一种快速分离被子植物生殖细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种快速分离被子植物生殖细胞的方法，是将被子植物的花粉置于甘露醇溶液中一段时间，释放得到生殖细胞。本发明的分离被子植物生殖细胞的方法分离时间短，步骤简单，可获得大量具有活性的被子植物生殖细胞，生殖细胞膜完整；具有较大的实际应用价值。
【专利说明】一种快速分离被子植物生殖细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速分离被子植物生殖细胞的方法。
【背景技术】
[0002]生殖细胞是精细胞的前身，生殖细胞进一步分裂形成一对精细胞。在占被子植物多数的二细胞花粉类型中，花粉成熟时只含有生殖细胞和营养细胞。由于生殖细胞及精细胞包埋在花粉管或花粉粒内，需要把它分离出来才能进行活性生殖细胞的进一步操作与研究。
[0003]生殖细胞的分离从最初的研磨法到渗透压冲击法，再到酶解法，经历了由复杂到简单，由少量到大规模的分离过程，而且不同特点的生殖细胞其分离方法也不同。目前分离生殖细胞的最常规的方法是两步渗透压冲击法，主要经过花粉在较高浓度蔗糖溶液里的萌发，及含较低浓度蔗糖溶液的冲击，所需时间较长，步骤较烦琐。花粉萌发的长度不一、难以掌握，所以分离的效果不确定，而酶解法中酶的使用可能会导致分离出来的生殖细胞膜的损伤，从而影响后续的研究或培养，所以需要找到更适合、简单易行、易于掌握的分离方法。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种快速分离被子植物生殖细胞的方法。应用本发明的方法分离时间短，步骤简单，生殖细胞膜完整。
[0005]本发明提供的一种快速分离被子植物生殖细胞的方法，是将被子植物的花粉置于甘露醇溶液中一段时间，生殖细胞就会自动释放出来。
[0006]为了获得更好的分离效果，所述溶液中含有8-15%甘露醇；当所述溶液中含有10-15%甘露醇时，分离的效果进一步提高；当溶液中甘露醇的质量百分比为13%时，分离的效果达到最佳。
[0007]所述被子植物花粉粒与甘露醇溶液的质量比可为1/10-1/5。
[0008]在该质量比范围时，生殖细胞分离率可达90%。
[0009]所述方法是将被子植物的花粉置于甘露醇溶液中在温度为24_27°C的条件下放置一段时间，释放得到生殖细胞。
[0010]所述被子植物为茄科、鸢尾科以及豆科的被子植物。
[0011]所述被子植物为烟草等茄科、鸢尾等鸢尾科、蚕豆等豆科的被子植物。
[0012]烟草属有60多种，经试验，该烟草属中所有烟草均能用本发明的方法来释放得到生殖细胞。
[0013]所述方法是将烟草的花粉置于甘露醇溶液中放置40_50min，释放得到生殖细胞。优选地，温度为24-27°C，最优温度为25°C。
[0014]所述方法是将蚕豆或鸢尾的花粉置于甘露醇溶液中放置10_15min，释放得到生殖细胞。优选地，温度为24-27°C，最优温度为25°C。[0015]本发明的分离被子植物生殖细胞的方法分离时间短，步骤简单，可获得大量具有活性的被子植物生殖细胞，生殖细胞膜完整；具有较大的实际应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为分离得到的烟草生殖细胞在明场显微镜下的观察结果；
图2为分离得到的鸢尾生殖细胞在明场显微镜下的观察结果；
图3为分离得到的蚕豆生殖细胞在明场显微镜下的观察结果。
【具体实施方式】
[0017]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中的百分比浓度均为质量百分比浓度。
[0018]实施例1、分离烟草生殖细胞 包括以下步骤:
1)取W38烟草的新鲜花粉；
2)配制13%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒 置于步骤2)的溶液中，25°C，放置45分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:5 ;
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，结果如图1所示。生殖细胞的分离率高达93%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到烟草的生殖细胞。
[0019]生殖细胞刚释放出来是纺锤形的，而且带两个明显的尾部。随着时间的推移，生殖细胞逐渐变成球形，其中经历了尾部逐渐缩短、生殖细胞变成圆柱状等中间状态。生殖细胞由长形变成球形所经历的时间长短与物种有关。总之，生殖细胞分离后，由于细胞骨架等的改变其形状也会发生很大的改变，最终变为球形。
[0020]实施例2、分离鸢尾生殖细胞 包括以下步骤:
1)取鸢尾的新鲜花粉；
2)配制13%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，25°C，放置15分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:8 ;
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，结果如图2所示。生殖细胞的分离率高达92%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到鸢尾的生殖细胞。
[0021]实施例3、分离蚕豆生殖细胞 包括以下步骤:
1)取蚕豆的新鲜花粉；
2)配制13%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，25°C，放置15分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比I: 10 ；
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，结果如图3所示。生殖细胞的分离率高达92%，而且有活性的生殖细胞占90%以上，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到蚕豆的生殖细胞。
[0022]实施例4、分离烟草生殖细胞 包括以下步骤:
1)取SR-1烟草的新鲜花粉；
2)配制8%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，240C，放置50分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:6 ;
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达87%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到生殖细胞。
[0023]实施例5、分离鸢尾生殖细胞 包括以下步骤:
1)取鸢尾的新鲜花粉；
2)配制15%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，27°C，放置12分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比I: 10 ；
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达90%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到生殖细胞。
[0024]实施例6、分离蚕豆生殖细胞 包括以下步骤:`
1)取蚕豆的新鲜花粉；
2)配制12%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，24°C，放置13分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:8 ;
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达91%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到蚕豆的生殖细胞。
[0025]实施例7、分离烟草生殖细胞 包括以下步骤:
1)取W38烟草的新鲜花粉；
2)配制15%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，27°C，放置40分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比I: 10 ；
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达91%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到烟草的生殖细胞。
[0026]实施例8、分离鸢尾生殖细胞 包括以下步骤:
1)取鸢尾的新鲜花粉；
2)配制10%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，24°C，放置10分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:5 ;4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达90%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到鸢尾的生殖细胞。
[0027]实施例9、分离蚕豆生殖细胞 包括以下步骤:
1)取蚕豆的新鲜花粉；
2)配制9%甘露醇溶液；
3)将步骤I)的花粉粒置于步骤2)的溶液中，27°C，放置11分钟，花粉粒与甘露醇溶液的质量比1:5 ;
4)镜检:在明场用显微镜进行镜检，发现生殖细胞的分离率达88%，生殖细胞膜完整。说明该方法可快速有效分离得到生殖细胞。
[0028]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。`
【权利要求】
1.一种快速分离被子植物生殖细胞的方法，是将被子植物的花粉置于甘露醇溶液中一段时间，释放得到生殖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述甘露醇溶液的浓度为8-15%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述甘露醇溶液的浓度为10-15%。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述甘露醇溶液的浓度为13%。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述花粉与甘露醇溶液的质量比为 1/10-1/5。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:是将被子植物的花粉置于甘露醇溶液中在温度为24-27°C的条件下放置一段时间，释放得到生殖细胞。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述被子植物为茄科、鸢尾科以及豆科的被子植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述被子植物为烟草、鸢尾和蚕豆。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:是将烟草的花粉置于甘露醇溶液中放置40-50min,释放得到生殖细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:是将蚕豆或鸢尾的花粉置于甘露醇溶液中放置10-15min，释放得到生殖细胞。
【文档编号】C12N5/04GK103756951SQ201410050041
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】房克凤, 秦岭, 郝敬虹, 杨瑞, 杨柳, 王建立, 张卿, 于同泉 申请人:北京农学院