人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法

人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎盘羊膜，针对羊膜的上皮层和间充质层所含有的细胞特点，采用了逐步分离的方法，最大限度地减少了羊膜间充质层细胞对胎盘亚全能细胞的污染，有效地提高了人胎盘亚全能细胞的干性。该方法具有成本低、应用前景广阔、可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本发明还提供了一种从胎盘羊膜制备人胎盘亚全能干细胞并建立干细胞库的方法。
【专利说明】人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞领域，具体地涉及一种其来源于人类胎盘羊膜的亚全能干细胞。同时，本发明也涉及该亚全能干细胞的制备方法以及诱导分化方法。
【背景技术】
[0002]干细胞研究是近年来涌现出的研究热点，其飞速的研究进展及广阔的应用前景使干细胞研究得到越来越多的瞩目。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，根据来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。其中成体干细胞因为不具有伦理争议，且容易获得而被认为是潜在的细胞治疗的种子细胞。
[0003]近年来研究表明，在成体胎盘组织中，富含着一种具有多向分化能力的亚全能干细胞。胎盘是哺乳动物妊娠期间母子间交换物质的过渡性器官，其生理功能已被广泛研究，但是胎盘作为一种细胞资源，其研究还处在起步阶段。本发明所涉及的胎盘亚全能干细胞是一种来源于胎盘羊膜的上皮干细胞。研究表明，羊膜的上皮层起源于受精卵形成8天后，囊胚形成前的上胚层。也就是说，上皮层的形成早于内、中、外三个胚层的发生，因此，胎盘亚全能细胞的分化能力强于其他起源于三个胚层的多能干细胞。根据已有的研究显示，胎盘亚全能细胞可以向内、中、外三个胚层的细胞进行分化，例如，胎盘亚全能细胞可以诱导分化成为心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等等。此外，多项动物实验表明，胎盘亚全能细胞可以有效治疗肺纤维化、肝硬化、帕金森和多发性硬化等病症。 [0004]因此，胎盘亚全能干细胞是一种重要的细胞资源。由于其位于羊膜上，因此人胎盘亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，避免了胚胎干细胞的伦理争议，而且胎盘的获取容易，不会对产妇造成二次伤害，具有非常广阔的市场前景。
[0005]由于胎盘羊膜除了含有上皮层之外，还含有间充质层，其紧密连接在上皮层下。常规的细胞消化方法难以将两层组织区分对待，因此会造成间充质细胞污染上皮细胞的情况，间充质细胞干性较低，从而大大降低了消化所得到的细胞的干性。另外间充质层消化得到的间充质细胞生长较快，在培养过程中会与上皮细胞竞争生长，从而使得上皮细胞(即胎盘亚全能细胞)生长受到抑制。因此常规的消化方法所得到的细胞难以达到储存细胞资源的要求。

【发明内容】

[0006]本发明的一个目的是提供一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎盘羊膜，针对羊膜的上皮层和间充质层所含有的细胞特点，采用了逐步分离的方法，最大限度地减少了羊膜间充质层细胞对胎盘亚全能细胞的污染，有效地提高了人胎盘亚全能细胞的干性。该方法具有成本低、应用前景广阔、可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。
[0007]本发明的人胎盘亚全能干细胞来源于剥离的人类胎盘羊膜，表达标志分子SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-8U TRA1-60和EpCAM，不表达CD45，可以在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化。其中SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-81、TRA1-60是反映干细胞干性的特异标志，EpCAM是一种上皮细胞的标志，⑶45存在于造血干细胞。
[0008]为了保存和使用这一优秀的干细胞资源，我们构建了人胎盘亚全能干细胞储存库。所谓干细胞库是在约为_196°C的液氮中(深低温)储存干细胞及搜集存储干细胞资源相关资料的场所。一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力。目前，尚无可以保存高干性的胎盘干细胞储存库，因此，构建人胎盘亚全能干细胞库，保存在婴儿出生时才有的大量高干性的亚全能干细胞，是将现有资源进行合理有效利用的重要方法。人胎盘亚全能干细胞库的建立可以为存储本人、家属和他人在需要采用胎盘亚全能干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型胎盘干细胞，其应用前景十分广阔。
[0009]本发明的第二方面提供了一种从胎盘羊膜制备人胎盘亚全能干细胞并建立干细胞库的方法，该方法包括下列步骤:
(1)分离人胎盘亚全能干细胞；
(2)培养人胎盘亚全能干细胞；
(3)检测人胎盘亚全能干细胞；
(4)冻存人胎盘亚全能干细胞；
其中，步骤(3)和(4)是并行进行的，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。
[0010]本发明的人胎盘亚全能干细胞分离方法使用废弃的胎盘作为原料，来源广泛，成本低廉，而且获取容易，不会对产妇造成二次伤害。
[0011]在分离人胎盘亚全能干细胞的方法中，用蛋白酶溶液消化胎盘羊膜前先用载玻片将羊膜间充质层的胶状物质刮下，并通过N-乙酰基-L-半胱氨酸去除残留的胶状物质。所述蛋白酶溶液为0.15%(w/v)的胶原蛋白酶I1-EDTA溶液与0.25%(w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液以1:9的体积比混合。
[0012]在一个特定的实施方案中，分离人胎盘亚全能干细胞的方法包括下列步骤:
a)将羊膜从胎盘剥离，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’ s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将羊膜剪碎为5X5 cm2小块；
b)向6-cm的培养皿内滴入ImLD-Hank’ s平衡盐溶液，润湿培养皿底部，将羊膜的上皮层向下放置于培养皿内，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下；
c)将刮好胶的羊膜放入IOmL含10%(w/v)N-乙酰基-L-半胱氨酸的D-Hank’ s平衡盐溶液，室温孵育15分钟；去除羊膜上残余的黏液，以便于消化完全；
d)向羊膜加入约20mL蛋白酶溶液，在37°C温度条件下气浴消化30分钟，收集消化液并加入5mL胎牛血清；其中所述蛋白酶溶液为0.15%(w/v)的胶原蛋白酶I1-EDTA溶液与
0.25%(w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液以1:9的体积比混合；
e)消化结束后,使 用D-Hank’s平衡盐溶液反复冲洗羊膜；
f)将消化液和清洗下来的液体合并，经100目筛网过滤，重复两次，得到细胞悬液；
g)细胞悬液置于离心机中以2000转/分钟的转速离心15分钟，将底层细胞用D-Hank’ s平衡盐溶液反复吹打，再以1500转/分钟的转速离心10分钟，弃去上清液；
h)用IOmLD-Hank’s平衡盐溶液重悬细胞，向细胞悬液缓缓加入IOmL Ficoll淋巴细胞分离液，以250g的速度离心8分钟，不使用制动减速；
i) 离心结束后，将两层液面间的细胞吸出；使用D-Hank’ s平衡盐溶液清洗吸出的细胞，以1500转/分钟的转速离心5分钟，去上清，得到干细胞。
[0013]在一个特定的实施方案中，培养人胎盘亚全能干细胞的方法包括下列步骤:
a)将干细胞按2X 105/cm2接种于培养瓶，加入IOmL干细胞培养液，置于37° CXO2含量为5%的培养箱中培养；其中，所述干细胞培养液为DMEM/F12培养液添加10%(v/v)胎牛血清、1%(w/v)胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、10ng/mL表皮生长因子(EGF)；
b)4-5天后更换新的干细胞培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换干细胞培养液一次;
c)待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加蛋白酶II溶液进行消化，将培养瓶放入37° C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入干细胞培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净;
d)将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在1500转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL干细胞培养液吹打干净混匀细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37° C，CO2含量为5%的培养箱中培养，获得传代培养后的人胎盘亚全能干细胞。
[0014]在一个特定的实施方案中，检测人胎盘亚全能干细胞的方法包括下列步骤:
a)将培养的干细胞用蛋白酶II溶液消化下来，用干细胞培养液重悬制备成细胞悬液，
b)吸取含有大约5XIO6个细胞的细胞悬液送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；
其中，所述病毒检测是通过实时荧光聚合酶链式反应检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒，判定标准为各项指标均为阴性；所述细胞计数及活力测定是指用台盼蓝染色进行细胞计数，判定标准为细胞活率大于等于90% ;所述免疫表型检测是用直接免疫荧光法检测，所用抗体为小鼠抗人的单克隆抗体SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-81、TRAl-60、EpCAM、CD45、HLA-DR，判定标准为 CD45、HLA_DR 呈阴性，SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-8K TRA1-60, EpCAM 呈阳性。
[0015]在一个特定的实施方案中，冻存人胎盘亚全能干细胞的方法包括下列步骤:
a)将培养的干细胞消化下来，离心去上清，向其中加入胎牛血清，使符合I X 106-2X IO6细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀得到细胞悬液；
b)在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；
c)将上述细胞悬液与冻存液按照1:1比例加入到冻存管内混合，迅速移入_80°C冰箱
内；
d)24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，储存环境定期监测。
[0016]本发明与现有技术相比，具有以下优点:
胎盘亚全能干细胞位于羊膜的上皮层，羊膜的间充质层含有大量的胶状物质，影响胰蛋白酶对上皮层的消化。使用载玻片刮去间充质层的胶状物质，并通过N-乙酰基-L-半胱氨酸去除残留的胶状物质，配合本发明特殊的蛋白酶溶液可以充分消化上皮层，获得更多高纯度的胎盘亚全能干细胞。
[0017]羊膜经消化后，会分离出SSEA4_的间充质干细胞，其密度与亚全能干细胞不同，通过Ficoll离心的方法得到高纯度的亚全能干细胞。
[0018]得到的胎盘亚全能干细胞，通过构建干细胞库而得到保存，其来源丰富，细胞获取简便，可得到大量干性强的亚全能干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，富有应用前景。该库为健康婴儿储存胎盘亚全能干细胞，为存储者在罹患需要采用干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型胎盘亚全能干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。
[0019]本发明的有益效果是:
1.按照本发明的制备方法制备 SSEA47Sox270ct47Nanog+/TRAl-8l7 TRA1-60+/EpCAM+/⑶45_/HLA-DR_干细胞可以从自体或他人的胎盘中分离出来，可以做为细胞资源进行储存。
[0020]2.按照本发明的制备方法制备 SSEA47Sox270ct47Nanog+/TRAl-8l7 TRA1-60+/EpCAM+/⑶457HLA-DR-干细胞具有多向分化能力，可以供临床治疗使用。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1 羊膜细胞SSEA-4表达。
[0022]图2 A.羊膜经刮去间充质层及N-乙酰基-L-半胱氨酸处理后HE染色图片；B.未经处理的羊膜HE染色图片。
[0023]图3羊膜经蛋白酶消化后的HE染色照片。
[0024]图4羊膜上皮层和羊膜间充质层经消化后得到的细胞的SSEA-4及EpCAM表达。
[0025]图5 Ficoll 离心后 SSEA-4 表达。
[0026]图6胎盘亚全能干细胞的生长形态。
[0027]图7胎盘亚全能干细胞生长曲线。
[0028]图8胎盘亚全能干细胞表型检测。
[0029]图9胎盘亚全能干细胞复苏后的生长形态。
[0030]图10胎盘亚全能干细胞向心肌细胞诱导。
[0031]图11胎盘亚全能干细胞向肝细胞诱导。
[0032]图12胎盘亚全能干细胞向神经细胞诱导。
【具体实施方式】
[0033]实施例1采集胎盘
对产妇进行ABO/Rh血型检测、HLA (Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV(Human Immunodeficiency Virus,人类免疫缺陷病毒)、HBV (Hepatitis B virus的简称，乙型肝炎病毒)、HCV (Hepatitis C virus,丙型肝炎病毒)；然后在手术室内米集广妇的胎盘。
[0034]在胎盘采集之前，产妇填写知情同意书、个人基本资料，然后对产妇进行鉴定，采集过程应严格防止病原微生物的污染，要求在无菌的场所进行，然后将采集到的胎盘运输到指定地点，运输环境温度应在4-8°C范围内；胎盘接收时应填写接收单，标记胎盘瓶；胎盘接收后，对所用胎盘进行无菌检测，确保胎盘的安全性。
[0035]实施例2获取和分离人胎盘亚全能干细胞
将羊膜从胎盘剥离，用PH值为7.2-7.4的D-Hank’ s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将羊膜剪碎为5X5 cm2小块。取其中一块羊膜制成石蜡切片，并进行免疫荧光染色(SSEA-4，见图1)。图1结果显示，SSEA-4阳性细胞主要分布在羊膜的最外层，即羊膜上皮层。
[0036]将羊膜碎块平均分为A、B两组，其中A组采用本发明描述的方法进行分离，B组采用常规方法消化分离(未将上皮层与间充质层分离)作为对比。
[0037]向6-cm的培养皿内滴入ImL D-HankJ s平衡盐溶液，润湿培养皿底部，将A组羊膜的上皮层向下放置于培养皿内，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下。
[0038]将刮好胶的羊膜放入IOmL含10% (w/v) N-乙酰基-L-半胱氨酸的D_Hank’ s平衡盐溶液，室温孵育15分钟。去除羊膜上残余的黏液，以便于消化完全。
[0039]取部分B组未处理羊膜与部分A组处理后的羊膜，制成冰冻切片，再经苏木精-伊红(HE)染色(见图2)，图2中结果显示B组未经处理的羊膜还有大量胶状的间充质层，而A组处理后的羊膜间充质层大量减少，上皮层保存完好。
[0040]向A组羊膜 加入约20mL蛋白酶溶液(0.15%(w/v)的胶原蛋白酶I1-EDTA溶液与
0.25%(w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液以1:9的体积比混合)，在37°C温度条件下气浴消化30分钟，消化结束后，使用D-Hank’ s平衡盐溶液反复冲洗羊膜。将部分A组羊膜制成冰冻切片，并进行HE染色(见图3)，图中结果显示经蛋白酶溶液消化后，上皮层的细胞已完全消化，而间充质层未受消化。消化结束后，收集羊膜的消化液并加入5mL胎牛血清。使用D-Hank’s平衡盐溶液反复冲洗羊膜，将消化液和清洗下来的液体合并，经100目筛网过滤，得到细胞悬液。
[0041]向B组加入约20mL的0.25%(w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液消化30分钟。收集羊膜的消化液并加入5mL胎牛血清。使用D-Hank’s平衡盐溶液反复冲洗羊膜，将消化液和清洗下来的液体合并，经100目筛网过滤。重复两次，得到细胞悬液。
[0042]将两组羊膜的消化混合液分别置于离心机中以2000转/分钟的转速离心15分钟，将底层细胞用D-Hank’s平衡盐溶液反复吹打，再以1500转/分钟的转速离心10分钟，弃去上清液。
[0043]将A、B两组羊膜得到的细胞分别用IOmL D-HankJ s平衡盐溶液重悬细胞，向细胞悬液缓缓加入IOmL淋巴细胞分离液，以250g的速度离心8分钟，不使用制动减速。
[0044]离心结束后，将两层液面间的细胞吸出。使用D-Hank’s平衡盐溶液清洗吸出的细胞，以1500转/分钟的转速离心5分钟，得到干细胞。
[0045]将A、B两种方法得到的干细胞以IO5/孔接种到24孔板中的干细胞培养液(DMEM/F12培养液添加10%(v/v)胎牛血清、l%(w/v)胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、10ng/mL表皮生长因子(EGF))内，待细胞贴壁后，进行免疫荧光染色，检测干细胞及上皮细胞标志(见图4),图4的结果显示,方法A得到的细胞的干细胞标志SSEA-4及上皮细胞标志EpCAM表达率均接近100%，而方法B的羊膜因为含有大量的间充质层消化得来的细胞，生长速度较快，影响上皮层的亚全能干细胞生长，因此基本不表达SSEA-4及EpCAM。
[0046]将方法A得到的亚全能细胞在淋巴细胞分离离心前后，通过流式细胞术检测其SSEA-4表达率(见图5)，图5的结果显示Ficoll离心后，细胞的SSEA-4表达率大幅提升，说明细胞纯度提高。
[0047]实施例3培养胎盘亚全能干细胞
将获得的干细胞按2 X IOVcm2接种于培养瓶，加入IOmL干细胞培养液，置于37° C、CO2含量为5%的培养箱中培养，4-5天后更换新的干细胞培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换干细胞培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加蛋白酶II溶液进行消化； 将培养瓶放入37° C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入干细胞培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在1500转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL干细胞培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人胎盘亚全能干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37° CXO2含量为5%的培养箱中培养，即按1:3传代，获得传代培养后的人胎盘亚全能干细胞，细胞培养结果见图6。
[0048]细胞生长曲线的测定是将贴壁细胞用蛋白酶溶液II消化后，按IX IO4细胞/孔接种在24孔板内，每隔24小时消化3个孔，收集细胞，并用0.4%的台盼蓝染色计数活细胞，绘制生长曲线，如图7所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞个数。
[0049]实施例4检测、冻存人胎盘亚全能干细胞
用IOmL D-Hank’s平衡盐溶液洗涤传代培养后的人胎盘亚全能干细胞两次，吸弃洗液，每个培养瓶中加入ImL蛋白酶II溶液，放入37° C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全消化下来；再在每个培养瓶中加入IOmL干细胞培养液，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约5X IO6个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存。将两管细胞以1500转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；其中，病毒检测是通过实时荧光聚合酶链式反应检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒，判定标准为各项指标均为阴性，视为合格细胞。
[0050]细胞计数及活力测定是指用台盼蓝染色进行细胞计数，判定标准为细胞活率大于等于90%，视为合格细胞。免疫表型检测是用直接免疫荧光法检测，所用抗体为小鼠抗人的单克隆抗体 SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-81、TRA1-60、EpCAM、CD45、HLA-DR0 细胞用PBS洗后加入抗体，在4° C下孵育30分钟，再用PBS洗两次，用500 μ L PBS吹打、混匀细胞，之后用流式细胞仪检测。根据本发明的方法获得的人胎盘亚全能干细胞免疫表型的流式细胞仪检测结果如表1所示。检测结果表明，胎盘亚全能干细胞中的⑶45、HLA-DR呈阴性，小于 2% ;SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-8U TRA1-60, EpCAM 呈阳性，该胎盘亚全能干细胞为合格细胞。细胞免疫表型检测见图8。
[0051]表1人胎盘亚全能干细胞的免疫表型
【权利要求】
1.一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎盘羊膜，特征在于表达标志分子SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-81、TRA1-60 和 EpCAM，不表达 CD45。
2.根据权利要求1所述的人胎盘亚全能干细胞，其可以在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化。
3.根据权利要求2所述的人胎盘亚全能干细胞，其可以诱导分化为心肌细胞、肝脏细胞、神经样细胞。
4.一种分离权利要求1-3任一项所述的人胎盘亚全能干细胞的方法，其特征在于用蛋白酶溶液消化胎盘羊膜前先用载玻片将羊膜间充质层的胶状物质刮下，并通过N-乙酰基-L-半胱氨酸去除残留的胶状物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白酶溶液为0.15% (w/v)的胶原蛋白酶II-EDTA溶液与0.25% (w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液以1:9的体积比混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其包括下列步骤: (1)将羊膜从胎盘剥离，用PH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将羊膜剪碎为5 X 5cm2小块； (2)向6-cm的培养皿内滴入1mLD_Hank’s平衡盐溶液，润湿培养皿底部，将羊膜的上皮层向下放置于培养皿内，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下； (3)将刮好胶的羊膜放入10mL含10% (w/v) N-乙酰基-L-半胱氨酸的D_Hank’ s平衡盐溶液，室温孵育15分钟；去除羊膜上残余的黏液，以便于消化完全； (4)向羊膜加入约20mL蛋白酶溶液，在37°C温度条件下气浴消化30分钟，收集消化液并加入5mL胎牛血清；其中所述蛋白酶溶液为0.15% (w/v)的胶原蛋白酶II-EDTA溶液与0.25% (w/v)的胰蛋白酶-EDTA溶液以1:9的体积比混合； (5)消化结束后，使用D-Hank’s平衡盐溶液反复冲洗羊膜； (6)将消化液和清洗下来的液体合并，经100目筛网过滤，重复两次，得到细胞悬液； (7)细胞悬液置于离心机中以2000转/分钟的转速离心15分钟，将底层细胞用D-Hank’ s平衡盐溶液反复吹打，再以1500转/分钟的转速离心10分钟，弃去上清液； (8)用10mLD-Hank’ s平衡盐溶液重悬细胞，向细胞悬液缓缓加入10mL Ficoll淋巴细胞分离液，以250g的速度离心8分钟，不使用制动减速； (9)离心结束后，将两层液面间的细胞吸出；使用D-Hank’s平衡盐溶液清洗吸出的细胞，以1500转/分钟的转速离心5分钟，去上清，得到干细胞。
7.一种培养权利要求1-3任一项所述的人胎盘亚全能干细胞的方法，其特征在于使用的干细胞培养液为DMEM/F12培养液添加10% (v/v)胎牛血清、1 % (w/v)胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、10ng/mL表皮生长因子(EGF)。
8.根据权利要求7的方法，其包括下列步骤: (1)将干细胞按2X 10Vcm2接种于培养瓶，加入10mL干细胞培养液，置于37°C、CO2含量为5%的培养箱中培养； (2)4-5天后更换新的干细胞培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换干细胞培养液一次； (3)待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加蛋白酶II溶液进行消化，将培养瓶放入37°C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入干细胞培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净; (4)将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在1500转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL干细胞培养液吹打干净混匀细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37 °C, CO2含量为5%的培养箱中培养,获得传代培养后的人胎盘亚全能干细胞。
9.一种检测权利要求1-3任一项所述的人胎盘亚全能干细胞的方法，包括下列步骤: (1)将培养的干细胞用蛋白酶II溶液消化下来，用干细胞培养液重悬制备成细胞悬液， (2)吸取含有大约5XIO6个细胞的细胞悬液送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准； 其中，所述干细胞培养液为DMEM/F12培养液添加10% (v/v)胎牛血清、1% (w/v)胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、10ng/mL表皮生长因子(EGF);所述病毒检测是通过实时荧光聚合酶链式反应检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒，判定标准为各项指标均为阴性；所述细胞计数及活力测定是指用台盼蓝染色进行细胞计数，判定标准为细胞活率大于等于90% ;所述免疫表型检测是用直接免疫荧光法检测，所用抗体为小鼠抗人的单克隆抗体 SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-81、TRA1-60、EpCAM、CD45、HLA-DR，判定标准为CD45、HLA-DR 呈阴性，SSEA4、Sox2、0ct4、Nanog、TRA1-8U TRA1-60, EpCAM 呈阳性。
10.一种冻存权利要求1-3任一项所述的人胎盘亚全能干细胞的方法，包括下列步骤: (1)将培养的干细胞消化下来，离心去上清，向其中加入胎牛血清，使符合I X 106-2X IO6细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀得到细胞悬液； (2)在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号； (3)将上述细胞悬液与冻存液按照1:1比例加入到冻存管内混合，迅速移入_80°C冰箱内； (4)24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，储存环境定期监测。
11.一种人胎盘亚全能干细胞库的构建方法，包括下列步骤: (1)根据权利要求4-6任一项所述的方法分离人胎盘亚全能干细胞； (2)根据权利要求7或8所述的方法培养人胎盘亚全能干细胞； (3)根据权利要求9所述的方法检测人胎盘亚全能干细胞； (4)根据权利要求10所述的方法冻存人胎盘亚全能干细胞； 其中，步骤(3)和(4)是并行进行的，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。
【文档编号】C12Q1/04GK103966159SQ201410050051
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】朱德琳, 赵雅宁, 徐萌, 徐志国, 聂艳波 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司