专利名称：一种利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产碱性果胶酶的方法，尤其涉及一种通过对补料前后PH进行分段控制发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物酶制备技术领域。
背景技术：
果胶酶(pectinases)是大一类可分解植物细胞壁组分果胶质的酶系总称，从分解方式上可以将果胶酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，前者主要包括原果胶酶(PPase)、果胶酯酶(PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG);后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)。人们常称的碱 性果胶酶一般指果胶裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶。果胶裂解酶通过反式消去作用裂解果胶聚合体，在C-4位置上断开糖苷键，同时在C-5处消去一个H原子。从而产生一个Δ4:5不饱和键。目前对于果胶酶的研究已有大量的文献报道，其中研究时间较长的酸性果胶酶主要用于果胶组分的提取和果酒果汁的澄清，碱性果胶酶在制浆漂白，棉织物处理工艺中的应用取得了一定进展，特别是在麻类纤维的脱胶上的应用研究日趋增多。原麻是一种被各种胶质粘接在一起的片条状物，单纤维不易分开，因此在梳理纺纱之前必须对原麻进行脱胶处理。长期以来的脱胶方式主要是化学脱胶，其基本原理是利用原麻中纤维素和胶质成分对碱、无机酸和氧化剂的稳定性不同以去除原麻中的胶质成分。该方法往往导致麻纤维受损，影响麻织物的优良品质，同时消耗大量的化工原料和热能，造成严重的环境污染。因此该工艺不适应于经济社会的发展。近年来，生物脱胶受到了较多的关注，其主要包括微生物脱胶，酶脱胶和生物-化学联合脱胶。其中酶脱胶因具有操作灵活性强，便于添加脱胶助剂等优势而成为研究的重点。日本学者Koki Horkoshi于1972年首次报道了嗜碱细菌可分泌碱性果胶酶，Junwei Cao, T. SaKai, Tohru Kobayashi等也相继分离筛选到产碱性果胶酶的菌株。我国 从90年代初开始对碱性果胶酶进行了研究，已经报道的产生菌包括欧文氏菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、螺孢菌等，但研究工作主要停留在菌种筛选及对酶学性质的研究；在碱性果胶酶的发酵研究方面，大多停留在摇瓶条件优化，小型发酵罐产酶条件的初步优化研究上。刘曦等对高产碱性果胶酶枯草芽孢的产酶条件进行了优化，使酶活力提高到了14. 82U ml/1 (碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化.生物技术，2008，18 ￠) :71-74.)。蒋红菊等对多粘类芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶的培养基及发酵培养条件进行了优化，使酶活达到311UH1L-1 (多粘类芽孢杆菌20185液态发酵产碱性果胶酶发酵条件的研究.中国酿造，2011，235:111-114.)。董云舟等在小型发酵罐中采用温度控制策略对碱性果胶酶进行发酵优化，使芽孢杆菌WSH03-09产碱性果胶酶的酶活达5. 99U mL—1 (芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略.应用与环境生物学报，2005，11 (3) :359-362.)。刘慧娟等研究了不同温度(32-41° C)对芽孢杆菌WSHB04-02分批发酵生产碱性果胶酶动力学参数的影响，温度优化后可使碱性果胶酶的酶活达到53. OU mL—1，生产强度为(芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略.过程工程学报，2007,7(4) :786-789.)。中国专利ZL 03131952. I公开了一株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌，液体深层发酵得到碱性果胶酶酶活力为20UH1L-1 ;中国专利ZL 200410065807. X公开了一种通过氧气在发酵液中的传递速率体积溶氧系数(K#)提高碱性果胶酶活力的方法，其酶活力达到了 40U mL-1,但该酶活力与工业化要求还有一段距离。李祖明等对克劳氏芽孢杆菌进行了紫外诱变育种和固态发酵条件优化(高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究.工业微生物，2008，38(3) :27-31.);中国专利 ZL 94105708. 9、CN 101096650B、ZL 200410073818.2、CN 101235361A公开了不同菌株固体发酵生产碱性果胶酶的方法，由于酶活力测定方法不一，产酶能力无法直观比较；同时也因为固体发酵设备要求高、工艺复杂而鲜见其应用于工业生产。ZL 97109044公开了一株嗜碱芽孢杆菌及其苎麻脱胶的方法，但由于脱胶时间长(16-24h)，果胶酶活力低也难于工业化应用。ZL01106844. 2公开了一株碱性果胶酶生产菌CCTCC N0:M200038，并将发酵所得酶液应用于苎麻脱胶，由于其发酵酶活力较低而未能应用于工业化生产。因此通过发酵工艺控制和优化提高碱性果胶酶酶活力和容积生产效率，降低生产成本是技术开发和工程放大的关键。其中，PH控制优化在发酵生产中得到了广泛的应用，其可以有效调控细胞生长和产酶的理化环境，间接反映培养基的C/N和细胞存活情况，是发酵罐控制和优化的关键因素。由于发酵前期细胞生长和发酵中后期细胞大量产酶对于理化环境、营养状况要求存在差异，因此在pH的控制上也应当做出相应调整。在检索到的相关方法中，关于通过两段PH控制进行碱性果胶酶生产的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术中，碱性果胶酶活力低，成本高，不适合工业化生产和应用的不足，本发明目的是提供一种利用两段PH控制发酵生产碱性果胶酶的方法。本发明所述的利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，是通过对补料前后pH进行两段控制提高碱性果胶酶酶活力及其生产效率，具体方法如下(I)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37° C摇床震荡培养7_9h ；(2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7. 5L发酵罐,进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34° C，通气量2. 5-4. 5L mirT1 ；(3) pH控制I :采用10%磷酸(v/v)和氨水通过在线反馈控制初发酵液pH值，将pH控制在5. 47. O ；(4)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为32. 5U g—1，液化温度为55° C，液化时间为30min ；(5)补料发酵初发酵至16h，按初发酵培养基体积量20%补加预处理后的补料培 养基，继续发酵，发酵温度为33-34° C，通气量为2. 5-4. 5L mirT1 ；(6) pH控制II :采用10%磷酸(v/v)和氨水通过在线反馈控制补料后发酵液pH值，将pH控制在4. 9-6. 5 ;发酵周期为36-48h ；(7)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液；种子培养基组成是葡萄糖Ilg ΙΛ酵母粉4，5g ΙΛ蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ；发酵培养基组成是淀粉20g ΙΛ 麦麸 40g L-1，(NH4)2SO4 I. 5g Γ1, MgSO4 · 7H20Ig L-1 ；补料培养基组成是淀粉122. 5g L—1，麦麸 10. 5g L-1，(NH4)2SO4 IOg L-1，MgSO4 · 7H206. 5g L'上述利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法中步骤(3)所述初发酵液pH值优选控制在5. 6-6. 8，最优选为6. 2±0. 2。
步骤(6)所述补料后发酵液pH值优选控制在5. 1-6. 3，最优选为5. 7±0. 2。上述方法中涉及的在线参数测定溶氧(DO)、pH、温度采用电极在线自动控制，DO为相对溶氧水平，即在培养基未接种之前通气30min，使培养基达到饱和溶氧水平，此时DO标定为100%，饱和亚硫酸钠溶氧标定为0%。上述方法中涉及的离线参数测定生物量取发酵液ImL (以发酵液离心后上清作为对照)于比色管中加入IM的高氯酸ImL,沸水浴20min后,转至离心管中IOOOOrpm离心IOmin,取上清ImL定容到IOmL,于紫外分光光度计260nm处测定其吸光值测定吸光值，比照标准曲线计算菌体干重。标准曲线制作方法为稀释得到浓度梯度菌体，分别测定OD 26(|，并对应称量菌体干重，以细胞干重为X轴，OD 26(|为Y轴绘制标准曲线。碱性果胶酶(PGL)活性取5mL发酵液，与1200rpm，4° C离心lOmin，取上清用pH 9. 6Gly-Na0H缓冲液稀释一定倍数后取20 μ I加入2mL O. 2% (w/v)的聚半乳糖醛酸溶液(用 pH 9. 6，含 O. 44mM CaCl2, O. 05mM Gly-NaOH 缓冲液配置)，45° C 反应 15min,用 3mLO. 03M磷酸溶液终止反应，于紫外分光光度计235nm处测定其吸光值。一个标准酶活力单位(IU)定义为单位时间(Imin)使聚半乳糖醛酸裂解产生I μ mo I不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。其中不饱和半乳糖醛酸在波长235nm处的摩尔吸光系数为 4600 (M)0本发明的有益效果本发明方法通过对补料前后pH进行两段控制明显提高了碱性果胶酶酶活力及其生产效率；使碱性果胶酶的单位酶活力达到了 743U πιΓ1，最高容积生产效率达到24U(ml · h)-1 (国内外未见报道)。该方法大大缩短了发酵周期，从而提高了发酵罐利用效率，降低了生产成本；该方法操作简单易行，为工业化生产奠定了坚实的基础。发酵生产的碱性果胶酶初酶液可用于麻纤维原料的脱胶处理，能有效缩短甚至省去化学脱胶工序，改善麻纤维产品的品质，减少废液对环境的污染。
图I为补料分批发酵和两段pH控制对碱性果胶酶活力的影响。
具体实施例方式实施例I枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M200038 (申请人于2000年11月20日保藏于中国典型培养物中心(CCTCC)，相关专利见ZL01106844. 2)经斜面活化，挑起菌苔接种至装有种子培养基的摇瓶进行培养，培养条件为300ml三角瓶装液量为50ml，发酵温度37° C，200rpm震荡培养8h。以接种量10%接种初发酵培养基，pH控制在5. 6-6.0，温度33-34° C，通气量2. 5-4. SLmin^10用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为32. 5U g_S液化温度为55° C，液化时间为30min。初发酵至16h，按初发酵培养基体积的20%补加预处理以后的补料培养基，pH控制在5. 1-5. 5，控制温度33-34° C，，通气量2. 5-4. 5Lmin^0发酵周期为36-48h。发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液；经实验测定，获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为671U mL'发酵过程如图I所示。其中培养基配方如下 种子培养基组成是葡萄糖Ilg ΙΛ酵母粉4，5g ΙΛ蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ；发酵培养基组成是淀粉20g ΙΛ 麦麸 40g L-1，(NH4)2SO4L 5g IAMgSO4 · 7H20 IgL-1 ；补料培养基组成是淀粉122. 5g ΙΛ 麦麸 10. 5g L-1，(NH4)2SO4IOg L-1，MgSO4 · 7Η206· 5g L'实施例2发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料前pH控制为6. 0-6. 4，补料后PH控制为5. 5-5. 9。经实验测定，发酵获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为743伽1人发酵过程如图I所示。实施例3发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料前pH控制为6. 4-6. 8，补料后PH控制为5. 9-6. 3。经实验测定，发酵获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为660U ml'发酵过程如图I所示。实施例4发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料前pH不控制，补料后pH自然。经实验测定，发酵获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为531U πιΓ1。发酵过程如图I所示。与实施例1、2、3相比，本实施例获得的粗酶液碱性果胶酶酶活力明显较低。实施例5发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料前pH控制为5. 4-5. 8，补料后PH控制为4. 9-5. 3。经实验测定，发酵获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为384U ml'实施例6发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料前pH控制为6. 6-7. O，补料后PH控制为6. 1-6.5。经实验测定，发酵获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为349U ml'
权利要求
1.一种利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，其步骤如下 (1)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCCN0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37° C摇床震荡培养7_9h ； (2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7.5L发酵罐，进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34° C，通气量2. 5-4. 5L mirT1 ； (3)pH控制I :采用体积浓度为10%的磷酸和氨水通过在线反馈控制初发酵液pH值，将pH控制在5. 4-7. O ； (4)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为32. 5U g—1，液化温度为55° C，液化时间为30min ； (5)补料发酵初发酵至16h，按初发酵培养基体积量20%补加预处理后的补料培养基，继续发酵，发酵温度为33-34° C，通气量为2. 5-4. SLmirT1 ； (6)pH控制II:采用体积浓度为10%的磷酸和氨水通过在线反馈控制补料后发酵液pH值，将pH控制在4. 9-6. 5 ;发酵周期为36-48h ； (7)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液； 上述种子培养基组成是葡萄糖Hg L—1，酵母粉4，5g L—1，蛋白胨4. 5g L-1，NaCl 4. 5gΙΛ K2HPO4IOg ΙΛ pH 8. O ； 上述发酵培养基组成是淀粉20g L—1，麦麸40g L—1，(NH4)2SO4L 5g L—1，MgSO4 · TH2Olgr1 ； 上述补料培养基组成是:淀粉 122. 5g L—1，麦麸 10. 5g L-1，(NH4)2SO4IOg LlMgSO4 ·7Η206.5gL、
2.如权利要求I所述利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述初发酵液PH值控制在5. 6-6. 8。
3.如权利要求2所述利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述初发酵液PH值控制在6. 2 ± O. 2。
4.如权利要求I所述利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(6)所述补料后发酵液PH值控制在5. 1-6. 3。
5.如权利要求4所述利用两段pH控制生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(6)所述补料后发酵液PH值控制在5. 7±0. 2。
全文摘要
本发明公开了一种利用两段pH控制发酵生产碱性果胶酶的方法，是根据细胞在发酵前期分裂生长和发酵中后期大量产酶对于理化环境、营养状况(pH可直接或间接放映)要求存在差异，通过在线反馈控制pH的方法在补料前后对发酵液进行两段pH控制，提高了碱性果胶酶酶活力及其生产效率。经实验检测，本发明得到了聚半乳糖醛酸裂解酶活力为743Uml-1的碱性果胶酶的发酵粗酶液，最高容积生产效率达到24U(mL·h)-1。本方法生产的碱性果胶酶成本低廉、发酵周期短、设备利用率高、工艺简单，适于规模化工业生产。
文档编号C12R1/125GK102660526SQ20121017182
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者曲音波, 李雪芝, 赵建, 邹谋勇 申请人:山东大学