专利名称：使用编码双链启动子一条链的引物的方法
技术领域：
本发明总体上涉及通过使用编码双链启动子一条链的启动子引物获得环形单链DNA转录底物而由RNA聚合酶来制备对应于靶序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。本发明对于研究、诊断和治疗应用例如制备对应于mRNA的cDNA、制备有义或反义探针、检测基因或生物体特异性序列或制备RNAi具有广阔的适用性。
背景技术：
相关领域的说明本领域众所周知，若将靶序列插入到克隆载体中转录启动子如但不限于T7 RNA聚合酶启动子或另外的T7型RNA聚合酶启动子的下游，并将所得的克隆在转录条件下与识别相应启动子的RNA聚合酶温育，或将所述克隆转化进能够表达此RNA聚合酶的宿主细胞中，则该靶序列可在体外或体内转录(例如参见Studier，FW等，pp.60-89in Methods in Enzymology，Vol.185，Goeddel，DV编辑，AcademicPress，1990，特此并入作为参考)。在合适的条件下，此系统也可用于在体外或在体内在适当的宿主细胞中表达由包含基因的靶序列编码的蛋白。转录一个或多个靶核酸序列有益的原因有多种。例如，体外转录被频繁地用在制备对应于样品中的mRNA序列的探针的方法中，以描述相对于另一类或相对于相似类型的特定类型细胞中基因响应不同的条件或刺激物的表达谱。当前基因表达谱分析典型地是通过同时将由一个或多个样品制备的标记探针与将多达数百种或数千种不同基因序列连接到表面上的阵列或微阵列进行杂交进行的。在有些情况下，特定基因的表达或表达的缺乏可能与病态如但不限于癌症的存在或状态有关，或可指示之。许多为此类目的制备对应于靶序列的探针的方法是本领域公知的。涉及体外转录以制备探针用于基因表达谱分析的方法的实例描述在Murakawa等，DNA7287-295，1988；Phillips和Eberwine，Methods in Enzymol.Suppl.10283-288，1996；Ginsberg等，Ann.Neurol.45174-181，1999；Ginsberg等，Ann.Neurol.4877-87，2000；VanGelder等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871663-1667，1990；Eberwine等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA893010-3014，1992；美国专利No.5,021,335；5,168,038；5,545,522；5,514,545；5,716,785；5,891,636；5,958,688；6,291,170以及PCT专利申请WO 00/75356和WO 02/065093中。又有其它方法使用体外转录作为用于扩增和检测一种或多种靶核酸序列的步骤的一部分，以便为医疗目的检测作为致病因子的病原体如病毒或微生物病原体的存在，或检测与疾病或疾病状态相关的基因序列。将体外转录用于此目的的方法的实例包括美国专利No.5,130,238；5,194,370；5,399,491；5,409,818；5,437,990；5,466,586；5,554,517；5,665,545；6,063,603；6,090,591；6,100,024；6,410,276；Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861173，1989；Fahy等，InPCR Methods and Applications，pp.25-33，1991；PCT专利申请号WO89/06700和WO 91/18155以及欧洲专利申请No.0427073 A2和0427074 A2。单链DNA模板用于转录的用途并不常见。不过，Milligan等(Nucleic Acids Res.，158783-8798，1987)证明双链DNA模板并非是利用T7 RNA聚合酶合成RNA所必需的，条件是单链DNA模板含有双链-17至+1 T7启动子区。并且，利用非共价地固定在固相支持物上的单链DNA模板通过与互补启动子序列退火合成RNA的方法描述在美国专利No.5,700,667中。另外，授予Aono Toshiya等的日本专利No.JP4304900公开了利用具有双链T7 RNA聚合酶启动子的环形单链模板合成RNA。JP4304900中公开的用于转录的环形底物是通过连接线性探针获得的，该线性探针具有当其与样品中的靶序列退火时彼此邻近的靶互补性3′-和5′-端序列。然而，所有上文所引述的通过复制靶核酸序列获得探针和转录底物的方法涉及合成包含可操作地连接于双链模板的双链转录启动子的线性双链DNA。本领域通过靶序列复制获得探针或转录底物的方法使用双链DNA模板的原因是可以理解的，如果详细研究这些方法的过程的话。例如，Van Gelder等在美国专利No.5,545,522、5,716,785和5,891,636中描述的方法利用启动子引物合成双链转录底物。首先，利用这样的启动子引物反转录mRNA靶，该引物包含位于互补于一个或多个mRNA靶序列的3′-端部分5′端的启动子序列。然后，利用RNA或来自第一链cDNA的发夹作为引物合成第二链cDNA。由于RNA聚合酶以5′-至-3′的方向转录模板链，使用根据此法的启动子引物，启动子序列能够以正确的取向结合到靶序列上的唯一方法是在第二链cDNA的3′-端复制启动子引物的启动子序列。也就是说，该启动子引物的启动子序列利用第二链cDNA作为模板指导RNA转录。用于转录的模板链因此具有与样品中的mRNA靶序列完全相同的Watson-Crick碱基配对序列，且转录产物包含反义RNA。Van Gelder等的启动子引物中所用的单链启动子序列为有功能双链启动子的一条链，在文中称之为“反义启动子”，而相应的启动子引物在文中称之为“反义启动子引物”。类似地，双链启动子中可操作地连接于模板链的启动子序列在文中称之为“有义启动子序列”，而包含此序列的启动子引物称之为“有义启动子引物”。本发明部分地提供了利用有义启动子引物以获得对应于靶序列的转录产物的新方法。该法制备包含编码靶序列的单链DNA模板的转录底物，该ssDNA模板可操作地连接于有功能的双链启动子。本发明的另外方面将会因下文的说明书而被理解。
发明简述本领域的方法使用反义启动子引物，而本发明的有些实施方案提供了使用有义启动子引物的方法。从而，作为实例，但并非就用于转录的启动子序列或相应的RNA聚合酶而言限制本发明，尽管美国专利No.5,545,522、5,716,785和5,891,636的启动子引物中所用的反义T7启动子序列和+1碱基为(5′TAATACGACTCACTATAG 3′)；能够用于本发明有些实施方案的启动子引物中的对应有义T7启动子序列和+1碱基为(5′CTATAGTGAGTCGTATTA 3′)。本发明提供了通过转录环形转录底物用于产生对应于样品中的靶核酸序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。如
图1所示，获得环形转录底物的方法的第一步是有义启动子引物通过利用靶序列作为模板的引物延伸。然后利用连接酶在连接条件下连接所得的含有义启动子的第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA。环形转录底物是通过使互补反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火获得的。该环形转录底物包含可操作地连接于对应于靶序列的单链模板的双链转录启动子。本发明也包括获得线性转录底物的方法。在一个实施方案中，如图2所示，含有义启动子的环形第一链cDNA(如上文所述获得)利用本文下面所述的方法线性化。然后，所得的含有义启动子的线性第一链cDNA接着与反义启动子寡核苷酸复合以获得线性转录底物。备选地，可线性化环形转录底物以获得包含可操作地连接于单链模板的双链转录启动子的线性转录底物。环形和线性转录底物都可用于产生对应于靶核酸序列的转录产物。本发明也包括用于扩增由转录底物转录而获得的转录产物的量的方法。如图3所示，一个实施方案使用由第一转录底物转录而获得的转录产物，以通过根据本文所述本发明方法利用有义启动子引物产生附加的转录底物。本发明也包括通过使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的第一链或第二链cDNA退火获得转录底物的方法实施方案，其使用连接于或固定于表面上的包含反义启动子寡核苷酸的寡核苷酸，其中含有义启动子的第一链或第二链cDNA与固定的反义启动子寡核苷酸复合以获得固定的转录底物，其被用以获得对应于靶核酸的转录产物。反义启动子寡核苷酸的固定使得利用测量棒(dipsticks)、阵列等的方法和测定成为可能。使用固定的环形或线性转录底物检测对应于靶序列的转录产物的方法分别示于图4和图5。如果转录底物是通过使用有义启动子引物引发第一链cDNA的合成并使用靶核酸作为模板获得的，则该转录底物的转录产生有义转录产物。然而，在本发明的有些实施方案中，获得了反义转录产物。用于获得反义转录产物的一个方法示于图6。简要地，该法使用包含反义启动子序列的引物以引发第一链cDNA的合成。然后，在通过连接而环化第一链cDNA之后，利用链置换引物和链置换DNA聚合酶通过滚环复制获得多联体第二链cDNA。该第二链cDNA包含有义启动子序列。反义启动子寡核苷酸与有义启动子序列的退火允许转录就靶核酸的靶序列而言的反义转录产物。在另一个实施方案中(未图解说明)，根据本发明使用有义启动子引物获得用于合成反义转录产物的转录底物。在本发明的这些实施方案中，与包含靶序列的靶核酸互补的第一链cDNA的合成是利用缺乏启动子序列的引物进行的。如果第一链cDNA的序列已知，则可使用在其3′-端具有与第一链cDNA的特定3′序列互补的序列的有义启动子引物来引发第二链cDNA的合成。备选地，第一链cDNA可“加尾”，并利用诸如本领域公知的或如本文所述的那些方法在该第一链cDNA的3′-端添加与靶序列并不互补的附加序列(如，美国专利No.5,962,272以及Schmidt，WM和Mueller，MW，Nucleic Acids Res.，27e31，1999。添加在第一链cDNA的3′-端的附加序列可作为用于本发明的有义启动子引物退火的独特引发位点。用于结合有义启动子引物的尾巴和/或附加序列是尤为有用的，如果第一链cDNA 3′-部分的序列未知、或者利用有义启动子引物引发构成靶核酸的多种靶序列的合成的话(如，引发对应于样品中实质上所有mRNA分子的第一链cDNA的合成)。使用第一链cDNA作为模板(包括尾巴或附加序列，若存在的话)的有义启动子引物的引物延伸导致合成了含有义启动子的第二链cDNA，通过使用连接酶在连接条件下连接，其可用以获得含有义启动子的环形第二链cDNA。然后，通过使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第二链cDNA退火，可获得本发明的环形转录底物。该环形转录底物可利用本文所述的方法线性化，以获得线性转录底物。备选地，可线性化含有义启动子的环形第二链cDNA，然后与反义启动子寡核苷酸退火，以获得线性转录底物。所得环形或线性转录底物的转录产生就起始靶核酸而言为反义转录产物的转录产物。而本发明的另一方面是用于检测和/或定量任何类型的被分析物的信号传递系统，不受限制地包括蛋白、碳水化合物、核酸或其它被分析物。本发明这方面的实施方案使用信号探针(SignalProbes)，包括RCT信号探针或LINT信号探针，其包含连接于信号模板3′-端的有义启动子，以检测和/或定量ABS-oligo，所述ABS-oligo包含与含有反义启动子序列的寡核苷酸相连接的被分析物结合物质。信号探针-ABS-oligo的转录指示着样品中被分析物的存在和/或数量。在本发明的这个方面，模板序列不是通过复制样品中的靶序列获得的。相反，由RNA聚合酶转录以检测和/或定量被分析物的模板作为被分析物结合物质以及被分析物的“信号”使用。本发明使用信号探针的实施方案使得简单测定和方法(诸如但不限于图7和8中举例说明的那些)能够实现。
附图的简要说明如下附图构成本说明书的一部分，并为进一步演示本发明的某些方面而包含在内。通过参照一个或多个这些附图、结合文中提供的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。图1--本发明使用有义启动子引物获得环形转录底物的图2--本发明用于通过使含有义启动子的环形第一链cDNA线性化、并将其与反义启动子寡核苷酸复合而获得线性转录底物的实施方案的示意图。图3--使用具有转录终止序列的有义启动子引物以获得环形转录底物、而后者被用以获得附加转录产物的方法或测定的实施方案的示意图。所述测定能够以逐步或连续的方式进行。图4--用于检测对应于样品中靶核酸的靶序列的转录产物的测定法的示意图。在该例中，含有义启动子的第一链cDNA与固定在固相支持物如测量棒或珠子上的反义启动子序列退火。所得的固定化环形转录底物通过滚环转录进行转录，且转录产物利用分子信标检测。图5--使用通过线性化含有义启动子的环形第一链cDNA并与固定在固相支持物上的反义启动子寡核苷酸复合制备的线性转录底物来制备对应于靶核酸中靶序列的转录产物的测定法的示意图。转录产物可通过任何本领域公知的多种方法检测。图6--使用反义启动子引物的实施方案。启动子引物的引物延伸和第一链cDNA的连接制备出含反义启动子的环形第一链cDNA，其可作滚环复制的模板用，其产物为含有义启动子的线性第二链cDNA。反义启动子寡核苷酸的退火制备出多联体线性转录底物，其用于制备转录产物。图7--利用包含其上连接有含反义启动子序列的多核苷酸的二抗的被分析物结合物质，使用RCT信号探针检测被分析物的测定法的示意图。反义启动子序列与RCT信号探针的有义启动子复合，由此产生底物，用于通过识别此双链启动子并在转录条件下由此起始滚环转录的RNA聚合酶进行转录。在该例中，利用分子信标检测转录产物，其指示着被分析物的存在。如果用具有已知量的被分析物的对照进行，则也可确定被分析物的水平。图8--利用包含其上连接有含反义启动子序列的多核苷酸的二抗的被分析物结合物质，使用LINT信号探针检测、并在合适的条件下定量样品中的被分析物的方法的实施方案。在该实施方案中，反义启动子序列与LINT信号探针的有义启动子复合，由此产生底物，用于通过识别此双链启动子并在转录条件下由此起始线性失控转录(run-off transcription)的RNA聚合酶进行转录。转录产物可通过任何本领域公知的多种方法检测。
发明详述本发明涉及用于合成对应于样品中或来自样品的一个或多个靶核酸序列的RNA的新的方法、组合物和试剂盒。靶序列可包括含任何来源的RNA或DNA的一个或多个靶核酸的至少一部分。作为举例但并非限制，利用本发明的方法所转录的靶核酸序列可包括对应于样品中一个到基本上所有mRNA分子的第一链cDNA。备选地，所转录的靶核酸序列可包括特定生物体基因组DNA中的特定序列。本发明通过提供获得包含可操作地连接于用于转录的单链模板的双链启动子的环形DNA转录底物的方法，克服了本领域的缺陷，并提供独特体系以合成具有期望序列的RNAs。环形转录底物可用以合成RNA，作为探针使用阵列或微阵列进行表达研究、用于RNase保护研究、用于原位杂交研究、用于Southern和Northern印迹分析、用于合成明确的RNA:DNA杂交体、用于RNA干涉(RNA interference)、用于体外翻译、用于微注射或用于核酸扩增。本发明也允许合成用于这些或其它应用的衍生化RNA。一般而言，设想本文所述的RNA或转录产物探针将可作为试剂在液相杂交中、以及在采用固相的实施方案中用于检测相应基因的表达。在涉及固相的实施方案中，将测试DNA(或RNA)吸附或以其它方式固定到所选择的基质或表面上。然后使该固定了的单链核酸与所选择的探针在期望条件下进行杂交。所选择的条件将取决于以所需的特定标准为基础的特定环境(例如，取决于G+C含量、靶核酸类型、核酸来源、杂交探针大小等)。在洗涤杂交表面以除去非特异性结合的探针分子之后，利用标记检测、甚至定量杂交。
用于制备对应于靶核酸序列的转录产物的方法本发明的一个方面包括用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括(a)获得靶核酸；(b)获得有义启动子引物，该有义启动子引物包括含有义转录启动子的5′-端部分以及互补于靶的3′-端部分；(c)使有义启动子引物与靶核酸退火，以形成靶核酸-有义启动子引物复合体；(d)使靶核酸-有义启动子引物复合体与DNA聚合酶在聚合反应条件下接触，以获得互补于靶序列的第一链cDNA；(e)获得第一链cDNA；(f)在连接条件下连接第一链cDNA，以获得含有义启动子的环形第一链cDNA；(g)获得反义启动子寡核苷酸(oligo)；(h)使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链cDNA退火，以获得环形转录底物；(i)获得环形转录底物；和(j)使环形转录底物与RNA聚合酶在转录条件下接触，其中获得转录产物。本发明包括使用任何利用环形转录底物合成转录产物的聚合酶，该环形转录底物是通过环化经由有义启动子引物在靶序列上的引物延伸所获得的引物延伸产物而获得的，该有义启动子引物在其5′-端部分包括编码转录启动子有义链的序列，且在其3′-端部分包括靶互补序列，并且其中通过将有义启动子序列与引物延伸产物的3′-端连接，并将所得的环形ssDNA与包含了互补于其中的有义启动子序列的反义启动子序列的寡核苷酸复合(除了启动子引物中使用单链有义假启动子(pseudopromoter)替换双链启动子的有义链)，而使有义启动子可操作地或者功能性地结合于或连接于包含靶序列的引物延伸产物。从而，本发明的方法可使用已知或能够获得对其而言合适的有义启动子序列的任何RNA聚合酶。本发明优选的启动子包括用于T7-型RNA聚合酶的启动子。“T7-型RNAPs”意指T7、T3、phi、phiIIH、W31、gh1、Y、A1122、SP6和线粒体RNAPs、以及这些RNAPs的突变形式(Sousa等，美国专利No.5,849,546；Padilla R和Sousa，R，Nucleic Acids Res.，15el38，2002；Sousa，R和Mukheriee，S，Prog Nucleic Acid ResMol Biol.，731-41，2003)，例如但不限于T7 RNAP Y639F突变酶、T3 RNAP Y573F突变酶、SP6 RNAP Y631F突变酶、在639和784位上都具有改变的氨基酸的T7 RNAP、在573和785位上都具有改变的氨基酸的T3 RNAP、或在631和779位上都具有改变的氨基酸的SP6 RNAP、或者其它突变形式的在本发明的方法中有作用的RNAP。本发明的有义启动子也包括为RNA聚合酶(RNAP)所识别从而可在本发明的方法中发挥作用的单链假启动子或合成启动子。本发明的“假启动子”或“合成启动子”可以是任何经鉴定和/或经选择有作为可用来通过特异性结合该启动子的RNA聚合酶进行体外转录的启动子之功能、且在转录反应中作为RNA聚合酶的启动子发挥作用的单链序列。也就是说，被RNA聚合酶所识别的单链假启动子或合成启动子不适合用于本发明使用信号探针的方面，特此并入作为参考。在一些实施方案中也可使用噬菌体N4 vRNAP的单链启动子，在该情况下，在方法或试剂盒中使用野生型或突变形式的N4 mini-vRNAP，两者都在本文别处讨论。如果假启动子或合成启动子作为有义启动子用于本发明的方法或测定法之中，则该法中使用用于鉴定和/或选择该假启动子或合成启动子的RNA聚合酶。作为举例但并非限制，包含ssDNA假启动子的有义启动子包括可如Ohmichi等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9954-59，2002，特此并入作为参考)所述获得，并用于本发明使用大肠杆菌RNAP或T7型噬菌体RNAP的方法或测定法的有义启动子引物之中。如果单链假启动子或合成启动子用于本发明的有义启动子引物中，则利用本发明的方法获得的含有义启动子的环形单链cDNA包括不与反义启动子寡核苷酸退火的环形转录底物。因此，在这些实施方案中无需反义启动子寡核苷酸。噬菌体N4 vRNAP的单链启动子也可用于一些实施方案之中，在这种情况下，该法或试剂盒中使用野生型或突变形式的N4 mini-vRNAP，两者都在文中别处讨论，并且在这些实施方案中无需反义启动子寡核苷酸。
A.定义和一般方法1.转录产物如本文所用的术语“转录产物”可包括RNA，或者考虑到本发明某些聚合酶，包括但不限于T7 RNAP Y639F突变酶或在639和784位都具有改变的氨基酸的T7 RNAP突变酶(Sousa等，美国专利No.5,849,546；Pailla，R和Sousa，R.Nucleic Acids Res.，15el382002；Sousa，R和Mukher jee，S，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.，731-41，2003)，使用碱基取代的核糖核苷酸如5-烯丙基氨基-UTP，或者非规则核苷酸底物如dNTPs，或者2′-取代的2′-脱氧核糖核苷酸，例如但不限于2′-氟、2′-氨基、2′-甲氧基或2′-叠氮基取代的2′-脱氧核糖核苷酸的能力，除RNA之外，转录产物可包括DNA，或修饰的DNA，或修饰的RNA，或其混合物。转录产物并非必然地与靶序列具有完美的序列互补性或同一性。例如，转录产物可包括核苷酸类似物如脱氧肌苷或脱氧尿苷，有目的的序列改变如通过包含有可与靶序列杂交但并不互补的序列的引物而引入的序列改变，和/或在转录期间发生的序列差错。同样，出于多种原因，本发明的核酸或多核苷酸可能包括一个或多个修饰的核酸碱基、糖部分或核苷间键。作为举例，使用含修饰碱基、糖部分或核苷间键的核酸或多核苷酸的一些原因包括但不限于(1)修饰Tm；(2)改变多核苷酸对一种或多种核酸酶的敏感性；(3)提供用于连接标记的部分；(4)提供标记或标记的淬灭剂；或(5)提供用于附着到处于溶液之中或结合在表面上的另一分子上的部分如生物素。
2.样品/靶/靶核酸/靶序列根据本发明的“样品”或“生物学样品”以其最广泛的含义使用。样品是由生物或环境来源收集的或与之相关的任何标本，或者其包括或包含生物学材料，不论其是整体还是部分，并且不论是活的还是死的。生物学样品可能是植物或动物，包括人，体液(如血液或血液级分、尿液、唾液、痰、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴液或精液)，拭样(如口腔或子宫颈试样)，固体(如粪便)，微生物培养物(如细菌、真菌、寄生虫、原生动物或病毒的平板或液体培养物)，或者细胞或组织(如新鲜或石蜡包埋的组织切片、毛囊、小鼠尾巴剪碎物、叶或人、动物、植物、微生物、病毒或其它细胞、组织、器官或完整生物体的部分，包括亚细胞级分或细胞提取物)，还有液体和固体食物以及饲料产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉类及肉类副产品和废物。生物学样品可从所有的家禽植物或动物以及野生动物或植物各科中获得。环境样品包括环境材料如表面物质、土壤、水、空气或工业样品，以及由食品和乳制品加工仪器、器械、设备、器具、可弃型及非可弃型物件获得的样品。这些例子不应解释为限制适用于本发明的样品类型。简言之，样品包括来自含有或可能含有天然存在的靶核酸的任何来源的标本。对其实施本发明的测定法的样品可以是未加工的生物学材料标本，如血清或其它体液、组织培养基或食物原料。更典型地，对作为通过各种处理以除去将会干扰靶核酸或其扩增产物检测的物质而来源于未加工标本的加工标本的样品实施所述方法。用于加工粗样品以获得更适合用于本发明的测定法的样品的方法是本领域所熟知的。“被分析物”是指在测定中待确定其在样品中的存在、浓度或含量的物质。被分析物有时被称之为测定的“靶物质”或“靶分子”或“靶被分析物”。被分析物也可被更具体地称呼。本发明的实施方案涉及作为天然存在的核酸的被分析物，且该分析物可被称之为“靶核酸”或“靶多核苷酸”或“靶寡核苷酸”或“靶序列”，视特定的情形而定。本发明的组合物、试剂盒或方法可用于“被分析物特异性试剂”以检测样品中的靶核酸被分析物或另一被分析物或被分析物结合物。就本发明而言，被分析物常与当且仅当存在被分析时存在于样品中的生物学实体有关。此类生物学实体包括类病毒(例如，被分析物为核酸或其片断)、病毒(例如，被分析物为病毒基因组或病毒基因组的片断)、其它微生物(例如，被分析物为该微生物基因组或RNA的片断)、异常细胞如癌细胞(例如，被分析物为癌基因)、或者异常基因(例如，被分析物为包括使得该基因异常的改变的碱基的基因片断，或由于自异常基因转录而包括改变的碱基的信使RNA片断)。根据被分析物的描述，显然本发明具有广泛的适用性，包括在通常采用核酸探针进行杂交测定的应用中。从而，在其它应用中，本发明可用于诊断植物和动物包括人的疾病，以及对产品如食品、血液和组织培养物进行污染物测试。本发明的“靶”是作为实施生物学测定或诊断性测定的原因或基础的生物学有机体或材料。作为举例但并非限制，可实施本发明的测定法以检测作为可指示既有疾病或将来疾病风险的病毒的靶(如据信导致AIDS的HIV)，或者作为可指示抗生素抗性的基因的靶(如传染性病原细菌中的抗生素抗性基因)，或者作为若不存在则可能指示疾病的基因的靶(例如，必需基因的缺失)。在根据本发明的测定法的形成中，重要的是鉴定产生足够特异、精确和灵敏的测定结果以有意义地与靶的存在和状况关联起来的靶被分析物。作为“靶多核苷酸”或“靶核酸”的靶被分析物包括至少一种核酸分子或至少一种核酸分子的一部分，无论所述分子是DNA、RNA还是DNA和RNA兼而有之，并且其中每一个分子至少部分地具有明确的核苷酸序列。靶多核苷酸也可与测定中所用的其它分子具有至少部分的互补性，所述其它分子例如但不限于引物、剪接模板寡核苷酸、连接夹板寡核苷酸(ligation splint oligos)、俘获探针或检测探针。靶多核苷酸可以是单链或双链的。本发明的靶多核苷酸可以是任意长度的。不过，其必需包括具有足够的序列特异性和长度的多核苷酸序列，以便可用于其期望目的。作为举例但并非限制，用序列互补的检测探针待检测的靶核酸必须具有具备足够的序列特异性和长度的序列，以便在其中不是靶多核苷酸的序列并不杂交的测定杂交条件下仍为检测探针所杂交。具有对本发明的测定法而言足够的序列特异性和长度的靶多核苷酸可利用本领域技术人员公知的方法，通过比较和分析靶及可能存在于样品中的其它序列已知的核酸序列而鉴定。例如，许多病毒、细菌、人以及许多其它生物学有机体的核酸(如基因和信使RNA)的序列可利用公共或私人的数据库检索，并且序列比较、折叠结构以及杂交熔点温度(即Tm)可利用本领域技术人员公知的计算机软件获得。术语“靶核酸来源”或“靶多核苷酸来源”是指任何含有天然存在的靶核酸RNA或DNA的样品。从而，本发明的方法可对来自多种来源的核酸实施，包括未纯化的核酸或利用任何本领域合适的方法纯化的核酸，所述方法例如但不限于各种“离心(spin)”柱，阳离子膜及滤膜，或者盐析技术，对此广泛多样的产品可由商业上获得(如MasterPureTMDNA&RNAPurification Kits from Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)。本发明的方法也可对分离自类病毒、病毒或标本细胞和如Gillespie和Spiegelman(J.Mol.Biol.12829-842，1965)所述沉积到固相支持物上的核酸实施，所述支持物包括测试棒上的固相支持物和微量滴定板孔的内壁。该法也可用分离自标本并通过“斑点”印迹(Kafatos，等，Nucl.Acids Res.71541-1552，1979)；White和Bancroft，J.Biol.Chem.2578569-8572，1982)、Southern印迹(Southern，E.，J.Mol.Biol.98503-517，1975)、″northern″印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA775201-5205，1980)以及电印迹(Stellwag和Dahlberg，Nucl.Acids Res.8299-317，1980)沉积到固相支持物上的核酸进行。该法也可对点样到膜上、载片上、或芯片上作为阵列或微阵列的核酸实施，或者可实施该法以制备探针用于制备探针用于根据与点样到这些表面之一或在其上合成的核酸的杂交而检测或定量样品中存在的核酸。标本的核酸也可通过应用于水相杂交(Britten和Kohne，Science161527-540，1968)以及水/有机相间杂交(Kohne等，Biochemistry165329-5341，1977)的本发明的方法测定。水/有机相间杂交具有以极快的动力学进行的优势，但当有机相可溶的连接部分如生物素结合于核酸亲和分子时，并不合适。本发明的方法也可对通过扩增天然存在的靶核酸所获得的扩增产物进行，条件是只有样品中存在靶核酸时，靶核酸的靶序列才能由所用的方法扩增。合适的扩增方法包括但不限于PCR、RT-PCR、NASBA、TMA、3SR、LCR、LLA、SDA(如Walker等，Nucleic Acids Res.201691-1696，1992)、RCA、多重置换扩增(Molecular Staging)、ICANTM或UCANTM(TAKARA)、环-AMP(EIKEN)以及SPIATM或Ribo-SPIATM(NuGEN Technologies)。使用是另一扩增法产物的核酸作为本发明测定法的靶核酸存在多种原因，例如但不限于为获得更为灵敏的靶检测、更大的特异性，或者减少获得测定结果所需的时间。本发明的方法也可对分离自标本并通过斑点印迹沉积到固相支持物上、或通过吸附到微量滴定板孔的壁上、或测试棒的固相支持物材料上、膜上、载片上或芯片如阵列或微阵列上的核酸实施。更进一步，本发明的方法适用于检测来自标本如固定的或石蜡包埋的切片、或来自固定在固相支持物上的微生物如复制平板的细菌或酵母的全细胞中的细胞核酸。在有些实施方案中，本发明的方法可用于制备对应于靶序列转录产物，以检测活细胞中的靶核酸。靶核酸可以是任何来源的纯化或非纯化形式的核酸。例如，包含DNA的靶核酸可以是dsDNA或ssDNA如线粒体DNA、叶绿体DNA、染色体、质粒或其它附加体、细菌、酵母、病毒、类病毒、支原体、霉菌或其它微生物的基因组、或者真菌、植物、动物或人的基因组。包含RNA的靶核酸可以是tRNA、mRNA、rRNA、线粒体RNA、叶绿体RNA、微小RNA、或其它RNA分子，但不限于此。靶核酸叶可以是DNA和RNA的混合物，包括但不限于上述核酸或其片断的混合物或DNA-RNA杂交体。靶核酸可以仅仅是复杂混合物如生物学样品的一小部分，并且可通过本领域公知的操作由各种生物材料获得。众多用于纯化特定靶核酸的方法是本领域公知的，如果进一步纯化是必要的话。术语“靶核酸序列”或“靶序列”是指待转录以制备转录产物的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包含一个或多个靶核酸内的一个或多个序列。靶序列也可以具有在本发明的有些实施方案的过程中添加以促进靶序列与用于特定目的的另一多核苷酸连接的“复合序列(compleing sequences)”。例如，复合序列可提供互补序列，本发明的方法中所用的寡核苷酸(如引物和/或剪接模板)可与该互补序列退火或复合。复合序列通常包含通过手段诸如本文所讨论的那些手段添加的“尾”序列，包括但不限于通过在mRNA的帽子结构处停顿的反转录酶向第一链cDNA中非依赖模板地添加dCMP(存在或不存在锰阳离子时)和/或利用TdT可控地核糖核苷酸加尾。如果在本发明的方法的过程中向靶序列添加复合序列，期望选择不影响利用所得的包含靶序列的转录底物所制备的转录产物的特异性的复合序列。靶核酸可以是单链或双链RNA、DNA或混合的RNA和DNA。靶核酸有时更具体地以核酸类型称呼。作为举例但并非限制，靶核酸可以是“靶RNA”或“RNA靶”或“靶mRNA”或者“靶DNA”或“DNA靶”。类似地，靶序列可被称之为“靶RNA序列”或“RNA靶序列”，或称之为“靶mRNA序列”或者“靶DNA序列”等。在有些实施方案中，靶序列包含一个或多个完整的靶核酸，例如特定样品中的一个或所有全长mRNA分子。在其它实施方案中，靶序列仅包含一个或多个靶核酸分子的一部分。当靶核酸最初为单链时，术语“靶序列”也意指互补于该“靶序列”的序列。当“靶序列”最初为双链时，术语“靶序列”可以指该序列的有义链或其互补物，或两者，视方法的期望目的而定。就其实际序列而言，靶序列可以是已知或未知的。在有些情况下，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其变型是可互换使用的。
3.cDNA/第一链cDNA/第二链cDNA/反转录酶/RNaseH在本发明有些重要的实施方案中，转录底物的靶序列包括cDNA。一般而言，“cDNA”是指使用DNA聚合酶(包括但不限于RNA-依赖性DNA聚合酶或反转录酶)利用至少部分靶核酸作为模板通过引物延伸合成的“互补DNA”，且该cDNA与至少一部分靶核酸模板“同源”或“碱基配对”。在本发明作为优选实施方案的有些实施方案中，cDNA是使用反转录酶和由生物学样品获得的包含信使RNA(mRNA)的靶核酸作为模板通过反转录引物延伸获得的，且该cDNA与mRNA同源。本领域与由mRNA制备cDNA有关的方法包括合成包含第一链cDNA和第二链cDNA的双链cDNA，它们通常是利用不同的方法相继合成的。然而在本文，即使当本发明的方法导致合成仅一条互补于mRNA的DNA链时，我们也常称之为“第一链cDNA”(即术语“第一链cDNA”并不旨在暗示也存在第二链cDNA)。在有些实施方案中，术语“第一链cDNA”或“cDNA”是指通过反转录任何RNA分子获得的单链DNA分子，即使其并非mRNA。在其它实施方案中，术语“第一链cDNA”或“cDNA”是指使用包含单链DNA或双链DNA的一条链的靶核酸作为模板进行DNA聚合反应通过引物延伸获得的单链DNA分子。如果本发明的启动子引物用于靶序列的引物延伸，则启动子序列位于所得第一链cDNA的5′-端。即使启动子引物的启动子序列为有义启动子序列，它也并非如通过与反义启动子寡核苷酸复合而获得功能性双链启动子所需的那样可操作地连接于靶序列的3′-端。因此，通过启动子引物的引物延伸所获得的产物在文中简单地称之为“第一链cDNA”或称之为“第一链cDNA引物延伸产物”或称之为“引物延伸产物”。然而，一旦该启动子序列连接至通过引物延伸获得的靶序列的3′-端，则所得的环形分子在文中称之为“含有义启动子的环形第一链cDNA”。类似地，由含有义启动子的环形第一链cDNA线性化以获得在靶序列3′-端具有有义启动子的线性分子所得的分子在文中称之为“含有义启动子的线性第一链cDNA”。这些指明了相应环形或线性第一链cDNA中靶序列3′-端有义启动子的存在的术语如此使用，从而使读者将会理解，环形或线性转录底物分别地可通过使反义启动子寡核苷酸与相应的含有义启动子的环形或线性第一链cDNA复合(或退火)获得。基于对本说明书的阅读，读者将会理解，转录底物不能够通过使有义启动子寡核苷酸与“含反义启动子的第一链cDNA”退火获得(因为有义启动子序列必需连接在模板链上靶序列的3′-端)。也就是说，功能性双链转录启动子只能通过使反义启动子寡核苷酸与模板链上的有义启动子复合获得。因此，读者将会理解，环化含反义启动子的第一链cDNA将不会通过与有义启动子寡核苷酸复合产生转录底物。然而，含反义启动子的环形第一链cDNA的滚环DNA复制产生多联体“含有义启动子的线性第一链cDNA”，通过与反义启动子寡核苷酸复合，其可用于获得多联体线性转录底物。转录产物就靶核酸而言为反义转录产物。“RNA-依赖性DNA聚合酶”或“反转录酶”为能够由RNA模板合成互补DNA拷贝(″cDNA″)的酶。所有已知的反转录酶也具有由DNA模板制备互补DNA拷贝的能力；从而，它们既是RNA-又是DNA-依赖性的DNA聚合酶。“模板”是被核酸聚合酶复制的核酸分子。如果核酸包含两条链(即为“双链”)，并且有时候即使核酸仅包含一条链(即为“单链”)，被复制的那条链为“模板”或“模板链”。所合成的拷贝与模板互补。RNA和DNA都总是以5′-至-3′的方向合成的，并且核酸双链体的两条链总是如此排列，从而两条链的5′端处于双链体相反的两端(而且必然地，3′端亦是如此)。RNA和DNA模板都需要引物以通过DNA聚合酶起始合成。可用于本发明的方法之中的反转录酶的实例包括但不限于AMV反转录酶，MMLV反转录酶，Tth DNA聚合酶，rBst DNA聚合酶大片段，也称之为IsoThermTMDNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI，USA)，以及BcaBESTTMDNA聚合酶(Takara Shuzo Co，Kyoto，Japan)。在有些情况下，使用突变形式的反转录酶如缺乏RNase H活性的MMLV反转录酶。又在其它实施方案中，IsoThermTMDNA聚合酶最为合适。在其它实施方案中，优选野生型酶。一般而言，就所用的反转录酶而言，本发明不受限制，只要它能发挥作用用于其期望目的。在本发明其中使用反转录酶和互补并退火于包含靶核酸的3′-端的引物合成包含ssDNA靶序列的第一链cDNA来获得转录底物的实施方案中，引物可包含寡聚(dT)n或修饰的寡聚(dT)n，或者它可包含寡聚d(T)nX锚定引物，其中“X”包含针对特定mRNA的特异性碱基或用于引发样品中所有mRNA分子的随机核苷酸(即用所有四种核苷酸的混合物合成)，或者引物可包含具有与特定mRNA分子的序列互补的特异性序列的寡核苷酸，或者在有些情况下，它可包含具有随机序列的寡核苷酸(即对引物的每一个位置，都用所有四种核苷酸的混合物合成)。如果靶核酸为RNA如mRNA，并期望在利用有义启动子引物反转录之后除去与第一链cDNA退火的RNA，这可通过数种手段之一实现。作为举例但并非限制，RNA可通过RNase H处理、通过碱如但不限于氢氧化钠或氢氧化钾处理除去，或者RNA可通过热变性而从杂交体上除去。在有些应用的优选实施方案中，RNA通过用于反转录(或引物延伸)的反转录酶的RNase H活性除去，反转录酶例如但不限于MMLV反转录酶。备选地，在有些实施方案中，通过在本发明的单链结合(SSB)蛋白如但不限于大肠杆菌SSB(EcoSSB)的存在下实施反转录或温育杂交体，而使RNA从第一链cDNA上解离下来。在本发明的有些实施方案中，特别是在用于获得附加轮的转录产物的实施方案中，也使用单独的RNase H酶，不论所述反转录酶是否具有RNase H活性。如果在用于获得多轮转录的实施方案中期望RNase H活性，但不添加单独的RNase H酶，则可使用MMLV反转录酶(野生型RNase H-阳性)。在有些用于获得多轮转录、其中也添加单独的RNase H酶的实施方案中，可使用AMV反转录酶。Kacian等(美国专利No.5,399,491)公开了与向转录介导的、使用MMLV或AMV反转录酶的扩增测定中添加不同含量的单独RNase H酶的效应有关的信息，特此将该文献和信息并入作为参考，并构成本书面公开的一部分。“核糖核酸酶H”或“RNase H”为降解RNA:DNA双链体中的RNA部分的酶。RNase H可以是核酸内切酶或核酸外切酶。除其聚合酶活性之外，多数野生型反转录酶具有RNase H活性。不过，存在无相伴的聚合酶活性的其它来源的RNase H。降解可能导致RNA从RNA:DNA复合体中分离。备选地，RNase H可简单地在多个位置上切割RNA，从而部分RNA熔掉，或者允许酶展旋部分RNA。当用在本发明的实施方案中时，能够使用的RNaseH酶包括但不限于大肠杆菌RNase H、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)RNase H以及黄色栖热菌(Thermus flavus)RNase H(美国专利No.5,268,289、5,459,055和5,500,370，特此并入作为参考)。后两种酶是热稳定的，因而在反应中维持更为一致的活性，并且更易于贮存和运输，在多数使用单独的RNase H酶的实施方案中是优选的。其它能够使用的RNase H酶是由Sagawa等在PCT专利
发明者G·A·达尔, J·J·詹得里萨克 申请人:震源技术公司