含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了新型寡核苷酸探针，其具有树状分子染料，可用于检测和分析生物样品。还提供了其组合物及方法。该含有树状分子的寡核苷酸探针可用于在核酸(例如DNA和RNA)的原位杂交(FISH)中进行高灵敏度荧光成像。
【专利说明】含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明一般地涉及用于生物检测和生物样品分析的探针。更具体地，本发明涉及 以可用于检测和分析生物样品的树状分子染料为特征的寡核苷酸探针，并涉及其组合物及 方法。
【背景技术】
[0002] 自1980年代以来，荧光原位杂交（FISH)已经发展成为用于生物学研究和医学的 一种强有力的工具。FISH是一种细胞遗传学技术，用于检测和定位特定DNA序列在染色体 上的有无（Langer-Safer, et al. 1982Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79 (14) : 4381 - 5.)。联 合使用荧光探针和荧光显微镜在细胞、循环肿瘤细胞和组织样品中鉴定DNA的特定特征， 或检测和定位特定的 RNA(mRNA, IncRNA和 miRNA)祀标（Amann, et al. 2008Nature Reviews Micr〇bi〇l〇gy6:339-348.)。FISH是一种重要的用于疾病例如癌症的辅助诊断和预后的技 术。
[0003] 荧光探针已经成为分析基因、组织和细胞的强有力工具 (Waggoner1986Applications of Fluorescent in the Biomedical Sciences,Eds. Taylor et al. , New York:Alan R. Liss, Inc. pp. 3-28;Mason, editor1993Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Biological Techniques Series, edited by Sattelle, Academic Press Limited, London·)。通常被标记的生物分子包括核苷酸、 寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽和多肽、蛋白质、糖和脂质，以及其他（Singer&Ward, 1982Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:7331-7335;Singer et al. 1986BioTecbniques4:230-250; Pitta et al.1990Strategies3:33;Southern,1975J. Mol. Biol. 98:503-517;Alwine et al. 1977Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 5350-5354; Cal low et al. 2000Grenome Res.10:2027-2029.) 〇
[0004] 先前的荧光团标记方法使用NTP(核苷三磷酸）染料进行标记（见例如 W02000/06773)。另一种荧光标记技术使用钼化合物标记核酸（见例如EP1373572B1)。 基于钼的标记化合物通过钼（II)金属中心与靶生物分子上的氮或硫原子的配位 (coordination)而附着在靶生物分子上。这些策略的缺点包括只有有限数目的染料可以被 引入到探针中，从而限制了探针的"亮度"(brightness)。此外，NTP染料会由于高度修饰的 三磷酸难以掺入（poor incorporation)而导致产量低，并且基于钼的化合物可能导致探针 的降解。而且，这两种策略都会造成包括碱基对区在内的整条链的碱基修饰，这会对杂交产 生不良影响。
[0005] 因此，仍然需要新型荧光探针和荧光团标记方法学来解决现有的荧光探针和方法 的缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明部分地基于意外地发现了缀合有树状分子染料、可用于检测和分析生物样 品的新型寡核苷酸探针。
[0007] 这些独特的探针提供了许多优点，同时克服了现有荧光探针的缺陷。首先，可以掺 入探针内的荧光染料的量不受限制。其次，已知树状分子染料比它们相应的单独个体更加 明亮，导致探针更加灵敏（见例如US2012256102A1)。第三，点击化学的应用一般可导致定 量或接近定量的标记。而且，因为含有染料的部分将会位于FISH探针的5'侧，所以荧光部 分不会影响探针与靶种类例如基因组DNA或RNA的杂交。
[0008] 在一个方面中，本发明一般性地涉及寡核苷酸探针。该寡核苷酸探针包括一个 (或多个）能够与一个（或多个）感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和一个（或多个）共 价联接于该寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于包含两个或更多个荧光部分的树状分 子基团(dendrimeric group) 〇
[0009] 在另一个方面中，本发明一般地涉及用于产生寡核苷酸探针的方法。该方法包括： 产生寡核苷酸文库；提供多个引物，每一个引物均包含一个（或多个）炔部分；形成扩增子 的文库（a library of amplicons)，其中每一个扩增子包含所述寡核苷酸的文库中的一个 (或多个）成员和来自该多个引物中的一个（或多个）引物；提供一个（或多个）树状分 子基团，所述树状分子基团包含两个或更多个荧光部分且包含一个（或多个）叠氮部分；通 过使所述炔部分与所述叠氮部分反应而使该扩增子与该树状分子基团反应，藉此产生寡核 苷酸探针的文库。
[0010] 在另外一个方面中，本发明一般地涉及用于检测或分析感兴趣的靶核酸的方法。 该方法包括：提供寡核苷酸探针，其包含一个（或多个）能够与感兴趣的靶核酸杂交的核 酸序列和共价联接于一个（或多个）第一反应性部分（reactive moiety)的引物；使该 寡核苷酸探针与待分析感兴趣的靶核酸之存在的样品在这样的条件下接触，在该条件下， 如果存在感兴趣的靶核酸，则在该寡核苷酸探针与该感兴趣的靶核酸之间会形成杂交复合 物；并使该经接触的样品与包含两个或更多个突光部分（fluorescent moieties)以及一 个（或多个）第二反应性部分的树状成像剂反应，由此使所述第二反应性部分与所述第一 反应性部分反应形成共价键；和对所述两个或更多个荧光部分进行成像以检测或分析感兴 趣的靶核酸的存在。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1显示了根据本发明的寡核苷酸探针的一个实施方案的示意图。
[0012] 定义
[0013] 除非另外定义，否则这里所用的全部技术和科学术语的意义与本发明所属领 域的普通技术人员所公知的意义相同。本文中所用的核酸化学、生物化学、遗传学和 分子生物学的术语和标识遵循本领域的标准论文和教科书中的含义，例如Kornberg 和 Baker 编著，DNA Replication,第二版（W.H.Freeman，New York, 1992);Lehninge r，Biochemistry,第二版（Worth Publishers, New York, 1975);Strachan 和 Read 编 著,Human Molecular Genetics,第二版(ffiley-Liss, New York, 1999);Eckstein, 编辑,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York, 1991) ;Gait,编辑,Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach(IRL Press,Oxford, 1984);Sambrook 等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,补充第二版（Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)，等。不过，为清楚和便于查 阅起见，在下面定义了一些术语。
[0014] 术语"生物分子"可以指在自然界中发现的化合物，自然中发现的化合物的衍生 物，自然界中发现的化合物的合成的修饰类似物，自然界中发现的化合物的基因工程类似 物，自然界中发现的化合物的基因工程修饰类似物。例如，生物分子可以是和/或包括蛋 白质；抗体；抗体片段；半抗原；糖蛋白；细胞膜蛋白；酶，如碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶， 辣根过氧化物酶，或尿素酶；肽核酸（PNAS);锁定核酸（LNA);基因工程肽；基因工程蛋白； 基因工程抗体；基因工程抗体片段；寡核苷酸；RNA ;DNA ;含糖分子；单糖；二糖；三糖；寡聚 糖；多糖，如葡聚糖；小分子，包括药物样分子；药物；抗原，如肿瘤抗原；病原体；毒素；聚 合物，包括生物聚合物和/或树状分子；核受体；核受体底物和/或配体；细胞因子；表位， 包括肽表位，抗原表位，和/或病原体表位；酶的底物；和/或其组合或衍生物。
[0015] 如本文中所使用的，术语"样品"是指含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材 料混合物，其通常是，但不一定是液体形式。
[0016] 如本文中所使用的，术语"核酸样品"是指包含核酸的样品。样品可以包含单一核 酸种类或任何数目的核酸种类。某些样品包含至少10种、至少100种、至少1，〇〇〇种、或者 更多种（例如至少1〇〇, 〇〇〇种或至少1，〇〇〇, 〇〇〇种不同种类）的不同核酸片段或不同序列。 样品可以是来自任何来源的生物样品，例如来自人的脑脊液、淋巴、血液、血液衍生物（例 如血清）、液化组织、尿液、粪便材料、拭子或鼻洗，细胞培养物、或食物。
[0017] 如本文中所使用的，术语"基因组样品"是指包含来自生物体的遗传材料的材料或 材料混合物。
[0018] 如本文中所使用的，术语"基因组DNA"是指从生物体获得的脱氧核糖核酸。
[0019] 如本文中所使用的，术语"基因组样品"和"基因组DNA"包括可能经过扩增、纯化 或断裂的遗传材料。
[0020] 如本文中所使用的，术语"标记物"是指任何可检测的标记物，包括放射性标记物 和非放射性标记物。非放射性标记物包括任意的可检测标记物，包括荧光标记物和荧光条 形码，以及带质量标签的标记物（mass tagged labels)。标记物包括能直接检测的和能间 接检测的非放射性标记物，例如荧光标记物和质量标签。
[0021] 如本文中所使用的，术语"荧光标记物"是指任何可通过标记的荧光发射，例如通 过荧光显微镜加以检测的标记物。生物分子例如核酸可以直接或间接标记。直接标记的核 酸与标记物共价或非共价连接。
[0022] 如本文中所使用的，术语"核苷酸"是指核酸的具有磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基 的亚单位，以及这样的亚单位的功能类似物（无论是人工合成或天然存在的），其在聚合物 形式下（作为多核苷酸）能够与天然存在的多核苷酸以类似于两个天然存在的多核苷酸的 序列特异性方式杂交。脱氧核糖核酸的核苷酸亚单位是脱氧核糖核苷酸，而核糖核酸的核 苷酸亚单位是核糖核苷酸。
[0023] 术语"核苷"和"核苷酸"意图包括这样的部分，其不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基 部分，还包含其它已经被修饰的杂环碱基部分。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、乙酰化 嘌呤或嘧啶、或其它杂环。此外，术语"核苷"和"核苷酸"包括这样的部分，其不仅含有常规 的核糖和脱氧核糖，还含有其它的糖。修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如其 中一个或多个羟基被卤族原子或脂肪族基团代替，或者被官能化为醚、胺等等。一般地，如 本文中所使用的，术语"寡核苷酸"和"多核苷酸"可以互换使用。进一步，一般地，术语"核 酸"或"核酸分子"还包括寡核苷酸和多核苷酸。
[0024] 在这里，术语"核酸"和"多核苷酸"可以互换使用，用于描述由核苷酸（如脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸）构成的任意长度（例如大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于 约100个碱基，大于约500个碱基，大于1，000个碱基，直至大约10, 000个或更多个碱基） 的聚合物，并可以通过酶学或合成方式产生（例如美国专利No. 5, 948, 902及其中引用的参 考文献中所述的PNA)，其能够与天然存在的核酸以类似于两个天然存在的核苷酸的序列特 异性方式杂交，例如，能够参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括 鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶（分别为G、C、A和T)。
[0025] 如本文中所使用的，术语"寡核苷酸"是指由约2-500个核苷酸形成的核苷酸单 链多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可以通过酶促制成，并且在一些实施方案中长度为 10-50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体（即可以是寡核糖核苷酸）或脱氧核糖 核苷酸单体。寡核苷酸的长度可以是例如10-20, 21-30, 31-40,41-50, 51-60,61-70, 71-80， 80-100,100-150,150-200个核苷酸，或者大于200个核苷酸。
[0026] 如本文中所使用的，术语"核糖核酸"和"RNA"是指由核糖核苷酸构成的核酸。
[0027] 如本文中所使用的，术语"脱氧核糖核酸"或"DNA"是指由脱氧核糖核苷酸构成的 核酸。
[0028] 如本文中所使用的，术语"使杂交"或"杂交"是指核酸分子在合适的条件下，例如 严格条件下，与特定核苷酸序列结合或双链体化。如本文中所使用的，术语"严格条件"（或 "严格杂交条件"）是指这样的条件，其适合互补性足以在测定中提供期望水平的特异性的 核酸（例如表面结合的核酸和溶液相核酸）产生结合配对；而较不适合互补性不足以提供 期望特异性的结合成员之间形成结合配对。严格条件是杂交条件和清洗条件二者的加和或 组合（全体）。
[0029] 严格条件(例如在阵列、Southern或Northern印迹或杂交中），可以是序列依赖性 的，并且在不同实验参数下经常是不同的。可用于使核酸杂交的严格条件包括，例如，在含 有50%甲酰胺、5XSSC (盐、柠檬酸钠）和1%SDS的缓冲液中在42°C进行杂交，或者在含有 5XSSC和1%SDS的缓冲液中在65°C进行杂交，两者均在65°C下用0. 2XSSC和0. 1%SDS清 洗。其它严格条件的实例包括在含有40%甲酰胺、1M NaCl和1%SDS的缓冲液中在37°C进行 杂交，并在45°C用1XSSC清洗。在另一个实例中，可以采用在0. 5M NaHP04、7%十二烷基磺 酸钠（SDS)、lmM EDTA中在65°C与结合于滤膜的DNA杂交，并在68°C用0. 1XSSC/0. 1%SDS 清洗。其他严格条件实例包括在60°C或更高温度下在3XSSC(450mM氯化钠/45mM柠檬酸 钠）中杂交，或者在42°C下在含有30%甲酰胺、1M NaCl、0. 5%月桂酰基肌氨酸钠、50mM MES、 PH6. 5的溶液中温育。普通技术人员可以容易地想到，可以使用替代的但是相当的杂交和清 洗条件以提供严格程度相似的条件。
[0030] 在某些实施方案中，清洗条件的严格程度展现了确定核酸是否与另一个核酸特 异杂交的条件(例如当核酸与核酸探针杂交时)。用于鉴定核酸的清洗条件包括，例如大 约0. 02摩尔的盐浓度、pH7、和至少约50°C或者约55°C -约60°C的温度；或者盐浓度约 为0. 15M NaCl、72°C、历时约15分钟；或者盐浓度为约0. 2XSSC、温度为至少约50°C或约 55°C -约60°C，历时约15-约20分钟；或者用盐浓度为约2XSSC、含有0. 1%SDS的溶液在 室温清洗杂交复合物15分钟2次，然后用盐浓度为0. 1 X SSC、含有0. 1%SDS的溶液在68°C 清洗15分钟2次；或者等价的条件。清洗的严格条件还可以是例如0. 2XSSC/0. 1%SDS， 42。。。
[0031] 严格的测定条件是这样的杂交条件，其至少与上述的代表性条件同样严格，其中， 如果在给定一组条件下，与上述的具体条件相比，几乎没有更多的缺乏足以提供期望特异 性的互补性的结合复合物产生，则该组条件被认为是至少同样严格的；其中"几乎没有更 多"是指少于其约5倍，典型地少于约3倍。其它的严格杂交条件是本领域已知的，并且也 可以适当地采用。如前所述，术语"高严格度条件"或"高度严格的杂交条件"一般是指如 下的条件，其适宜于在互补的结合成员之间（即在固定的探针和互补的样品核酸之间）产 生复合物，而不会导致非互补核酸之间发生任何实质性的复合物形成（例如任何无法通过 相对于阵列上的特征间区（interfeature area)和/或对照区的背景信号标准化而检测到 的复合物形成）。
[0032] 严格杂交条件还可以包括水相核酸与可降低复杂度的核酸 (complexity-reducing nucleic acids)的"预杂交"，以抑制重复序列。例如，某些严格杂 交条件包括在与表面结合的多核苷酸杂交之前，先与Cot-IDNA或类似物进行杂交。
[0033] 其他的杂交方法在描述CGH技术的参考文献中有描述（Kallioniemi 等，1992Science258:818-821;W093/18186.)。有若干关于通用技术的指南可 用（见例 如 Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parts I and II，Elsevier, Amsterdaml993.)。关于适合于原位杂交的技术的描述见例如Gall 等· 1981Meth. Enzymol. 21:470-480和 Angerer 等· Genetic Engineering:Principles and Methods, Setlow 和 Hollaender 编辑·ν〇17, 43-65 页（Plenum Press, New Yorkl985);美国 专利 Nos. 6, 335, 167, 6, 197, 501, 5, 830, 645,和 5, 665, 549。
[0034] 如本文中所使用的，术语"引物"是指具有与靶核酸的某个区域互补的核苷酸序列 的寡核苷酸。引物与互补区结合，并且在引物延伸条件下使用靶核酸作为模板被延伸。引 物可以是约20-约60个核苷酸，尽管也想到了该长度范围外的引物。"引物"可以在聚合酶 的作用下从其3'端延伸。不能在聚合酶的作用下从其3'端延伸的寡核苷酸不是引物。
[0035] 如本文中所使用的，术语"引物延伸条件"是指适合结合于靶核酸互补区中的引物 延伸的条件。引物延伸条件包括在特定温度下用核苷酸、聚合酶和缓冲液温育双链体核酸 一段时间。这些条件是本领域众所周知的。由引物延伸产生的新链在本文中被称作"引物 延伸产物"。
[0036] 如本文中所使用的，术语"扩增"是指使用靶核酸作为模板产生靶核酸的一个或多 个拷贝。
[0037] 如本文中所使用的，术语"扩增子"是指多核苷酸扩增反应的产物；S卩，多核苷酸 的克隆群体，其可以是单链的或双链的，并且是从一个或多个起始序列复制而来的。所述 一个或多个起始序列可以是同一序列的一个或多个拷贝，或者它们可以是不同序列的混合 物，所述不同序列含有共同的被扩增区域，例如存在于从某一样品中提取的DNA片段的混 合物中的特定外显子序列。优选地，扩增子是通过单一起始序列的扩增形成的。扩增子可 以通过多种扩增反应产生，所述扩增反应的产物包括所述一个或多个起始核酸或靶核酸 的复制物（replicates)。在一个方面中，产生扩增子的扩增反应是"模板驱动的"，体现在 反应物（核苷酸或寡核苷酸）的碱基配对在模板多核苷酸中具有互补物（complement)， 该互补物是产生反应产物所需要的。在一个方面中，模板驱动的反应是利用核酸聚合酶 的引物延伸或利用核酸连接酶的寡核苷酸连接。这样的反应包括，例如，聚合酶链式反 应（PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增（NASBAs)、滚环复制等，它们公开于下 列参考文献中，本文通过援引并入这些参考文献：Mullis等，美国专利Nos. 4, 683, 195 ;4, 965, 188;4, 683, 202;4, 800, 159(PCR) :Gelfand 等，美国专利 No. 5, 210, 015(使用 "taqman"探针的实时PCR);Wittwer等，美国专利No. 6，174,670;Kacian等，美国专 利 No. 5, 399. 491(〃NASBA〃）；Lizardi,美国专利 No. 5, 854, 033;Aono 等，日本专利公开 JP4-262799(滚环复制）等。在一个方面中，本发明的扩增子是通过PCR产生的。如本文中 所使用的，术语"扩增"意指实施扩增反应。
[0038] 如本文中所使用的，术语"聚合酶链式反应"或"PCR"是指一种酶反应，其中一种 特定的模板DNA用一对或多对序列特异性引物扩增。"PCR条件"是实施PCR的条件，并包 括提供试剂（例如核苷酸、缓冲液、聚合酶等）以及温度循环（例如通过适合于变性、复性 和延伸的温度的循环），并且是本领域已知的。
[0039] 如本文中所使用的，术语"互补"是指通过非共价键与感兴趣的靶核酸碱基配对的 核苷酸序列。在经典的Watson-Crick碱基配对中，DNA中的腺嘌呤（A)与胸腺嘧啶（T)形 成碱基对，鸟苷酸（G)与胞嘧啶（C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶（U)代替。 这样，A与T互补，而G与C互补。在RNA中，A与U互补，反之亦然。典型地，"互补"是指 与感兴趣的靶标完全互补的核苷酸序列，从而序列中的每一个核苷酸均与靶核酸相应位置 处的每一个核苷酸互补。在某些情况下，核苷酸序列可以与靶部分互补，其中不是所有核苷 酸均与靶核酸所有相应位置处的每一个核苷酸互补。
[0040] 如本文中所使用的，术语"探针"是指与感兴趣的核苷酸序列互补的核酸。在某些 情况下，靶分析物的检测需要探针与靶杂交。在某些实施方案中，探针可能被固定在基质表 面上，其中基质可以具有多种构型，例如片层、珠子或其它结构。在某些实施方案中，探针可 以存在于平面支持物的表面上，例如呈阵列的形式。
[0041] 如本文中所使用的，术语"链"(strand)是指由通过磷酸二酯键共价连接在一起的 多个核苷酸构成的核酸。一条核酸链不包括仅藉由氢键键合（即通过碱基配对）而缔合的 核苷酸，尽管该链可以藉由氢键键合与互补链碱基配对。
[0042] 核酸可以单链或双链形式存在。双链核酸具有两个互补的核酸链，它们在此可以 称作"第一链"或"第二链"，或者其他任意命名。第一链和第二链是不同的分子，而且将某 条链指定为第一链或第二链是任意的，并不暗示任何特定的方向、功能或结构。数种示例哺 乳动物染色体区（例如BAC、组装体、染色体等）以及许多病原体的第一链的核苷酸序列是 已知的，并可以在例如NCBI的Genbank数据库中找到。某一区域的第二链是与该区域互补 的。
[0043] 本发明的某些实施方案包括阵列，例如核酸阵列。"阵列"包括可寻址区域的任何 一维、二维或基本上二维（以及三维）排列，可寻址区域带有与该区域缔合（associated) 的特定化学部分（例如配体，例如生物聚合物如多核苷酸或寡核苷酸序列（核酸）、多肽 (例如蛋白质）、碳水化合物、脂质等）。"固定的"的意思是，所述部分与所述区域中的基质 表面稳定缔合，以至于它们在使用该阵列的条件下，例如杂交和洗脱条件下，不会从该区域 脱离。如本领域已知的，所述部分可以共价或非共价结合于所述区域的表面。例如，在基质 为多孔的情况下，每个区域可以延伸到第三个维度，而在基质是非多孔的情况下，则不会有 任何显著的第三维度尺寸（厚度）。核酸阵列是本领域已知的，其中可以修改成为如本文所 述的本发明阵列的代表性阵列包括在下列文献、以及其中引证的参考文献中描述的那些： 美国专利 Nos. 6, 656, 740; 6, 613, 893; 6, 599, 693; 6, 589, 739; 6, 587, 579; 6, 420, 180; 6, 387 ，636;6, 309, 875;6, 232, 072;6, 221，653;和 6, 180, 351。
[0044] 如本文中所使用的，术语"基质"是指这样的表面，其上可附着标记分子或探针，例 如阵列。玻片是最常见的用于生物芯片的基质，但熔融石英、硅、塑料和其它材料也可以是 合适的。
[0045] 基质可以成形为几乎任何形状。在一组实施方案中，基质有至少一个基本 上平的表面。然而，在其它实施方案中，基质还可以包括缺口（indentation)、突起 (protuberance)、阶（step)、脊（ridge)、梯级（terrace)等。取决于应用，基质可以用 任何合适的材料形成。例如，基质可以是硅基芯片或玻片。其它适合用于本发明的阵 列的基质材料包括，例如玻璃、陶瓷、塑料、金属、合金、碳、琼脂、硅石、石英、纤维素、聚 丙烯、聚酰胺、聚酰亚胺、和明胶，以及其它聚合物支持物或其它固体材料支持物。可以 用于基质中的聚合物包括，例如聚苯乙烯、聚（四）氟乙烯（PTFE)、聚偏二氟乙烯、聚 碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基乙烯（polyvinylethylene)、聚乙烯亚胺、聚甲醒 (Ρ0Μ)、聚乙烯苯酚（polyvinylphenol)、聚交酯、聚甲基丙烯酰亚胺（PMI)、聚亚烧基砜 (polyalkenesulfone, PAS)、聚丙烯、聚乙烯、聚轻乙基甲基丙烯酸酯（HEMA)、聚二甲基娃氧 烷、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺、各种嵌段共聚物等。
[0046] 用作探针的核酸的选择可能受到关于特定染色体或染色体区与某些疾病条件相 关性的在先知识的影响（见例如W093/18186,其列举了示例染色体异常及相关疾病）。或 者，可以使用本发明下文中将进一步讨论的方法进行全基因组扫描以鉴定拷贝数频繁变化 的新区域。
[0047] 如本文中所使用的，术语"染料"一般是指可吸收电磁辐射（例如波长大于或等于 340nm的电磁辐射）的任何有机或无机分子或部分。
[0048] 如本文中所使用的，术语"荧光染料"一般是指任何在被电磁辐射源（例如灯、光 电二极管或激光器）辐照时，通过荧光机制发射波长更长的电磁辐射的染料。
[0049] 术语"分离的"，在与核酸关联使用时（如在"分离的寡核苷酸"或"分离的多核苷 酸"中），是指被鉴定并与其在自然来源中通常相伴随的至少一种组分或污染物分离的核酸 序列。分离的核酸存在的形式或环境不同于其在自然界中出现的形式或环境。与之相对， 非分离的核酸，如核酸如DNA和RNA，则以其在自然中出现的状态存在。例如，给定的DNA序 列（例如基因）出现在其宿主细胞染色体上相邻基因的附近；RNA序列，例如编码特定蛋白 的特定mRNA序列，在细胞中作为与许多编码多种蛋白的其它mRNA的混合物出现。但是，编 码给定蛋白的分离的核酸包括例如这样的情况：该核酸存在于通常表达该给定蛋白的细胞 中，但位于不同于天然细胞中的染色体位置，或者其侧翼的核酸序列与自然界中出现的侧 翼核酸序列不同。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。当要使用 分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白时，寡核苷酸或多核苷酸将会至少含有有义或 编码链（即寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的），但是也可以同时含有有义链和反义链（即 寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的）。
[0050] 如本文中所使用的，术语"纯化的"或"纯化"是指，从样品中除去组分（例如污染 物）。例如，通过除去污染性非免疫球蛋白来纯化抗体；也可以通过除去不结合靶分子的免 疫球蛋白来纯化它们。非免疫球蛋白的去除和/或不结合靶分子的免疫球蛋白的去除导致 样品中的靶反应性免疫球蛋白的百分比增加。在另一个实例中，在细菌宿主细胞中表达重 组多肽，并通过除去宿主细胞蛋白来纯化该多肽；重组多肽在样品中的百分比由此得以提 商。
[0051] 发明详细说明
[0052] 本发明提供了含有树状染料分子的新型寡核苷酸探针，其可用于高灵敏度FISH 核酸，例如DNA和RNA。本发明的寡核苷酸探针克服了常规荧光探针的许多不足和缺陷。
[0053] 首先，与现有荧光探针相比，探针中可掺入的荧光染料的数目没有限制。其次，已 知树状分子染料一般比其对应的单独个体更加明亮，导致探针更加灵敏。第三，本发明荧光 探针的一个独有特征是使用点击化学，这一般可导致定量或接近定量的标记。而且，因为含 有染料的部分将位于FISH探针的5'侧，所以荧光部分不会影响探针与靶种类如基因组DNA 或RNA的杂交。
[0054] 在一个方面中，本发明一般地涉及寡核苷酸探针。寡核苷酸探针包括能够与感兴 趣的靶核酸杂交的核酸序列；和共价联接于所述寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于 含有两个或更多个荧光部分的树状分子基团。
[0055] 在某些优选实施方案中，该树状分子基团共价联接于所述引物的5'端（图1)。
[0056] 可用于本发明荧光探针的荧光染料可以是任何合适的染料，包括例如花青染 料（cyanine dyes)、罗丹明染料（rhodamine dyes)、突光酮染料（fluorine dyes)、 口丫陡染料（acridine dyes)、卩惡嗪染料（oxazin dyes)、菲陡染料（phenanthridine dyes)。在某些优选实施方案中，一个或多个荧光部分是从下选出的荧光染料： Cy2, Cy3, Cy3. 5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, IR 染料，Dyomics 染料、Oregon green488、Pacific Blue、 罗丹明绿（rhodamine green)、和 Alexa 染料。
[0057] 如本文中所使用的，术语"树状分子"（dendrimer)或"树状的"是指反复分枝 (repeated branched)的分子。树状分子是三维、高度分枝的、单分散性（monodisperse) 的纳米级（nanometric)大分子，通过一系列重复的反应（reiterative sequence of reactions)而获得。树状分子可以是单价或多价的。例如，多价树状分子可以是二价、三 价、四价、五价、六价、七价、八价、九价或十价的。在某些实施方案中，树状分子可以具有例 如2-10个分枝，11-20个分枝，或者超过20个分枝。树状分子通常具有规则重复的分枝结 构。当某个树状分子结构单元作为其前一个树状分子结构单元的完全拷贝从其前一个树状 分子结构单元延伸出来时，将该单元的延伸称为下一"代"（generation)。
[0058] 迄今为止树状分子是通过点击化学制备，例如采用Diels-Alder反应、巯基-炔 反应(thiol-yne reaction)和叠氮-块反应（azide-alkyne reaction) (Franc, et al. 2009Chem. Eur. J. vol. 15, Issue23, pp. 5630 - 5639;Kato, et al.2008J. Am. Chem. Soc.130 (15), pp. 5062 - 5064;Noda, et al. 1991Jpn. J. Psychiatry Neurol. 45(1):107 -8 ;Machai ah 1991 Indian J. Exp. Biol. 29(5) :463 - 7 ; Franc, et al. 2008Chem. Comm. Ρρ·5267 - 5276.)。
[0059] 本领域已知有大量的树状分子合成方法学。树状分子的合成方法包括发散法 (divergent method)，其中树状分子是从多官能核心开始，通过一系列反应（例如迈克尔反 应）向外延伸组装而成。
[0060] 方案 1
[0061]
【权利要求】
1. 一种寡核苷酸探针，包括： 能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和 共价联接于该寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于包含两个或更多个荧光部分的 树状分子基团。
2. 权利要求1的寡核苷酸探针，其中所述树状分子基团共价联接于所述引物的5'-端。
3. 权利要求1-2中任一项的寡核苷酸探针，其中所述一个或多个荧光部分是选自下组 的突光染料：Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7、IR 染料、Dyomics 染料、Oregon green488、 Pacific Blue、罗丹明绿和Alexa染料。
4. 权利要求1-3中任一项的寡核苷酸探针，其中所述树状分子基团具有如下的结构 式： 其中
L包含选自下组的反应性基团：炔、叠氮化物、巯基、-烯、异腈和四嗪；并且 i是约0-6的整数；并且 Q 是选自下组的荧光部分：Cy2, Cy3, Cy3. 5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, IR 染料，Dyomics 染 料，Oregon green488, Pacific Blue,罗丹明绿，和 Alexa 染料。
5. 权利要求1-4中任一项的寡核苷酸，其中所述树状分子基团是通过点击反应与所述 引物共价连接的，并且其中该点击反应是在所述引物上存在的炔部分与所述树状分子基团 中存在的叠氮部分之间发生的，或者该点击反应是在所述引物上存在的叠氮部分与树状分 子基团中存在的炔部分之间发生的。
6. -种生成寡核苷酸探针的方法，包括： 生成寡核苷酸文库； 提供多个引物，其中每一个引物均包含炔部分； 形成扩增子文库，其中每一个扩增子均包含所述寡核苷酸文库的成员和来自所述多个 引物中的引物； 提供包含两个或更多个荧光部分且包含叠氮部分的树状分子基团；和 通过使所述炔部分与所述叠氮部分反应而使所述扩增子与所述树状分子基团反应，从 而生成寡核苷酸探针文库。
7. 权利要求6的方法，其中该树状分子基团共价联接于所述多个引物中 每一个的5' -端，并且其中所述一个或多个荧光部分是选自下组的荧光染料： Cy2, Cy3, Cy3. 5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, IR 染料，Dyomics 染料，Oregon green488, Pacific Blue, 罗丹明绿，和Alexa染料，并且其中所述树状分子基团包含三个或更多个荧光部分。
8. 权利要求6-7中任一项的方法，其中所述树状分子基团具有如下的结构式：
其中 L包含选自下组的反应性基团：炔、叠氮化物、巯基、-烯、异腈和四嗪；并且 i是约0-6的整数；并且 Q是选自下组的荧光部分：Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7、IR染料、Dyomics染料、 Oregon green488、Pacific Blue、罗丹明绿、和 Alexa 染料。
9. 权利要求6-8中任一项的方法，其中所述树状分子基团是通过点击反应与所述多个 引物中的每一个共价连接的，并且其中该点击反应是在所述引物上存在的炔部分与所述树 状分子基团中存在的叠氮部分之间发生的，或者是在所述引物上存在的叠氮部分与所述树 状分子基团中存在的炔部分之间发生的。
10. -种用于检测或分析感兴趣的靶核酸的方法，包括： 提供寡核苷酸探针，其包含能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列和共价联接于第一 反应性部分的引物； 使该寡核苷酸探针与待分析感兴趣的靶核酸之存在的样品在一定条件下接触，使得如 果所述感兴趣的靶核酸存在，则在该寡核苷酸探针与该感兴趣的靶核酸之间形成杂交复合 物；和 使该经接触的样品与包含两个或更多个荧光部分以及第二反应性部分的树状分子成 像剂反应，从而该第二反应性部分与该第一反应性部分反应而形成共价键；和 对所述两个或更多个荧光部分进行成像，以检测或分析所述感兴趣的靶核酸之存在。
【文档编号】C12N15/11GK104059907SQ201410049893
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】J.拉基, S.陈, M.斯里尼瓦桑 申请人:安捷伦科技有限公司