一种冷冻贻贝生物抑菌剂及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种冷冻贻贝生物抑菌剂及制备方法和应用，其原料中含有地夫子总黄酮提取物、乌梅粗多糖提取物、马尾藻多糖提取物、鱼腥草总黄酮提取物和带鱼下脚料亚铁螯合物成分，其原料质量组分为：地夫子总黄酮提取物粉剂︰乌梅粗多糖提取物粉剂︰马尾藻多糖提取物粉剂︰鱼腥草总黄酮提取物粉剂︰带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂=6︰4︰4︰4︰3，其原料的粒径为80～120目，本发明开发的抑菌剂成本低，效果好，能够显著降低冷冻贻贝中多种微生物和致病性微生物，显著延长贻贝保质期，本发明在相关冷冻贻贝上应用后产品相关微生物检验指标明显好转。
【专利说明】一种冷冻贻贝生物抑菌剂及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋食品保鲜剂领域，具体涉及一种冷冻贻贝生物抑菌剂及其制备方法和该抑菌剂的应用。
【背景技术】
[0002]贻贝是我国知名海产之一，全国各地均有出产，种类以紫贻贝、厚壳贻贝为主，从辽宁大连到海南岛均有贻贝出产，但从产量来说，舟山嵊泗是我国贻贝的最大产地。由于贻贝营养丰富，水分含量高，因此不仅活体贻贝死亡时间短，且死亡之后极易发生腐败变质。此外，由于贻贝养殖对于水体洁净度要求较高，这使得贻贝产区普遍位于偏远海岛地区，造成贻贝的鲜销仅能局限于产区周围县市，而内陆消费者对贻贝的消费仅能以冻贻贝或干贻贝为主。现有冷冻贻贝在生产过程中尽管采用了单冻处理，但冻品在运输过程中容易出现温度升高而导致的微生物生长繁殖，最终发生贻贝的腐败变质，目前，在我国冷链设备和冷链系统不完善的条件下，如何解决冷冻贻贝运输过程中的微生物腐败问题意义重大。
[0003]李哲等发表“贻贝抗菌肽的分离纯化”(安微农业科学，2012年40卷10期，5768-5770页)中指出:从贻贝体内提取具有抗菌作用的多肽，以紫贻贝为原料，采用0.5%的乙酸直接提取抗菌肽，再经过分离纯化，得到的贻贝抗菌肽具有较强的抗菌性，虽然可以防止冷冻贻贝过早腐败，但是由于其提取成本高，且需要大量的原材料，不利于大规模生产。此外，专利号为201210100101.7，申请日为2012年4月9日的中国发明专利，公开了一种“紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法”，是通过对紫贻贝总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、基因克隆、重组质粒构建、表达质粒表达和蛋白纯化步骤，得到的一种新的C型溶菌酶，对多种革兰氏阳性和阴性微生物具有较强的抑制活性，但是，也是其复杂的提取技术、昂贵的提取成本，不适合大规模应用。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种冷冻贻贝生物抑菌剂，该抑菌剂能够显著降低冷冻贻贝中多种腐败微生物和致癌性微生物，显著延长贻贝保质期，保鲜效果好，不但成本低，而且绿色安全，提高冷冻贻贝产品的食品安全性。
[0005]本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法。
[0006]本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种冷冻贻贝生物抑菌剂的应用方法，在冷冻贻贝上应用后相关微生物检验指标明显好转。
[0007]本发明解决上述问题所采用的技术方案为:
本发明一种冷冻贻贝生物抑菌剂，其原料中含有地夫子总黄酮提取物、乌梅粗多糖提取物、马尾藻多糖提取物、鱼腥草总黄酮提取物和带鱼下脚料亚铁螯合物成分。
[0008]作为优选，所述的抑菌剂其原料质量组分为:地夫子总黄酮提取物粉剂:乌梅粗多糖提取物粉剂:马尾藻多糖提取物粉剂:鱼腥草总黄酮提取物粉剂:带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂=6:4:4:4: 3，其原料的粒径为80?120目。[0009]本发明一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法为:
1)粉剂制备
①地夫子总黄酮提取物粉剂制备:先将地夫子干燥、粉碎，再用乙醇提取地夫子总黄酮，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到地夫子总黄酮提取物粉剂；
②乌梅粗多糖提取物粉剂制备:先将乌梅干燥、粉碎，再用乙醇提取乌梅粗多糖，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到乌梅粗多糖提取物粉剂；
③马尾藻多糖提取物粉剂制备:先将马尾藻干燥、粉碎，再用乙醇提取马尾藻多糖，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到马尾藻多糖提取物粉剂；
④鱼腥草总黄酮提取物粉剂制备:先将鱼腥草干燥、粉碎，再用乙醇提取鱼腥草总黄酮，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到鱼腥草总黄酮提取物粉剂；
⑤带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂制备:先将带鱼下脚料亚铁螯合物制备成水溶液，再经浓缩、冷冻干燥、粉碎后得到带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂；
2)抑菌剂制备:将地夫子总黄酮提取物粉剂、乌梅粗多糖提取物粉剂、马尾藻多糖提取物粉剂、鱼腥草总黄酮提取物粉剂、带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂按照6: 4: 4: 4: 3的质量比复配成冷冻贻贝生物抑菌剂。
[0010]作为优选:
1)所述地肤子醇溶液制备工艺条件为:温度70?75°C，乙醇浓度90?95%，提取时间8?10h，料液比1: 20 ;
2)乌梅醇溶液制备工艺条件为:温度85?90°C，乙醇浓度75?80%，提取时间6?7h，料液比I: 30;
3)所述鱼腥草醇溶液制备工艺条件为:温度85?90°C，乙醇浓度60?65%，提取时间6?8h，料液比1:30 ；
4)所述马尾藻醇溶液制备工艺条件为:温度50?55°C，乙醇浓度70?75%，提取时间6?8h，料液比1:40。
[0011]作为优选，所述带鱼下脚料亚铁螯合物的水溶液制备工艺为:首先将带鱼下脚料加水搅拌得到水解底物，再加入水解酶进行水解，水解结束后将水解液加热、灭酶，再将水解液过滤、微滤和0.22 μ m膜过滤，最后用超滤膜分离得到。
[0012]作为优选，所述步骤I)中，其干燥、粉碎的工艺为:置于30?40°C的烘箱内干燥10?20h，后统一粉碎至100目。
[0013]作为优选,所述水解酶是指碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶,所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活力配比为4:6，所述水解底物与水解酶质量比为100: 0.5，水解底物和水解酶的总重量与水的重量配比为10: I。
[0014]作为优选，水解结束后，将所述水解液加热到100°C、灭酶lOmin，水解液经过滤、微滤、0.22 μ m膜过滤后再用透过分子量为3 kDa的超滤膜分离，选取分子量大于3 kDa的部分，膜分离条件为PH6.5，温度35 °C。
[0015]作为优选:
1)所述地肤子的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度185°c，出风温度90°C，进液量 5mT ,/mi η ；
2):所述乌梅的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度180°C，出风温度85°C，进液量 8mL/min ；
3)所述马尾藻的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度180°C，出风温度80°C，进液量 10mT ,/mi η ；
4)所述鱼腥草的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度190°C，出风温度90°C，进液量 8mT ,/mi η η
[0016]本发明一种冷冻贻贝的植物颗粒抑菌剂的用途在于:该抑菌剂用在冷冻贻贝保鲜中应用。
[0017]本发明开发的抑菌剂成本低，效果好，通过对个各生物原料进行烘干、粉碎、提取、喷雾干燥后按一定比例调配成复合生物抑菌剂，能够显著降低冷冻贻贝中多种微生物和致病性微生物，显著延长贻贝保质期，保鲜时间长，本发明在相关冷冻贻贝上应用后产品相关微生物检验指标明显好转。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明在冷冻贻贝加工过程中运用后微生物指标检测表；
图2为使用本发明抑菌剂与未使用抑菌剂的冷冻贻贝TVBN的变化对比图；
图3为使用本发明抑菌剂与未使用抑菌剂的冷冻贻贝TBA的变化对比图。
【具体实施方式】
[0019]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0020]一种冷冻贻贝生物抑菌剂，其原料质量组分为:地夫子总黄酮提取物粉剂:乌梅粗多糖提取物粉剂:马尾藻多糖提取物粉剂:鱼腥草总黄酮提取物粉剂:带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂=6:4:4:4: 3，其原料的粒径为80?120目。其原料中含有地夫子总黄酮提取物、乌梅粗多糖提取物、马尾藻多糖提取物、鱼腥草总黄酮提取物和带鱼下脚料亚铁螯合物成分。
[0021]实施例1
上述冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法如下:
1)地肤子总黄酮提取物粉剂制备:称取IOg地肤子，置于35°C内烘焙10h，粉碎至100目，称取I份质量的地肤子粉，加入20份质量的浓度为90%乙醇，在70°C温度下提取8h，地肤子总黄酮提取率达1.66?1.71%。后经过滤，取液体部分进入喷雾干燥机，进风温度1800C，出风温度85°C，进液量8mL/min，得地肤子总黄酮提取物粉剂；
2)乌梅粗多糖提取物粉剂制备:称取IOg乌梅，置于35°C内烘焙10h，粉碎至100目，称取I份质量的乌梅粉，加入30份质量的浓度为75%乙醇，在85°C温度下提取6h，乌梅粗多糖提取率4.12?4.21%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机，进风温度185°C，出风温度90°C，进液量5mL/min，得乌梅粗多糖提取物粉剂；
3)马尾藻多糖提取物粉剂制备:称取IOg马尾藻，置于35°C内烘焙10h，粉碎至100目，称取I份质量的马尾藻粉，加入40份质量的浓度为70%乙醇，在50°C温度下提取6h，马尾藻多糖提取率为1.69?1.79%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机进风温度180°C，出风温度80°C，进液量10 (mL/min)，得马尾藻多糖提取物粉剂；
4)鱼腥草总黄酮提取物粉剂:称取IOg鱼腥草，置于35°C内烘焙10h，粉碎至100目，称取I份质量的鱼腥草粉，加入30份质量的浓度为60%乙醇，在85°C温度下提取6，鱼腥草总黄酮提取率为1.66?1.73%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机进风温度190°C，出风温度90°C，进液量8 (mL/min)，得鱼腥草总黄酮提取物粉剂；
5、带鱼下脚料亚铁螯合物:带鱼下脚料经搅拌机搅拌,搅拌速率10000r/min,搅拌程序为开机30s，停机lmin，再开机30s，再停机lmin，如此往复5次后得到水解底物，水解酶选择碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶活力配比4:6加入，总加酶量为22000U/g，底物与酶质量比为100: 0.5，料液比为10: 1，即称取IOOg水解底物，加入900mL水后搅拌均匀，然后再加入由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配而成的混合酶5g。水解酶解时间8h，水解pH7.0,酶解温度45°C。水解结束后将水解液加热到100°C、IOmin灭酶，水解液按照0.5%比例加入浓度为lmol/L的氯化亚铁溶液(新鲜配置)，震荡螯合30min，得螯合液。螯合液再经过滤、微滤、0.22 μ m膜过滤后再用透过分子量为3 kDa的超滤膜分离，选取分子量大于3 kDa的部分,膜分尚条件为pH6.5,温度35°C。分尚部分经浓缩、冷冻干燥和粉碎后得到带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂。
[0022]将上述地夫子粉剂、乌梅粉剂、马尾藻粉剂、鱼腥草粉剂、带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂按照按照6:4:4:4:3的质量比复配，得到“冷冻贻贝生物抑菌剂”。
[0023]实施例2
上述冷冻贻贝生物抑菌剂的又一制备方法如下:
1、地肤子总黄酮提取物粉剂制备:称取IOg地肤子，置于35°C内烘焙12h，粉碎至100目，称取I份质量的地肤子粉，加入20份质量的浓度为95%乙醇，在75°C温度下提取10h，地肤子总黄酮提取率1.66?1.71%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机进风温度180°C，出风温度85°C，进液量8mL/min，得地肤子总黄酮提取物粉剂；
2、乌梅粗多糖提取物粉剂制备:称取IOg乌梅，置于35°C内烘焙12h，粉碎至100目，称取I份质量的乌梅粉，加入30份质量的浓度为80%乙醇，在90°C温度下提取7h，乌梅粗多糖提取率4.12?4.21%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机，进风温度185°C，出风温度90°C，进液量5mL/min，得乌梅粗多糖提取物粉剂；
3、马尾藻多糖提取物粉剂制备:称取IOg马尾藻，置于35°C内烘焙12h，粉碎至100目，称取I份质量的马尾藻粉，加入40份质量的浓度为75%乙醇，在55°C温度下提取8h，马尾藻多糖提取率为1.69?1.79%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机进风温度180°C，出风温度80°C，进液量10mL/min，得马尾藻多糖提取物粉剂；
4、鱼腥草总黄酮提取物粉剂制备:称取IOg鱼腥草，置于35°C内烘焙12h，粉碎至100目，称取I份质量的鱼腥草粉，加入30份质量的浓度为65%乙醇，在90°C温度下提取8h，鱼腥草总黄酮提取率为1.66?1.73%。后经过滤，取液体部分上喷雾干燥机进风温度190°C，出风温度90°C，进液量8mL/min，得鱼腥草总黄酮提取物粉剂；
5、带鱼下脚料亚铁螯合物:带鱼下脚料经搅拌机搅拌,搅拌速率10000r/min,搅拌程序为开机30s，停机lmin，再开机30s，再停机lmin，如此往复5次后得到水解底物，水解酶选择碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶活力配比4:6加入，总加酶量为22000U/g，底物与酶质量比为100: 0.5，料液比为10: 1，即称取IOOg水解底物，加入900mL水后搅拌均匀，然后再加入由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配而成的混合酶5g。水解酶解时间8h，水解pH7.0,酶解温度45°C。水解结束后将水解液加热到100°C、IOmin灭酶，水解液按照0.5%比例加入浓度为lmol/L的氯化亚铁溶液(新鲜配置)，震荡螯合30min，得螯合液。螯合液再经过滤、微滤、0.22 μ m膜过滤后再用透过分子量为3 kDa的超滤膜分离，选取分子量大于3 kDa的部分,膜分尚条件为pH6.5,温度35°C。分尚部分经浓缩、冷冻干燥和粉碎后得到带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂。
[0024]将上述地夫子总黄酮提取物粉剂、乌梅粗多糖提取物粉剂、马尾藻多糖提取物粉齐U、鱼腥草总黄酮提取物粉剂、带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂按照按照6:4:4:4:3的质量比复配，得到“冷冻贻贝生物抑菌剂”。
[0025]本发明抑菌剂在冷冻贻贝保鲜中应用，其实施效果如下:
制备浓度为0.25 g/L抑菌剂用于冷冻贻贝的加工过程中，冷冻贻贝的加工流程为:原料接受:一预冷保鲜一清洗一机械去壳一修整一清洗一称量一装盘一速冻一镀冰衣一包装—金属检测一冷藏一出厂发运。贻贝经过两次抑菌剂清洗处理后，贻贝中各主要病原微生物、菌落总数均显著降低，如图1所示，表明贻贝抑菌剂可有效降低原料中病原微生物，显著提高颗粒贻贝安全。
[0026]从图2中可看出，对照组和保鲜剂(抑菌剂)处理组的贻贝TVBN (挥发性盐基氮)含量，随贮藏时间延长呈增加趋势，样品经抑菌剂处理后，TVBN增加相对缓慢，第20 d时达到20 mg/100g,比对照组延缓了 9 d，一般在低温有氧条件下，TVBN的量达到30mg / IOOg时，即认为是变质的标志。
[0027]此外，从图3中可以看出，本发明抑菌剂对贻贝抗氧化(TBA)效果。经过抑菌剂处理的贻贝，过氧化值显著低于对照组，表明本发明防腐剂兼具有一定抗氧化效果，尽管生物防腐剂抗氧化效果并不是十分理想，但考虑到贻贝产品贮藏和运输过程中通常处于_18°C的低温，而实验时采用了较高的4°C条件。因此，冷冻水产品保持在较低温度下时，本发明抑菌剂的抗氧化效果仍将会有一定程度的提高。
[0028]通过本发明所述方法制备的“冷冻贻贝生物抑菌剂”能够显著降低冷冻颗粒贻贝中的多种腐败微生物和致病性微生物，显著延长贻贝保质期，提高贻贝产品食品安全性，本发明在相关冷冻颗粒贻贝应用后产品相关微生物检验指标明显好转。
【权利要求】
1.一种冷冻贻贝生物抑菌剂，其特征在于:其原料中含有地夫子总黄酮提取物、乌梅粗多糖提取物、马尾藻多糖提取物、鱼腥草总黄酮提取物和带鱼下脚料亚铁螯合物成分。
2.根据权利要求1所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂，其特征在于，所述的抑菌剂其原料质量组分为:地夫子总黄酮提取物粉剂:乌梅粗多糖提取物粉剂:马尾藻多糖提取物粉剂:鱼腥草总黄酮提取物粉剂:带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂=6:4:4:4: 3，其原料的粒径为80~120目。
3.根据权利要求1或2所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)粉剂制备: ①地夫子总黄酮提取物粉剂制备:先将地夫子干燥、粉碎，再用乙醇提取地夫子总黄酮，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到地夫子总黄酮提取物粉剂； ②乌梅粗多糖提取物粉剂制备:先将乌梅干燥、粉碎，再用乙醇提取乌梅粗多糖，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到乌梅粗多糖提取物粉剂； ③马尾藻多糖提取物粉剂制备:先将马尾藻干燥、粉碎，再用乙醇提取马尾藻多糖，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到马尾藻多糖提取物粉剂； ④鱼腥草总黄酮提取物粉剂制备:先将鱼腥草干燥、粉碎，再用乙醇提取鱼腥草总黄酮，制备成醇溶液，所得的醇溶液经浓缩后，再经喷雾干燥得到鱼腥草总黄酮提取物粉剂； ⑤带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂制备:先将带鱼下脚料亚铁螯合物制备成水溶液，再经浓缩、冷冻干燥、粉碎后得到带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂；` 2)抑菌剂制备:将地夫子总黄酮提取物粉剂、乌梅粗多糖提取物粉剂、马尾藻多糖提取物粉剂、鱼腥草总黄酮提取物粉剂、带鱼下脚料亚铁螯合物粉剂按照6: 4: 4: 4: 3的质量比复配成冷冻贻贝生物抑菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法，其特征在于: 1)所述地肤子醇溶液制备工艺条件为:温度70~75°C，乙醇浓度90~95%，提取时间8~10h，料液比1: 20 ; 2)乌梅醇溶液制备工艺条件:温度85~90°C，乙醇浓度75~80%，提取时间6~7h，料液比I: 30； 3)所述鱼腥草醇溶液制备工艺条件:温度85~90°C，乙醇浓度60~65%，提取时间6~8h，料液比1:30 ； 4)所述马尾藻醇溶液制备工艺条件:温度50~55°C，乙醇浓度70~75%，提取时间6~8h，料液比1:40。
5.根据权利要求3所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述带鱼下脚料亚铁螯合物的水溶液制备工艺为:首先将带鱼下脚料加水搅拌得到水解底物，再加入水解酶进行水解，水解结束后将水解液加热、灭酶，再将水解液过滤、微滤和0.22μ m膜过滤，最后用超滤膜分离得到。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中，其干燥、粉碎的工艺为:置于30~40°C的烘箱内干燥10~20h，后统一粉碎至100目。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述水解酶是指碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活力配比为4:6，所述水解底物与水解酶质量比为100: 0.5，水解底物和水解酶的总重量与水的重量配比为10: I。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:水解结束后，将所述水解液加热到100°C、灭酶IOmin,水解液经过滤、微滤、0.22 μ m膜过滤后再用透过分子量为3 kDa的超滤膜分离，选取分子量大于3 kDa的部分，膜分离条件为pH6.5，温度35°C。
9.根据权利要求3所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂的制备方法，其特征在于: 1)所述地肤子的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度185°C，出风温度90°C，进液量 5mT ,/mi n ； 2):所述乌梅的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度180°C，出风温度85°C，进液量 8mT ,/mi n ； 3)所述马尾藻的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度180°C，出风温度80°C，进液量 10mT ,/mi n； 4)所述鱼腥草的醇提取液的喷雾干燥工艺条件为:进风温度190°C，出风温度90°C，进液量 8mT ,/min
10.根据权利要求1或2所述的一种冷冻贻贝生物抑菌剂的用途，其特征在于:该抑菌剂在冷冻贻贝保鲜中应用。
【文档编号】A23B4/20GK103875795SQ201410050001
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】邓尚贵, 霍健聪, 张宾, 林慧敏, 满德慧, 唐艳, 林雪 申请人:浙江海洋学院