用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列及方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列及方法，用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列由SEQ?ID?No.1所示的上游引物序列和SEQ?ID?No.2所示的下游引物序列组成。本发明建立了一套准确、快速的室内种子纯度鉴定体系，利用该体系可明确区分青花菜杂交种领秀是否混入其它的杂种，为领秀品种的鉴定、品种保护和快速推广提供技术支撑。本发明的方法不受环境条件的影响，操作简便快速，结果准确可靠。且不受样本材料的限制，整个生育期，植物的任何组织都可采样进行鉴定。利用本方法对本所培育的青花菜杂交种领秀进行纯度鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果一致，在青花菜种子纯度鉴定上具有很大的应用价值。
【专利说明】用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体的涉及一种快速、准确用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列及方法。
【背景技术】
[0002]杂种优势的利用是目前青花菜商品种生产的主要途径，但是在杂交制种的过程中，由于品种自身的特性和许多不良因素的影响，易造成种子的生物学混杂或机械混杂，种子纯度的鉴定是保证种子质量的关键环节，大田形态鉴定是目前普遍采用的方法，此方法直观可靠，但周期长、成本高、易受环境条件的影响、表型特征会出现一定程度的偏差等问题，而且由于品种数量的日益增加，种质基础越来越窄，遗传变异变小，传统的形态学鉴定已难以满足实际需要。
[0003]品种的纯度和真实性鉴定，归根到底是品种间的基因型的差别鉴定。以遗传物质DNA为基础的分子标记技术是通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因的排布规律，比较品种基因组DNA的结构与组成，通过鉴定DNA水平上的差异来鉴别品种。一个纯合的品种，其基因型是一致的，这种基因型可以用某种分子标记加以确定，即基因型与分子标记组合具有对应关系，利用这一标记就可将这一品种与其它品种区别开来。
[0004]SSRCSimple Sequence Repeat,简单重复序列)又称微卫星DNA,是一类由几个(多为1-6个)核苷酸为单位串联重复而成的DNA序列，长度一般在IOObp以内。这些短的串联重复是在DNA复制过程中，由于DNA滑动、复制时，滑动链与互补链碱基错配，而产生的一个或几个重复单位的插入或缺失。微卫星基因序列中，重复基因的重复次数不同，且重复的基因序列不同，产生了简单序列长度多态性和随机扩增微卫星多态性，从而反映高度的等位基因多样性。由于微卫星位点两侧的DNA序列较为保守，根据两侧的这个保守序列设计特定的引物，并通过PCR扩增，将其间的核心卫星DNA序列扩增出来，结合凝胶电泳技术，就可以对这些多态性进行比较分析。`
[0005]SSR标记具有稳定可靠，操作简单，时间短，效率高，对DNA质量要求不高，不受自然条件的影响等优点，已被广泛应用于基因定位、种子纯度检测、植物进化及遗传多样性的研究。进行种子纯度检测时，可以识别母本因微量花粉导致的自交、父本混杂、花粉污染、机械混杂等带来的非杂交种，远远优于田间的形态鉴定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种特异性好的用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列。
[0007]本发明的第二个目的是提供一种准确、快速地用于检测青花菜杂交种领秀纯度的方法。
[0008]本发明的技术方案概述如下:
[0009]用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列，所述引物序列由SEQ ID N0.1所示的上游引物序列和SEQ ID N0.2所示的下游引物序列组成。
[0010]用于检测青花菜杂交种领秀纯度的方法，包括以下步骤:
[0011](I)提取待测青花菜基因组DNA ；
[0012](2)以待测青花菜基因组DNA为模板，以SEQ ID N0.1所示核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列为下游引物，进行PCR扩增；
[0013](3)在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，在2%的琼脂糖凝胶I X TAE中电泳分离，电泳结束后凝胶成像系统对结果进行分析；
[0014](4)依据各待测样品在凝胶上的140bp和ISObp处同时具有条带，鉴定为青花菜领秀杂交种。
[0015]本发明建立了一套准确、快速的室内种子纯度鉴定体系，利用该体系可明确区分青花菜杂交种领秀是否混入其它的杂种，为领秀品种的快速鉴定、品种保护和快速推广提供技术支撑。本发明的方法相对于传统技术具有以下优点:不受环境条件的影响，操作简便快速，结果准确可靠。传统的田间鉴定方法费时、费力，采用本方法仅需5-6个小时就可完成一个批次的鉴定，且不受样本材料的限制，整个生育期，植物的任何组织都可采样进行鉴定。利用本方法对本所培育的青花菜中领秀杂交种进行纯度鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果一致，在青花菜种子纯度鉴定上具有很大的应用价值。
[0016]本发明提供的引物序列及检测方法只适用于青花菜杂交种领秀的真实性及纯度检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为青花菜杂交种领秀PCR`扩增产物的凝胶电泳图谱。
[0018]图中M为DNA Marker ；P1为领秀父本，P2为领秀母本，1_9为待测青花菜样品。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述。
[0020]实施例1
[0021]用于检测青花菜杂交种领秀纯度的方法，包括以下步骤:
[0022](I) CTAB法提取9个待测青花菜种子发芽36小时的幼苗基因组DNA ；
[0023](2)进行PCR扩增:在PCR扩增专用薄壁管中加入步骤(1)获得的基因组DNA15ng为模板，以SEQ ID N0.1所示核苷酸序列15ng为上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列15ng为下游引物，I倍的含Mg2+的PCR缓冲液，dNTP2mM, Taq DNA聚合酶0.5单位，加无菌双蒸水至20 μ L ;PCR程序为:94°C预变性120s ;然后94°C变性15s，55°C退火20s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸60s，扩增完成；
[0024](3)在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液[30mM EDTA、36%(v/v)甘油、0.05%(g/mL)二甲苯青FF、0.05%(g/mL)溴酚蓝]，混匀，在2% (g/mL)的琼脂糖凝胶I X TAE中电泳分离，120V恒电压电泳至溴酚蓝达到凝胶的另一端时停止电泳，EB染色，凝胶成像系统对结果进行观察、照相，见图1。以DNA Marker DL-2000为分子量标准，电泳结束后凝胶成像系统对结果进行分析；
[0025](4)依据各待测样品在凝胶上的相对位置，通过下述特征鉴定青花菜中领秀杂交种的纯度:在140bp和180bp处同时具有条带的为青花菜中领秀杂交种。只有140bp或ISObp的条带，或者二者都`没有的，不是该品种。经检测9个样品均为青花菜杂交种领秀。
【权利要求】
1.用于检测青花菜杂交种领秀纯度的引物序列，其特征在于所述引物序列由SEQIDN0.1所示的上游引物序列和SEQ ID N0.2所示的下游引物序列组成。
2.用于检测青花菜杂交种领秀纯度的方法，其特征包括以下步骤: (1)提取待测青花菜基因组DNA； (2)以所述待测青花菜基因组DNA为模板，以SEQID N0.1所示核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列为下游引物，进行PCR扩增； (3)在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，在2%的琼脂糖凝胶IX TAE中电泳分离，电泳结束后凝胶成像系统对结果进行分析； (4)依据各待测样品在凝胶上的140bp和ISObp处同时具有条带，鉴定为青花菜领秀杂交种。`
【文档编号】C12N15/11GK103773886SQ201410049825
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】江汉民, 孙德岭, 李宽, 姚星伟, 单晓政, 刘莉莉, 文正华 申请人:天津科润农业科技股份有限公司