HalfordKWj Pollard MD，Class R，Simon Dj Livezey K，Prockop DJ.Marrow stromal cells asa source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenicmice with a phenotype of osteogenesis imperfecta.Proc Natl Acad Sci U SA.1998;95(3):1142-1147.)。但是，随着对间充质干细胞研究的深入，越来越多的未知领域展现出来，等待深入研究。
[0004]间充质干细胞的骨修复作用常常受到局部微环境的调节。外伤和感染所致的骨缺损常常导致骨组织感染，骨缺损局部常常伴随着炎性细胞因子浸润。而自身免疫性疾病导致的骨质破坏也常常伴有局部骨组织内炎性细胞因子的增高。炎性细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素I等常常抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，影响骨再生修复。因此，发现新的作用靶点，促进间充质干细胞在炎性微环境向成骨细胞分化，改善骨再生修复的效果，是相关领域科学研究和临床应用的重要问题。
[0005]最近通过研究发现:细胞间粘附分子I (intercellular cell adhesionmolecule, ICAM-1)是一个调控间充质干细胞向成骨细胞分化的靶点。ICAM-1属粘附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)，能够介导淋巴细胞粘附与迁移，在机体免疫过程和炎性反应中起重要作用。近来有研究表明ICAM-1是间充质干细胞发挥免疫抑制作用的关键分子。然而，关于ICAM-1对于间充质干细胞自身的生物学特性尤其是分化能力是否具有调节作用及其作用机制却未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种改善间充质干细胞成骨能力的小RNA分子。
[0007]本发明的第二个目的在于提供上述小RNA分子的作用靶点。
[0008]本发明的第三个目的在于提供一种间充质干细胞。
[0009]本发明的第四个目的在于提供上述小RNA分子在制备改善间充质干细胞成骨能力药物中的应用。
[0010]本发明的第五个目的在于提供小RNA分子在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松，骨质破坏，骨愈合缓慢药物中的应用。
[0011]本发明的第六个目的在于提供上述间充质干细胞在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松、骨质破坏、骨愈合缓慢，天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常药物中的应用的应用。
[0012]实现本发明的技术方案如下:
[0013]一种改善间充质干细胞成骨能力的小RNA分子，所述小RNA分子为靶向ICAM-1的mRNA的反义核酸，其序列为
[0014]5’-UUUGACAGACUUCACCACCTT-3’(SEQ ID N0.1)。
[0015]上述小RNA分子的作用靶点，所述作用靶点为ICAM-1的mRNA序列中一段，其核酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0016]作用靶点的序列为5’ -GGUGGUGAAGUCUGUCAAA-3’(SEQ ID N0.2)。
[0017]一种间充质干细胞，其含有上述的小RNA分子。
[0018]上述间充质干细胞在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松、骨质破坏、骨愈合缓慢，天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常药物中的应用。
[0019]上述小RNA分子在制备改善间充质干细胞成骨能力药物中的应用。
[0020]上述小RNA分子在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松,骨质破坏,骨愈合缓慢药物中的应用。
[0021]本发明的小RNA分子可以通过RNA人工合成的方法制备。
[0022]本发明的小RNA分子能够特异性抑制ICAM-1在间充质干细胞上的表达，并显著解除ICAM-1的对于骨形成的抑制作用，促进间充质干细胞向成骨细胞分化。本发明的小RNA分子有助于改善间充质干细胞在炎性微环境的成骨能力，促进骨再生，有利于骨修复。本发明中的方法操作简单、靶标明确、方便实用，能够显著促进间充质干细胞向成骨细胞分化，对于改善炎性微环境中的骨修复具有积极意义。
【专利附图】
【附图说明】`
[0023]图1为类风湿关节腔液抑制间充质干细胞的早期成骨(碱性磷酸酶染色)和晚期成骨(Von kossa)能力；图中标尺均代表100微米。
[0024]图2为类风湿关节腔液抑制成骨过程中的重要蛋白Runx2 (图2A)和OCN (图2B)的表达。(*，P < 0.05, **，P < 0.01)。
[0025]图3为类风湿关节腔液诱导间充质干细胞内的ICAM-1的mRNA表达；图3A为ICAM-1的mRNA表达与类风湿关节腔液的浓度关系；图3B为类风湿关节腔液诱导间充质干细胞内的ICAM-1的mRNA表达随时间的变化；图3C为类风湿关节炎关节腔液诱导间充质干细胞表面的ICAM-1的蛋白表达(*，P < 0.05，**，P < 0.01)。
[0026]图4为给予靶向ICAM-1的反义序列核酸和无义序列核酸对间充质干细胞的成骨能力的影响，图中标尺均代表100微米。
[0027]图5为给予靶向ICAM-1的反义序列核酸可以改善间充质干细胞内Runx2 (图5A)和 OCN(图 5B)的表达(*，P < 0.05)。
[0028]图6为采用基因工程导入ICAM-1能够抑制间充质干细胞的早期成骨(碱性磷酸酶染色)和晚期成骨(Von kossa)能力，图中标尺均代表100微米。
[0029]图7为采用基因工程导入ICAM-1能够抑制成骨过程中的重要蛋白Runx2 (图7A)和 OCN(图 7B)的表达。(*，P < 0.05，**，P < 0.01)。
[0030]图8为靶向ICAM-1的反义序列核酸改善间充质干细胞的成骨能力，图中标尺均代表100微米。
[0031]图9为靶向ICAM-1的反义序列核酸改善间充质干细胞内Runx2 (图9A)和0CN(图9B)的表达(*，P < 0.05，**，P < 0.01)。
【具体实施方式】
[0032]以下将通过具体实施例对本发明做进一步说明，如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人熟知的常规手段。
[0033]实施例1本发明的小RNA分子的制备
[0034]经发明人研究结果表明ICAM-1能够抑制间充质干细胞的成骨分化。以炎性物质(类风湿关节炎病人的关节腔液)刺激间充质干细胞，再将间充质干细胞向成骨细胞诱导分化，以此模拟炎性微环境中的成骨过程。经研究发现间充质干细胞中的ICAM-1的蛋白和mRNA表达水平均显著升高，于此同时，间充质干细胞的成骨分化能力显著降低。为了进一步验证ICAM-1对于成骨分化的抑制作用，采用基因操作技术把ICAM-1转染入间充质干细胞内，使ICAM-1在间充质干细胞中高表达。结果发现高表达ICAM-1抑制间充质干细胞的成骨能力。丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路与细胞的增殖和分化密切相关，为了揭示ICAM-1抑制成骨活动的分子机制，为了进一步确认，研究了 ICAM-1抑制间充质干细胞成骨能力的分子机制，结果表明ICAM-1通过活化ERK/MAPK通路来抑制成骨活动。
[0035]本发明的改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子是针对ICAM-1的mRNA的反义核酸。其作用靶点是ICAM-1的mRNA序列中特异的一段序列
[0036]5’ -GGUGGUGAAGUCUGUCAAA-3’，针对靶点设计反义序列，即本发明的小RNA分子的序列为 5’ -GGUGGUGAAGUCUGUCAAATT-3’ (SEQ ID N0.1)。
[0037]上述小RNA分子委托广州瑞博公司直接合成，合成后进行干燥处理成干粉。
[0038]实施例2含有本发明的小RNA分子的间充质干细胞的制备[0039]本发明的含有上述小RNA分子的间充质干细胞，其可以通过将小RNA分子连同转染试剂Lipofectamine2000共同转染间充质干细胞得到。
[0040]其中，所述小RNA分子的转染终浓度可以为IO-1OOnM,优选为50nM, Lipofectamine2000的转染终浓度可以为10-100 μ L/mL，优选为50 μ L/mL。转染时间为 24_96hours,优选为 48hours。
[0041]转染过程中使用的间充质干细胞培养基是向a-MEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清的终浓度为5-20% (体积百分含量)得到的培养基；培养基优选为向a -MEM培养基中添加胎牛血清，胎牛血清的终浓度为10% (体积百分含量)得到的培养基。
[0042]a -MEM培养基的组成:1L a -MEM培养基含12.1g a -MEM粉末、终浓度为2mmol/L的 L-谷氨酸胺(L-glutamine)和终浓度为 2SmmoI /I,的 HEPES buffer 和 2.4g NaHC03。
[0043]所述培养的条件可以为温度为35_38°C、CO2浓度为5_15% (体积百分含量)、饱和湿度、培养的时间是3-4天；所述温度优选为37°C，所述CO2浓度优选为5%。
[0044]上述方法中所述间充质干细胞具体可以为人，小鼠，大鼠，兔，狗和猴间充质干细胞。
[0045]实施例3针对ICAM-1的反义核酸序列改善炎性微环境中间充质干细胞的成骨分化能力
[0046]1、制备无细胞关节腔液
[0047]类风湿关节炎是一类自身免疫性疾病，以侵犯四肢关节并最终导致关节骨质破坏为主要特征。病人的关节腔内常常充满了炎性关节腔液，有研究表明其中包含有大量的炎性细胞因子如白细胞介素`I和肿瘤坏死因子α等，是模拟炎性微环境中骨代谢的有力工具(Rivollier A, Mazzorana M, Tebib J, Piperno M, Aitsiselmi T, Rabourdin-CombeC，Jurdic P, Servet-Delprat C.1mmature dendritic cell transdifferentiationinto osteoclasts: a novel pathway sustained by the rheumatoid arthritismicroenvironment.Blood.2004; 104 (13): 4029-4037.),因此,本发明根据国际惯例米用 T类风湿关节炎病人的关节腔液和间充质干细胞共同培养，观察炎性微环境中间充质干细胞的成骨情况及其和ICAM-1之间的关系。20位知情同意的志愿者，均符合1987年美国风湿学会诊断标准，未经抗炎治疗。取关节腔液样本的方式为无菌条件下穿刺抽取至抗凝管。
[0048]将抗凝的关节腔液样本以6000G离心20分钟，取上清液，弃细胞，将上清过滤后，冻存于_70°C冰箱备用。
[0049]2、用无细胞关节腔液刺激间充质干细胞
[0050]把小鼠间充质干细胞C3H10Tl/2(购买自美国ATCC公司)，按2 X IO5/孔接种于6孔培养板，把间充质干细胞培养基(由a -MEM培养基和胎牛血清组成，均购自美国GIBCO公司，胎牛血清的终浓度为5-20% (体积百分含量))和无细胞关节腔液按照不同的体积比混合(100:0;95:5;90:10;80:20),每个培养孔加入3ml，刺激24小时。
[0051]3、成骨分化的定向诱导与鉴定
[0052]每孔加入成骨诱导体系(地塞米松0.1 μ mol/L、β -甘油磷酸钠盐10mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 μ mol/L)3ml，每2天全量换液，培养第2周按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒操作步骤进行ALP染色，培养3周给予Von kossa染色。ALP染色是成骨早期的检测指标，而Von kossa染色反映的是成骨晚期的时候钙盐沉积的情况。如图1所示，当类风湿关节炎病人的关节腔液浓度从O提升到5%，10%和20%的时候，间充质干细胞的ALP染色逐渐变淡，说明早期成骨活动下降，而Von kossa染色的结果也表明，随着关节腔液浓度的提升，晚期成骨活动也受到了抑制。图中微标尺均代表100 μ m。
[0053]4、检测成骨分化的重要调节蛋白
[0054]Runx2和OCN是促进成骨分化的重要调节蛋白，检测它们的表达情况可以从分子层面判断间充质干细胞的成骨分化情况。诱导10天后，全量吸出诱导液，加入3mlPBS，轻轻摇晃培养板，洗涤剩余诱导液。然后每个培养孔加入Iml的Trizol，提取RNA，根据PrimeScript逆转录试剂盒说明书,将总RNA逆转录为cDNA,利用SYBR Green JumpStartTMTaq ReadyMixTM试剂盒并以60°C为退火温度进行real-time PCR。引物序列详见表1。结果以平均数土标准差表示，组间比较采用Student’ s t test。图2A和图2B显示的是随着类风湿关节炎病人的关节腔液浓度不断提升，Runx2和OCN的表达水平逐渐下降。关节腔液刺激各组与未刺激组相比，下降幅度均具有统计学意义。(*，P < 0.05;**，P < 0.01)。
[0055]表1为基因real-time PCR的引物和条件
[0056]
【权利要求】
1.一种改善间充质干细胞成骨能力的小RNA分子，其特征在于，所述小RNA分子为靶向ICAM-1的mRNA的反义核酸，其核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的小RNA分子的作用靶点，其特征在于，所述作用靶点为ICAM-1的mRNA序列中一段，其核酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一种间充质干细胞，其含有权利要求1所述的小RNA分子。
4.权利要求1所示的小RNA分子在制备改善间充质干细胞成骨能力药物中的应用。
5.权利要求1所示的小RNA分子在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松，骨质破坏，骨愈合缓慢药物中的应用。
6.权利要求3所述的间充质干细胞在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松、骨质破坏、骨愈合缓慢，天性成骨不全，骨缺损，骨软`骨发育异常药物中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103820438SQ201410050371
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】张毅, 朱恒, 唐博, 李喜梅, 褚亚男, 刘元林 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所