专利名称：转基因米粉标准样品、其建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因米粉BT63的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因米粉BT63中的应用。
背景技术：
水稻是人民生活的主粮，我国又是水稻的主产区，毎年我国出口到日本、韩国等国家的糙米、大米等产品占我国水稻产量的近1/3。为提高水稻产量，我国在转基因水稻研究方面已经进行了广泛深入的研究，并取得了可喜的成果 ，但并未批准进行商业化种植。然而，去年在湖北等国内市场上出现了未经商业化批准种植的转BT基因大米的销售，并被国外检测公司公布于众。这给我国农产品的贸易带来了非常不好的影响。为此，韩国、日本等国对我国出口的糙米、大米等产品要求批批实施转基因的检测。转Bt基因抗虫水稻尚未在全球任何地区获准种植，对于Bt转基因水稻也未通过任何环境影响评估和人类食品安全评估。但是，从其它Bt转基因作物(如玉米和棉花)的研究结果中，已经可以推断出Bt水稻会对环境造成极大的影响，并且引起人类食品安全问题。2006年以来，我国出口的米制品中多次被欧盟和日本检出转基因水稻成分，其中多为我国研发的转基因水稻汕优63号(BT63)。由于我国尚未向转基因水稻发放生物安全证书，出口米制品中检出转基因水稻成分对我国的米制品出口贸易造成了一定影响。与出ロ米制品类似，我国检验检疫部门也从美国进ロ的大米中检出了未经我国批准进境的抗除草剂转基因水稻成分。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性，保障食品安全，解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。2008年，我们首次研制了转基因玉米Mon810品系、NK603品系、T25品系、BTll品系、转基因油菜RT73品系标准样品以及相应的分子DNA标准样品，填补了国内空白。这些标准样品在转基因产品检测工作中发挥了巨大作用。然而，在我国米制品出口被检测出转基因BT63成分后，国内外各食品安全管理机构和检测机构，开始大量地开展米制品中转基因成分BT63的检测，但国内外市场却始終没有转基因BT63的标准样品。国内转基因BT63品系标准样品紧缺。
发明内容
鉴于国内转基因水稻BT63品系标准样品紧缺的状况，我们研制了转基因米粉BT63品系标准样品，本发明中，所述的转基因米粉BT63即转基因水稻BT63磨制成粉状之后的产品，本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。转基因水稻BT63品系简介转基因水稻BT63在进行基因转化时转入的外源基因是抗虫基因crylAb/crylAc，由NOS終止子调控。本发明通过以下技术路线实现本发明的一方面在于公开ー种转基因米粉BT63标准样品，其由下述方法制备，步骤包括a.在无菌操作间中，使用研钵粉磨水稻样品，过100目标准筛，制成了米粉，向粉末中加入4倍质量的水，搅拌均匀；b.将混合样品放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；c.将混合冻干粉样品分装于经160° C干热处理2h的洁净的棕色玻璃瓶中封盖密封，甸瓶内装混合冻干粉样品lg。d.获500瓶转基因米粉标准样品。瓶装后的样品加贴唯一性标识，放置于阴凉干燥处(TC 4°C贮存。上述步骤(a) Cd)中任ー项所述的冻干，其具体步骤如下低温真空冷冻干燥程序①样品预冻先把样品在_80°C冷冻2h ；②冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至O. 5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室的温度设置为15°C，当真空度降至O. ITorr吋，样品已干燥好;④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。本发明的另一方面在于公开ー种转基因水稻BT63的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因米粉BT63检测基因和阳性标准对照品，其中，阳性标准对照品是利用上述a d的方法制备的转基因米粉BT63标准样品；转基因米粉BT63检测基因，包括SPS基因的检测引物和探针序列正向引物5，-ttgcgcctgaacggatat-3’SEQ ID NO 1反向引物5，-cggttgatcttttcgggatg-3，SEQ ID NO 2探针5，-FAM-tccgagccgtccgtgcgtc-TAMRA-3，SEQ ID NO 3crylAc/NOS基因的检测引物和探针序列正向引物5，-gactgctggagtgattatcgacaga-3，SEQ ID NO 4反向引物5，-agctcggtacctcgacttattcag-3，SEQ ID NO 5探针5，-FAM-tcgagttcattccagttactgcaacactcgag-TAMRA-3，SEQ ID NO 6其中FAM为 6-carboxyfluorescein, TAMRA 为 6-carboxytetramethylrhodamine。本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做參考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。
试剂盒的使用方法是以待测样品的基因组为模板，利用转基因米粉BT63检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。或者通过PCR特异性的引物和探针序列，扩增待测样品与阳性标准对照品，并将扩增的结果进行比对，确认样品中是否含有转基因水稻BT63品种，具体制作和检测方法參照实施例。上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。本发明的创新特征是本项标准样品的制备完成及其制备方法的建立，对解决转基因BT63品系检测分子标准样品的制备技术和稳定性保证技术，开 展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义及应用价值。
图I :转基因米粉BT63标准样品制备、检测エ艺流程。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。转基因水稻BT63在进行基因转化时转入的外源基因是抗虫基因crylAb/crylAc，由NOS终止子调控。我国尚未发放转基因水稻BT63生物安全证书。转基因水稻BT63品系原料获赠于辽宁出入境检验检疫局；研钵，100目标准筛，DNA提取试剂和PCR反应试剂均购于宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司(货号D9093)；TaqMan Universal Master Mix :购于 ABI 公司；引物和探针宝生物工程(大连)有限公司合成；实时荧光定量PCR仪ABI 7500型；核酸蛋白分析仪日本日立公司。实施例I转基因米粉状标准样品的制备步骤a.在无菌操作间中，使用研钵粉磨水稻样品，过100目标准筛，向粉末中加入4倍质量的水，搅拌均匀；b.将混合样品放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；c.将混合冻干粉样品分装于经160°C干热处理2h的洁净的棕色玻璃瓶中封盖密封，甸瓶内装混合冻干粉样品lg。d.获500瓶转基因米粉标准样品。瓶装后的样品加贴唯一性标识，放置于阴凉干燥处(TC 4°C贮存。上述步骤(a) Cd)中任ー项所述的冻干，其具体步骤如下低温真空冷冻干燥程序
①样品预冻先把样品在_80°C冷冻2h ；②冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至O. 5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室的温度设置为15°C，当真空度降至O. ITorr时，样品已干燥好;④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖，制备成混合冻干粉。e.将混合冻干粉样品分装于经160°C干热处理2h的洁净的棕色玻璃瓶中封盖密封，甸瓶内装混合冻干粉样品lg，获500瓶转基因米粉标准样品。瓶装后的样品加贴卩隹一性标识，放置于阴凉干燥处0°C 4°C贮存。实施例2定值方法采用《水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法》SN/T 2584-2010和《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》GB/T 19495. 5-2004进行定值。(a) DNA提取试剂盒宝生物工程(大连)有限公司(货号D9093)(b) TaqMan Universal Master Mix :ABI 公司(c)实时荧光定量PCR仪ABI 7500型(d)核酸蛋白分析仪日本日立公司检测转基因水稻BT63品系特异性及内源SPS基因的引物序列和探针序列见下表I。表I检测转基因水稻BT63品系特异性基因的引物序列和探针序列SPS棚的检测11物和探针序列.
权利要求
1.转基因米粉BT63标准样品，其特征在干，由下述方法制备，步骤包括 将原料研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入4倍质量的水，搅拌均匀后，放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥制备成冻干粉；分装后于0°C 4°C贮存；上述低温真空冷冻干燥的步骤包括 ①样品预冻先把样品在_80°C冷冻2h； ②冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35°C吋，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C吋，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至O. 5Torr时，结束冷冻过程； ③样品干燥干燥室的温度设置为15°C，当真空度降至O.ITorr吋，样品已干燥好； ④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。
2.—种转基因水稻BT63的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括转基因米粉BT63检测基因和阳性标准对照品 阳性标准对照品是权利要求2所述的转基因米粉BT63标准样品； 转基因米粉BT63检测基因，包括 SPS基因的检测引物和探针序列 正向引物 SEQIDN0:1 反向引物 SEQ ID NO :2 探针SEQ ID NO 3 crylAc/NOS基因的检测引物和探针序列 正向引物 SEQ ID NO :4 反向引物 SEQ ID NO :5 探针SEQ ID NO :6。
全文摘要
本发明公开一种转基因米粉BT63的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因水稻BT63中的应用，分别以转基因水稻BT63为原料，将原料研磨、过筛、加水，搅拌、制备成冻干粉；再分装,0℃~4℃贮存；通过上述方法获得转基因米粉BT63的标准样品，也可以应用于转基因水稻BT63的Real-Time PCR检测试剂盒。这对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
文档编号C12Q1/68GK102690885SQ20121017220
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹际娟 申请人:于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹际娟