专利名称：：青花菜的增殖方法
技术领域：
：本发明涉及青花菜的增殖方法。
背景技术：
：现有技术中，青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)的增殖方法一般为如下两种1、使用出芽培养基进行扩繁，此方法是从青花菜植株的基部产生新的芽点，利用芽点增殖；2、自然增殖。自然增殖的速度很慢，一般不作为专门的增殖方式。出芽培养基增殖方法中，出芽培养基含有Ag+，Ag+会对植株产生一定的毒害作用，如抑制植株生长、形成畸形植株，并且这种影响很难评估，可能对后继实验产生不利的影响。因此，需要一种安全且快速的青花菜增殖方法。
发明内容本发明的一个目的是提供一种青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)的增殖方法。本发明所提供的青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)的增殖方法，包括如下步骤1)将青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将所述去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至所述去根的青花菜植株长出根和顶芽，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；3)将所述具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的叶片基部长出芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；4)将所述具芽点的青花菜植株中的所述芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。上述方法中，所述步骤1)中，所述青花菜植株为下胚轴长度为3cm-7cm的青花菜植株；所述下胚轴长度具体为3cm、5cm或7cm。一般选取生长旺盛的、具有根、茎、叶的完整青花菜植株进行扩繁，一般下胚轴长度3-7cm的植株即是生长旺盛的植株。上述方法中，所述步骤2)和3)中，所述具有根和顶芽的青花菜植株中，所述根的长度为lcm-3cm，具体为2cm、lcm或3cm；上述方法中，所述步骤3)和4)中，所述具芽点的青花菜植株中，所述芽点的长度为1.52.5cm且所述芽点具有2片真叶；所述芽点的长度为1.5cm、2.0cm或2.5cm。上述方法中，所述增殖培养基是按照如下方法配制的向每1LMS培养基中添加40g蔗糖、10g琼脂和0.lmgIAA，调节PH至6.2，得到所述增殖培养基；所述生根培养基是按照如下方法配制的向每1LMS培养基中添加30g蔗糖、8g琼脂和0.lmglAA,调节PH至6.2，得到所述生根培养基。上述方法中，所述步骤2)、骤3)和骤4)中，所述培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX。上述方法中，所述培养过程中使用的容器设有透气部分；所述透气部分由孔径为0.1微米的透气膜构成；所述透气膜的材质是聚四氟乙烯；所述步骤2)、步骤3)和步骤4)中的培养包括透气的步骤，所述透气是通过所述透气部分实现的；所述步骤2)中，所述透气部分面积与所述容器的比例为4cm2250ml；所述步骤3)中，所述透气部分面积与所述容器的比例为8cm2250ml；所述步骤4)中，所述透气部分面积与所述容器的比例由0cm2250ml逐渐变至4cm2250ml。所述步骤4)中，所述透气部分面积与所述容器的比例由0cm2250ml逐渐变至4cm2250ml的方式为每3天增加一次透气部分面积，每次增加的透气部分面积与所述容器的比例为lcm2250ml。本发明青花菜的增殖方法，首先对青花菜植株进行腋芽催芽，再用芽进行繁殖，从而实现扩繁。青花菜植株本身是没有腋芽的，本发明是通过组织培养的技术催生出腋芽，进而进行快速繁殖的。实验证明，本发明方法的增殖周期短，增值率高，且得到的青花菜幼苗的成活率高。与现有技术相比，本发明方法在不使用含有Ag+的出芽培养基的情况下，便可实现增殖，无需引入Ag+，避免了Ag+对植株后期的生长产生抑制，消除了Ag+对转化株潜在的影响因素，消除了Ag+的重金属毒害。本发明方法适用于转基因青花菜的增殖，使后期转化株和对照株的对比结果更加可信。本发明方法在青花菜的增殖领域有广阔的应用前景。图1为透气孔1/2部分敞开的情况。图2为透气孔全部敞开的情况。图3为透气孔由完全封闭至1/2部分敞开的情况。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的青花菜植株均是按照如下方法培养得到的青花菜品种青秀(购自北京嘉禾种业有限公司)的种子经75%酒精处理30秒，再经2%的次氯酸钠溶液处理5分钟，然后接入经高温灭菌的1/2MS培养基中，培养至得到下胚轴长度为3cm-7cm的青花菜植株。下述各实施例中，均是将培养基置于玻璃兰花瓶中，将材料接种于培养基中，将带有培养材料的玻璃兰花瓶放入培养箱中进行培养的；培养过程中，需要的时候用透气膜封住瓶口。所用的玻璃兰花瓶购自北京振泰园艺设施有限公司。玻璃兰花瓶口直径为5cm，其体积为250ml，该玻璃兰花瓶的盖子上具有透气孔和透气膜(厂家固定于玻璃兰花瓶瓶盖上)，透气孔的面积与玻璃兰花瓶内容积的比为8cm2250ml，所述透气膜的材质是聚四氟乙烯，所述透气膜的孔径为0.1微米。透气膜可以阻挡空气中细菌进入且能调节透气孔敞开大小。透气膜就是玻璃兰花瓶与外界空气接触的部分(即透气部分)。下述实施例中使用的MS培养基组成如下MS培养基的溶剂是水、溶质如表1所示。表1.MS培养基的溶质<table>tableseeoriginaldocumentpage5</table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</table>实施例1、青花菜增殖增殖培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加40g蔗糖、IOg琼脂和0.ImgIAA,混勻，并调节其pH值至6.2，得到增殖培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。生根培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加30g蔗糖和8g琼脂，混勻，并调节其PH值至6.2，得到生根培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。一、增殖以下胚轴7cm长的青花菜植株作为增殖起始材料。增殖步骤具体如下1)在超净台中，将下胚轴7cm长的青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至去根的青花菜植株长出2cm长的根，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX。从接入培养基至长出2cm长的根，此过程需要7天。此培养过程中，使透气孔的1/2部分被敞开，且敞开部分由透气膜覆盖(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为4cm2250ml)(如图1所示)。3)在超净台中，将步骤2)得到的具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的大多数叶片基部长出2.Ocm长且具2片真叶的芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；其中，继续培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔全部敞开，且敞开部分由透气膜覆盖，即将透气孔旋转敞开到透气膜与空气接触面积最大的位置上，让其最大程度的和外界进行气体交换(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为8cm2250ml)。(如图2所示)从去除顶芽至长出2.Ocm长且具2片真叶的芽点，此过程需要14天。4)在超净台中，从具芽点的青花菜植株中将2.Ocm长且具2片真叶的芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔从完全封闭的状态逐渐调到1/2部分被敞开的状态，每3天使所述透气孔总面积的1/8部分被敞开(即透气部分面积与所述容器的比例由Ocm2250ml逐渐变至4cm2250ml，具体方式是每3天增加一次透气部分面积，每次增加的透气部分面积与所述容器的比例为Icm2250ml)；在整个过程中，透气孔敞开的部分均由透气膜覆盖，逐步加大它和外界的空气交换，降低其湿度。(如图3所示)从将芽点切下并接种于生根培养基，至得到青花菜幼苗，此过程需要15天左右。统计增殖周期及增殖率。增殖周期是从将青花菜植株去根至获得青花菜幼苗所用的时间，即从上述步骤1)至步骤4)所需的时间。增值率的计算公式增值率=最终得到的植株数/原始母本植株数X100%。实验设3次重复。结果取平均值。结果平均增殖周期为36天；平均增殖率为530%。二、营养钵移栽将获得的青花菜幼苗移栽入装有培养基质的营养钵中，在温度为28°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX的条件下培养，培养10天，获得青花菜植株；培养基质组成珍珠岩蛭石=11。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。三、田间移栽将营养钵移栽获得的植株移栽入田间，正常田间管理，得到青花菜植株。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。实施例2、青花菜增殖增殖培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加40g蔗糖、IOg琼脂和0.ImgIAA,混勻，并调节其pH值至6.2，得到增殖培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。生根培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加30g蔗糖和8g琼脂，混勻，并调节其PH值至6.2，得到生根培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。一、增殖以下胚轴3cm长的青花菜植株作为增殖起始材料。增殖步骤具体如下1)在超净台中，将下胚轴3cm长的青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至去根的青花菜植株长出Icm长的根，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX。此培养过程中，使透气孔的1/2部分被敞开，且敞开部分由透气膜覆盖(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为4cm2250ml)(如图1所示)。从接入培养基至长出顶芽和Icm长的根，此过程需要8天。3)在超净台中，将步骤2)得到的具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的大多数叶片基部长出1.5cm长且具2片真叶的芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；其中，继续培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔全部敞开，且敞开部分由透气膜覆盖，让其最大程度的和外界进行气体交换(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为8cm2250ml)。(如图2所示)从去除顶芽至长出1.5cm长且具2片真叶的芽点，此过程需要18天。4)在超净台中，从具芽点的青花菜植株中将1.5cm长且具2片真叶的芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔从完全封闭的状态逐渐调到1/2部分被敞开的状态，每3天使所述透气孔总面积的1/8部分被敞开(即透气部分面积与所述容器的比例由Ocm2250ml逐渐变至4cm2250ml，具体方式是每3天增加一次透气部分面积，每次增加的透气部分面积与所述容器的比例为Icm2250ml)；在整个过程中，敞开部分均由透气膜覆盖，逐步加大它和外界的空气交换，降低其湿度。(如图3所示)从将芽点切下并接种于生根培养基，至得到青花菜幼苗，此过程需要15天。统计增殖周期及增殖率。增殖周期是从将青花菜植株去根至获得青花菜幼苗所用的时间，即从上述步骤1)至步骤4)所需的时间。增值率的计算公式增值率=最终得到的植株数/原始母本植株数X100%。实验设3次重复。结果取平均值。结果平均增殖周期为41天；平均增殖率为260%。二、营养钵移栽将获得的青花菜幼苗移栽入装有培养基质的营养钵中，在温度为28°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX条件下培养，培养10天，获得青花菜植株；培养基质组成珍珠岩蛭石=11。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。三、田间移栽将营养钵移栽获得的植株移栽入田间，正常田间管理，得到青花菜植株。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。实施例3、青花菜增殖增殖培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加40g蔗糖、IOg琼脂和0.ImgIAA,混勻，并调节其pH值至6.2，得到增殖培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。生根培养基是按照如下方法配制的向ILMS培养基中添加30g蔗糖和8g琼脂，混勻，并调节其PH值至6.2，得到生根培养基；121.3摄氏度，1520分钟高压灭菌。一、增殖以下胚轴5cm长的青花菜植株作为增殖起始材料。增殖步骤具体如下1)在超净台中，将下胚轴5cm长的青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至去根的青花菜植株长出3cm长的根，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX。此培养过程中，使透气孔的1/2部分被敞开，且敞开部分由透气膜覆盖(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为4cm2250ml)(如图1所示)。从接入培养基至长出顶芽和3cm长的根，此过程需要10天。3)在超净台中，将步骤2)得到的具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的大多数叶片基部长出2.5cm长且具2片真叶的芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；其中，继续培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔全部敞开，且敞开部分由透气膜覆盖，让其最大程度的和外界进行气体交换(即透气部分面积与玻璃兰花瓶的比例为8cm2250ml)。(如图2所示)从去除顶芽至长出2.5cm长且具2片真叶的芽点，此过程需要14天。4)在超净台中，从具芽点的青花菜植株中将2.5cm长且具2片真叶的芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。其中，培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX，且使玻璃兰花瓶内的透气良好，具体方法是将透气孔从完全封闭的状态逐渐调到1/2部分被敞开的状态，每3天使所述透气孔总面积的1/8部分被敞开(即透气部分面积与所述容器的比例由Ocm2250ml逐渐变至4cm2250ml，具体方式是每3天增加一次透气部分面积，每次增加的透气部分面积与所述容器的比例为Icm2250ml)；在整个过程中，且敞开部分均由透气膜覆盖，逐步加大它和外界的空气交换，降低其湿度。(如图3所示)从将芽点切下并接种于生根培养基，至得到青花菜幼苗，此过程需要15天。统计增殖周期及增殖率。增殖周期是从将青花菜植株去根至获得青花菜幼苗所用的时间，即从上述步骤1)至步骤4)所需的时间。增值率的计算公式增值率=最终得到的植株数/原始母本植株数X100%。。实验设3次重复。结果取平均值。结果平均增殖周期为39天；平均增殖率为370%。二、营养钵移栽将获得的青花菜幼苗移栽入装有培养基质的营养钵中，在28°C、光照时间为16h/d条件下培养，培养10天，获得青花菜植株；培养基质组成珍珠岩蛭石=11。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。三、田间移栽将营养钵移栽获得的植株移栽入田间，正常田间管理，得到青花菜植株。统计成活率。成活率的计算公式为成活率=移栽成活的植株数/移栽植株总数。实验设3次重复。结果取平均值。平均成活率为100%。权利要求一种青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)的增殖方法，包括如下步骤1)将青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将所述去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至所述去根的青花菜植株长出根和顶芽，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；3)将所述具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的叶片基部长出芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；4)将所述具芽点的青花菜植株中的所述芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述青花菜植株为下胚轴长度为3cm-7cm的青花菜植株；所述下胚轴长度具体为3cm、5cm或7cm；所述步骤2)和3)中，所述具有根和顶芽的青花菜植株中，所述根的长度为lcm-3cm，具体为2cm、lcm或3cm；所述步骤3)和4)中，所述具芽点的青花菜植株中，所述芽点的长度为1.52.5cm且所述芽点具有2片真叶；所述芽点的长度为1.5cm、2.0cm或2.5cm。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述增殖培养基是按照如下方法配制的向每1LMS培养基中添加40g蔗糖、10g琼脂和0.lmgIAA，调节PH至6.2，得到所述增殖培养基；所述生根培养基是按照如下方法配制的向每1LMS培养基中添加30g蔗糖和8g琼脂，调节PH至6.2，得到所述生根培养基。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述步骤2)、骤3)和骤4)中，所述培养的条件为温度为25°C、光照时间为16h/d和光照强度为25001UX。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述培养过程中使用的容器设有透气部分；所述透气部分由孔径为0.1微米的透气膜构成；所述透气膜的材质是聚四氟乙烯；所述步骤2)、步骤3)和步骤4)中的培养包括透气的步骤，所述透气是通过所述透气部分实现的；所述步骤2)中，所述透气部分面积与所述容器的比例为4cm2250ml；所述步骤3)中，所述透气部分面积与所述容器的比例为8cm2250ml；所述步骤4)中，所述透气部分面积与所述容器的比例由0cm2250ml逐渐变至4cm2250ml。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤4)中，所述透气部分面积与所述容器的比例由0cm2250ml逐渐变至4cm2250ml的方式为每3天增加一次透气部分面积，每次增加的透气部分面积与所述容器的比例为lcm2250ml。全文摘要本发明公开了青花菜的增殖方法。该方法包括如下步骤1)将青花菜植株去根，将去根后的青花菜植株记作去根的青花菜植株；2)将所述去根的青花菜植株接入增殖培养基，培养，至所述去根的青花菜植株长出根和顶芽，将得到的植株记作具有根和顶芽的青花菜植株；3)将所述具有根和顶芽的青花菜植株去除顶芽，继续培养，至植株的叶片基部长出芽点，将此时期的植株记作具芽点的青花菜植株；4)将所述具芽点的青花菜植株中的所述芽点切下，并接种于生根培养基，培养，至得到青花菜幼苗。实验证明，本发明方法的增殖周期短，增值率高，且得到的青花菜幼苗的成活率高。本发明方法在青花菜的增殖领域有广阔的应用前景。文档编号A01H4/00GK101836590SQ201010197380公开日2010年9月22日申请日期2010年6月10日优先权日2010年6月10日发明者刘莉莎,杨鹏,温常龙,王玉珏,程琳,赵立群,郭仰东申请人:中国农业大学