一种石蒜中加兰他敏的提取方法
【专利摘要】本发明提供了一种石蒜中加兰他敏的提取方法，包括步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasil100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-磷酸缓冲液(17：83)，柱温：35℃，进样量20μL，检测波长：290nm；磷酸缓冲液为2.72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7.02；步骤二、标准曲线的制备：按步骤一色谱条件建立回归方程；步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2.0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱测定，计算石加兰他敏得率。本发明提取成本低、提取时间短，工艺简单，对环境无污染，提取得率较高。
【专利说明】一种石蒜中加兰他敏的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种加兰他敏提取方法，特别涉及一种石蒜中加兰他敏的提取方法。
【背景技术】
[0002] 石蒜（Lycoris radiate. Herb)是石蒜科（Amaryllidaceae)石蒜属（Lycoris)的 多年生草本植物，主要分布在亚洲，我国有17种，在我国湖南、湖北、江苏、浙江、福建等省 均有分布。石蒜属植物具有较高的观赏价值，被誉为"中国郁金香"，石蒜鳞茎富含淀粉，如 将其磨碎后用大量水淘洗，脱毒后食用，味如糯米粉，《救荒本草》中记载，可将其炒熟，水浸 过食。石蒜性味辛、甘、温，具有消肿、杀虫的作用，其所含丰富的生物碱也得到广泛应用， 尤其是加兰他敏，随着人口老龄化的严重加剧，阿尔茨海默病（AD)造成的疾病负担日益增 力口，而石蒜鳞茎中的加兰他敏因毒副作用小、疗效显著的优势是目前被美国FDA认可的抗 AD药物之一，国内外需求量巨大；其次，它还可用于闭角型青光眼、术后肠肌麻痹、脊髓灰 质炎引起的瘫痪、重症肌无力的治疗。石蒜是加兰他敏原料药的植物来源之一，但含量低， 其提取通常采用溶剂的抽提方法，提取较为耗时，并且资源浪费、环境污染严重，因此提供 一种新的加兰他敏的提取方法就显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 为解决上述现有技术的问题，本发明提出一种石蒜中加兰他敏的提取方法，为达 到上述目的，本发明的技术方案为：
[0004] 一种石蒜中加兰他敏的提取方法，包括如下步骤：
[0005] 步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasill00_5C18反相柱（250mmX4. 6mm, 5ym);流动相：乙腈-磷酸缓冲液（17 : 83)，柱温：35°C，进样量20yL，检测波长：290nm; 磷酸缓冲液为2. 72g磷酸二氢钾溶于100mL水中加入1. 4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为 7. 02 ；
[0006] 步骤二、标准曲线的制备：分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容， 配成1. Omg/mL的加兰他敏及1. Omg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、 5mL加兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0. 005、0. 01、0. 02、 0. 05、0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的混合标准溶液，用0. 45 μ m的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件 测定，得回归方程；
[0007] 步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2. 0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH = 4. 5的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱 测定，计算加兰他敏得率。
[0008] 步骤三中，所述加兰他敏得率的计算公式为 CV
[0009] y =一xl00〇/o 仍〇
[0010] 式中：c为加兰他敏的质量浓度Amg/mL) ;V为提取液定容体积/mL為为石蒜粉 末的质量/mg。
[0011] 步骤三中加兰他敏的提取条件为：浸提温度50°C、浸提时间2. Oh、加酶量4%、提 取剂选取pH = 4. 5的水溶液。
[0012] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明采用pH为4. 5的水作为提取溶剂， 提取溶剂中加入4%的纤维素酶与果胶酶的复合酶，通过浸提法得到加兰他敏提取得率为 0. 0294%。该工艺石蒜加兰他敏提取成本低、提取时间短，工艺简单，对环境无污染，提取得 率较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1酶种类对得率的影响，其中1纤维素酶、2半纤维素酶、3果胶酶。
[0014] 图2pH对得率的影响。
[0015] 图3酶用量对得率的影响。
[0016] 图4浸提时间对得率的影响。
[0017] 图5温度对得率的影响。
[0018] 图6料液比对得率的影响。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体附图及试验例对本发明方法做进一步详细说明：
[0020] 1材料与方法
[0021] 1.1材料与试剂
[0022] 石蒜于2012年3月采自湖南省怀化市沅陵县官庄。
[0023] 加兰他敏标准品（纯度> 98% )中国食品药品鉴定研究院；石蒜喊标准品（纯度 >98%)上海金穗生物科技有限公司；纤维素酶淮安市百麦绿色生物能源有限公司果胶酶 如吉生物科技甲醇、乙腈（均为色谱纯）美国Tedia公司；浓硫酸、磷酸二氢钾、三乙胺均为 分析纯。
[0024] 1. 2仪器与设备
[0025] Agilentl260高效液相色谱仪美国Agilent公司；数显水浴锅金坛富华仪器有限 公司。
[0026] 1. 3 方法
[0027] 1. 3. 1色谱条件
[0028] 色谱柱：Kromasill00_5C18 反相柱（250mmX4. 6mm，5 μ m);流动相：乙腈-磷酸缓 冲液（17 :83)，柱温：35°C，进样量20 μ L，检测波长：290nm。磷酸缓冲液为2. 72g磷酸二氢 钾溶于100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7. 02。
[0029] 1. 3. 2标准曲线的制备
[0030] 分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成1. Omg/mL的加兰他敏 及1. Omg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、l、2、5mL加兰他敏及石蒜碱标准 溶液定容于l〇mL容量瓶中配成质量浓度为0. 005、0. 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的 混合标准溶液，用〇. 45 μ m的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定，得回归方程。
[0031] 1.3. 3加兰他敏的提取
[0032] 称取石蒜粉末2. Og，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH = 4. 5的水溶液在一定温度 条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液。采用色谱测定，计算加兰他敏得 率。
[0033] 7 = -xl00%
[0034] 式中：c为加兰他敏的质量浓度Amg/mL) ;V为提取液定容体积/mL卿为石蒜粉 末的质量/mg。
[0035] 1. 3. 4提取工艺优化
[0036] 1. 3. 4. 1单因素试验
[0037] 按1. 3. 3节方法，分别考察酶的种类、提取剂pH、酶用量、浸提时间、浸提温度和料 液比对加兰他敏得率的影响，确定各个单因素的最佳水平。
[0038] 1. 3. 4. 2 正交试验
[0039] 在单因素试验的基础上，选取浸提温度（A)、浸提时间（B)、酶用量（C)、提取剂 pH(D) 4项考察因素，每个因素选取3个水平，以加兰他敏得率为考察指标，采用L9 (34)正交 表进行试验。
[0040] 2结果与分析
[0041] 2.1加兰他敏的检测
[0042] 以1. 3. 1节所示色谱条件进行检测，加兰他敏的出峰时间约在10. lmin。以标准 品的含量为横坐标（X)，以峰面积为纵坐标（Y)，进行线性回归。加兰他敏的回归方程：Y = 8968. 6X+4. 5795, r = 0. 9999。取同一个试样，在上述色谱条件下，连续进样6次，经计算加 兰他敏峰面积的相对标准差（RSD)为1.35%。取同一个试样，在上述色谱条件下，每隔2h 进样1次，共进样6次，经计算加兰他敏峰面积的相对标准差（RSD)分别为1. 66%，这说明 该检测方法精密度良好，方法稳定可靠。
[0043] 2. 2单因素试验
[0044] 2. 2. 1酶的筛选
[0045] 以pH = 4. 5的水为提取剂在料液比1 : 10,加入3%的不同酶（1纤维素酶、2半 纤维素酶、3果胶酶、4纤维素酶+半纤维素酶、5纤维素酶+果胶酶、6半纤维素酶+果胶酶、 7纤维素酶+半纤维素酶+果胶酶）50°C浸提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。考察不同酶种 类对加兰他敏得率的影响，结果见图1。
[0046] 图2显示了各种酶对加兰他敏提取效果的影响，纤维素酶和果胶酶的的混合酶效 果最好。
[0047] 2· 2· 2pH 的影响
[0048] 加入3%的纤维素酶和果胶酶的混合酶，按料液比1 :10,分别加入pH= 1. 5、3、4、 4. 5、5、6、7. 5的水溶液，50°C浸提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。考察pH对加兰他敏得率的 影响，结果见图2。
[0049] 由图3可知在1?4. 5范围内加兰他敏的得率随着pH的升高而提高，但pH超过 4. 5后得率随pH的升高而降低，最佳pH为4. 5。
[0050] 2. 2. 3酶用量的影响
[0051] 加入一定量的纤维素酶和果胶酶的混合酶，按料液比1 : 10,加入pH = 4. 5的水 溶液，50°C浸提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。考察酶用量对兰他敏得率的影响，结果见图3。
[0052] 图4结果表明，酶用量在0?3%，加兰他敏得率随酶用量的增加而增加，超过3% 后得率随时间的增加呈下降趋势。酶用量为3%时提取效果最佳。
[0053] 2. 2. 4浸提时间的影响
[0054] 按料液比1 : 10加入pH = 4. 5的水溶液，加入3%的纤维素酶和果胶酶，50°C浸 提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。结果见图4。
[0055] 由图5得出，加兰他敏得率随浸提时间的增长而增加，浸提1. 5h，得率达最大值， 随后下降。浸提时间应在1. 5h时提取效果最佳。
[0056] 2. 2. 5温度的影响
[0057] 按料液比1 : 10加入pH = 4. 5的水溶液，加入3%的纤维素酶和果胶酶，不同温 度下浸提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。结果见图5。
[0058] 图6结果显示，一定范围内加兰他敏得率随温度增加而上升，当温度为50°C时，力口 兰他敏得率最高。
[0059] 2. 2. 6料液比的影响
[0060] 按一定料液比加入pH = 4. 5的水溶液，分别加入3 %的纤维素酶和果胶酶，在 50°C浸提2. 0h，离心，过滤，HPLC检测。结果见图6。
[0061] 由图6可知，加兰他敏得率在1 : : 10时得率最高。
[0062] 2. 3正交试验
[0063] 在单因素试验的基础上，选取浸提温度、浸提时间、酶用量、提取剂pH为考察因 素，进行正交试验。结果见表1、表2。
[0064] 表1正交试验设计与结果
[0065] Tablel Scheme and results of orthogonal array design
[0066]
[0067]
【权利要求】
1. 一种石蒜中加兰他敏的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、色谱条件的确定：色谱柱：Kromasill00-5C18反相柱（250mmX4. 6mm，5ym);流 动相：乙腈-磷酸缓冲液（17 :83)，柱温：35°C，进样量20μ L，检测波长：290nm ;磷酸缓冲液 为2. 72g磷酸二氢钾溶于lOOmL水中加入1. 4mL三乙胺定溶至1L，其pH值为7. 02 ; 步骤二、标准曲线的制备：分别称取25mg加兰他敏及25mg石蒜碱标准品，定容，配成 1. Omg/mL的加兰他敏及1. Omg/mL的石蒜碱标准溶液，各取0· 05、0. 1、0. 2、0. 5、l、2、5mL加 兰他敏及石蒜碱标准溶液定容于10mL容量瓶中配成质量浓度为0. 005、0. 01、0. 02、0. 05、 0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的混合标准溶液，用0. 45μηι的微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件测定， 得回归方程； 步骤三、加兰他敏的提取：称取石蒜粉末2. 0g，加入纤维素酶和果胶酶，加入pH = 4. 5 的水溶液在一定温度条件下浸提一定时间，5000r/min离心20min，取上清液，采用色谱测 定，计算加兰他敏得率。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述加兰他敏得率的计算公式为 7 = -xl〇〇〇/" mo 式中：C为加兰他敏的质量浓度Amg/mL) ;V为提取液定容体积/mL ;m(l为石蒜粉末的 质量/mg。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中加兰他敏的提取条件为：浸提温度 50°C、浸提时间2. Oh、加酶量4%、提取剂选取pH = 4. 5的水溶液。
【文档编号】C07D491/107GK104059078SQ201310712971
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】田春莲, 王鹏, 刘小攀, 肖卓炳 申请人:吉首大学