专利名称：用于在植物细胞中表达dna序列的人工启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，更具体而言涉及植物基因工程。具体地本发明提供了嵌合DNA构建体，与其融合的任何核苷酸序列在双子叶和单子叶植物细胞中均显示高转录/翻译活性，可以获得目的基因和DNA序列较高表达水平的转基因植物。
现有技术已证明植物基因工程是在新生物技术产品的基础研究和商业化生产中具有极大价值的技术(Hammond J.Curr.Top.Microbiol.Immunol 1999，2401-19；Simoens C.和Van Montagu M.ReproductionUpdate 1995，1523-542)。
选择启动子信号，确保通过分子生物学技术的遗传操作而引入植物的基因或DNA序列以足够强度及时间或空间特异性表达，对于成功进行植物基因工程极其重要。这就是为什么在过去二十年间，大量努力致力于探求能够确保所需每一转基因表达的启动子和信号。为此，评价了不同来源(植物、病毒、Ti或Ri土壤农杆菌或嵌合)启动子并用于转基因植物生产。
广泛用于植物遗传操作的组成型启动子有花椰菜花叶病毒(caMV)35S ARN启动子(Odell J.T；Nagy F；Chua N.H.Na ture 1985，313810-812)；来自根瘤土壤杆菌Ti质粒的胭脂氨酸合成酶基因(nos)启动子(An G；Costa M.A；Mitra A；Ha S；Marton L.Plant Phisiol.1986，88547-552)，稻肌动蛋白-1基因启动子(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171)以及玉米遍在蛋白-1基因启动子(Christensen A.H；Sharrock R.A；Quail P.H.Plant Mo1.Biol.1992，18675-689)。然而，这些天然表达系统均有局限，主要因其不能在任意种类植物中达到足够高的表达水平；例如，启动子表达水平在双子叶植物细胞中低，而在单子叶植物几乎检测不到，最广泛使用的启动子CaMV 35S在烟草细胞中更强于单子叶植物(Topfer R；Maas C；Horicke-Grandpierre C；Schell J；Steinbiss H.H.MethodsEnzymol.1993，21767-78；Mitsuhara I；Ugaki M；Hirochika H；Ohshima M；Murakami T；Gotoh Y等人Plant Cell Physiol.1996，3749-59)。类似地，稻肌动蛋白-1和玉米遍在蛋白-1启动子在单子叶植物细胞中极有效促进其下游基因的转录，但其启动子活性在烟草细胞中很低(Schledzewski K；Mendel R.R.Transgenic Research1994，3249-255)。
为提高转基因植物中异源蛋白质表达水平，设计了多种天然启动子与转录或翻译增强子相结合的嵌合启动子。在这些增强子元件中，我们可以提及烟草花叶病毒(TMV)的ω翻译增强子(Gallie D.R；SleatD.E；Watts J.W；Turner P.C；Wilson T.M.A.Nucleic Acids Res.1987，153257-3273)、烟草蚀纹病毒(TEV)翻译增强子(CarringtonJ.C；Freed D.D.J.Virol.1990，641590-1597)、章鱼氨酸合酶(Fromm H；Katagiri F；Chua N.H.Plant Cell 1989，1977-984)、甘露氨酸合酶(Comai L；Moran P；Maslyar D.Plant Mol Biol.1990，15373-381)的启动子转录增强子和CaMV 35S启动子(Kay R；Chan A；Daly M；McPherson J.Science 1987，2361299-1302)；以及天然外显子和内含子，例如玉米乙醇脱氢酶内含子1(Callis J；Fromm M；Walbot V.Genes Devel.1987，11183-1200；Last D.I；BrettellR.I.S；Chamberlaine D.A；Chaudhury A.M；Larkin P.J等人TheorAppl.Gen.1991，81581-588)、玉米蔗糖合酶的第一外显子/内含子(Maas C；Laufs J；Grant S；Korfhage C；Werr W.Plant Mol.Biol.1991，16199-207)、稻肌动蛋白-1基因的第一外显子/内含子(McElroy D；Blowers A.D；Jenes B；Wu R.Mol.Gen.Genet.1991，231150-160)等。这样得到象2×35S、Mac、Emu等(EP0459643；EP0651812)主要在特定种类的双子叶或单子叶植物细胞中的强启动子。(Schledzewski K；Mendel R.R.Transgenic Research 1994，3249-255)。
开发可用于在双子叶和单子叶植物细胞中表达基因的强启动子一直是很多实验室的相关课题，不仅因其所代表的科学挑战或拥有可转化不同种类植物的独特的遗传构建体所带来的便利，而且为了拥有更易于生物技术产品生产和商品化的自己的表达系统。专利申请WO9943838所要求的合成启动子要求一条从TATA盒直到转录起始位点的序列，GC含量较高(64％或更高)，其5’端融合了来自35S、玉米遍在蛋白-1以及章鱼氨酸合酶启动子的转录增强子。另一方面，为了寻找不仅在双子叶和单子叶植物中表达、也可避免序列同源性依赖性基因沉默(Park Y.D；Papp I；Moscone E；Iglesias V；Vaucheret H；Matzke A；Matzke M.A.Plant J.1996，9183-194)，专利申请WO0058485要求来源于两种植物病毒基因组鸭跖草黄斑驳病毒(Commelina Yellow Mottle Virus，CoYMV)和木薯叶脉花叶病毒(Cassava Vein Mossaic Virus，CsVMV)的序列组合以及35S启动子增强子序列的人工启动子。
可使不同遗传元件增强核苷酸序列转录或翻译的机理尚不清楚。例如，已报道许多RNA病毒的前导序列可以增强不同信使RNA(mRNA)的翻译，而与5′端融合的帽(m7G(5′)PPP(5′)N)的存在无关(SleatD.E；Wilson T.M.A.1992.Plant virus genomes as sources of novelfunctions for genetic manipulations.InT.M.A.Wilson & J.W.Davies(Eds)，Genetic engineering with plant viruses.CRC Press，Inc.p.55-113；Gallie D.R；Sleat D.E；Watts J.W；Turner P.C；Wilson T.M.Nucleic Acids Res.1987，158693-8711)。然而，除所有这些病毒前导序列的RNA二级结构不复杂之外，尚未确定其核苷酸序列间负责翻译增强子特性的另一共同元件。
特别地，已报道TMVω片段的翻译增强是由于在其序列中重复的至少一个拷贝的八聚物ACATTTAC以及一个据认为是重要基序的25碱基(CAA)n区(两个拷贝的(CAA)n区足以赋予高增强子水平)(GallieD.R；Walbot V.Nucleic Acids Res.1992，204631-4638)。然而，马铃薯X病毒(PVX)前导序列28碱基CA丰富区本身未显示翻译增强子活性(Pooggin M.M；Skryabin K.G.Mol.Gen.Genet.1992，234329-331)，但报道PVX前导序列的CA区存在的CCACC五核苷酸可能与18S rRNA 3′端具有配对相互作用(Tomashevskaya O.L；SolovyevA.G；Karpova O.V；Fedorkin O.N；Rodionova N.P；Morozov S.Y；Atabekov J.G.J.Gen.Virol.1993，742717-2724)。
已确定某些病毒前导序列具有涉及翻译增强子活性的序列元件，诸如香石竹潜隐病毒前导序列如马铃薯病毒S(PVS)中保守的CCTTTAGGTT序列(Turner R；Bate N；Tewell D；Foster G.D.Arch.Virol.1994，134321-333)以及在苜蓿花叶病毒(Alfalfa MosaicVirus，A1MV)RNA3前导序列27碱基重复区中发现的所谓2型内部控制区(ICR2)基序(GGTTCGANTCC)，需要两个以达到理想的翻译水平(vander Vossen E.A.G；Neeleman L；Bol J.F.Nucleic Acids Res.1993，211361-1367)。
对于TEV前导序列，称为CIRE-1和CIRE-2的两个区分别位于28-65和66-118，已被鉴定为负责该148bp前导序列的翻译增强子活性(Niepel M；Gallie D.R.J.Virol.1999，739080-9088)。但并未在CIRE区内确定认为对这些病毒前导序列的增强子活性极为重要的特定元件。
如上所及，天然来源的内含子及其临近序列也已广泛用于增强不同的基因表达系统，特别是当内含子靠近基因5’端时。但据报道，内含子介导的基因表达增强(IME)有赖于内含子来源、外显子的侧翼区以及细胞类型等因素。主要在单子叶植物细胞中观察到强的表达IME，但双子叶植物一般不超过2-5倍。尚未完全揭示IME后的分子机理(Simpson G.G；Filipowicz W.Plant Mol.Biol.1996，321-41；Schuler M.A.1998.Plant pre-MRNA splicing.InJ.Bailey-Serres & D.R.Gallie(Eds)，Alook beyond transcriptionmechanisms determining MRNA stability and trans lation in plants.American Society of Plant Physiologists.P.1-19；Lorkovic Z.J；Kirk D.A.W；Lambermon M.H.L；Filipowicz W.Trends in PlantScience.2000，5160-167)。
观察到的单子叶和双子叶植物细胞间IME表达变化可起因于不同种类植物细胞中前mRNA适当加工所需条件的已知差异。实际上，在单子叶而非双子叶植物细胞中，内含子序列存在富含AU的片段并非为其加工所必需；单子叶细胞可加工高GC含量(超过50％)的内含子及复杂二级结构(发夹-环)，表明双子叶植物细胞不能加工复杂二级结构的内含子(Goodall G.J；Filipowicz W.The EMBO Journal 1991，102635-2644；Lorkovic Z.J；Kirk D.A.W；Lambermon M.H.L；Filipowicz W.Trends in Plant Science.2000，5160-167)。这些原因至少可以部分解释，为什么目前利用IME人工增强核苷酸序列表达的系统具有类型特异性。
发明详述本专利申请提出的表达启动子序列提供了一组不同的特征1)具有普遍功能性，在双子叶及单子叶植物细胞中均有活性，可以获得目的基因和DNA序列高水平表达的任何类型的转基因植物；2)基于人工装配的遗传元件的组合，不仅通过IME提高了mRNA水平，还促进其翻译；3)该启动子中缺少与天然或病毒基因具有同一序列的长DNA片段，最大限度减少了RNA介导的同源基因沉默风险以及因株内(inplanta)同源重组而出现新病毒种或株的可能性；4)从TATA盒到转录起始位点间序列的GC含量不一定要高；5)本启动子序列的多变性可以在其5’端插入转录调节元件，赋予表达的时间、器官或组织特异性；6)包含它的人工遗传元件也可功能性插入在植物细胞中起作用的任何启动子与任何DNA序列之间，以提高其转录/翻译。
对任何类型植物细胞中mRNA累积具有高增强活性的嵌合外显子/内含子/外显子区设计及其与人工翻译增强子的功能性整合，构成了本专利申请的两个基本部分，因为这些元件可使我们在植物细胞中有效表达任何目的DNA序列。
重要的是要清楚，当我们称某区域、分子或DNA序列是人工或嵌合时，我们是指它是经体外设计并合成，因而不是具有同样一级DNA结构的任何遗传元件，尽管其序列的小片段可能具有天然来源。
为设计带有对应的邻近外显子序列、能够促进IME表达的内含子，我们对具有报道转录增强子活性的植物内含子，研究了其共同的序列基序及遗传元件。同时，我们必须解决该内含子不论其GC含量而均能在双子叶和单子叶植物中获得足够及有效加工的挑战。
在比较广泛用作转录增强子启动子的稻肌动蛋白-1、玉米遍在蛋白-1和蔗糖合酶-1的内含子序列时，可以检测它们之中共有及重复的序列基序(
图1)。尚未证明其中任何基序负责这些内含子所致IME基因表达，但这些区域及多种植物启动子TATA盒5’区中的CTCC基序(或其同源序列CTC、TCC和TC)的高度保守水平表明该基序有利于结合可促进RNA聚合酶II活性的转录因子的可能性。同时，第一内含子(仍然是非翻译性mRNA非翻译前导序列的区域)以及具有报道翻译增强子活性的病毒前导序列中富含C和A序列的丰度及保守性，表明此类序列可促进所得mRNA的稳定性及其被翻译的能力。
应当强调，上文所说明的理论均未有完整的科学证明，因而并非显而易见构建包含特定重复序列基序、带有相邻外显子序列的人工内含子能够得到可促进高转录水平及mRNA积累的区域；但我们的工作结果证实了这一点。
根据所述不同内含子(连同其相应外显子)的比较研究，我们决定将富含我们所认定的IME表达相关基序的稻肌动蛋白-1和玉米遍在蛋白-1内含子/外显子序列片段相结合，设计人工外显子/内含子/外显子区。为达此目的，我们必须注意所得人工内含子一定要在双子叶植物细胞中有效加工，才能在这类植物中也发生基因表达增加。尽管如此，我们发现所用作原材料的内含子序列GC含量高、具有大量发夹-环的复杂二级结构、其AG受体3’剪接位点序列有些不同于分支点共有序列，因而这些内含子难以在双子叶植物细胞中加工。
为简化我们设计的外显子/内含子/外显子的二级结构，以便可以在任何类型的植物细胞中加工，我们决定在其序列中做些精确的改变并插入激活加工的UUUUUAU样序列(Gniadkowski M；Hemmings-Mieszczak M；Klahre U；Liu H.X；Filipowicz W.NucleicAcids Res.1996，24619-627)。此外，我们的嵌合序列与第二个外显子融合并插入玉米肌动蛋白-1基因的第二个内含子(IVS2)而利用它在双子叶植物中的有效加工(例如烟草)(Goodall G.J；FilipowiczW.The EMBO Journal 1991，102635-2644)。通过使用PCFOLD 4.0程序的计算方法(Zuker M.Meth.Rnzymology 1989，180262-288)，研究推断的每一人工外显子/内含子/外显子变体二级结构。我们制备的人工外显子/内含子/外显子序列由此称为ART。
如已述及，本专利申请的第二个相关组分是为提高基因表达水平而融合到嵌合外显子/内含子下游的人工翻译增强子。
根据某些病毒前导序列的序列及所形成的二级结构分析，设计人工翻译增强子。我们从该分析中推断出翻译增强子具有3个基本元件。1)低复杂度的二级结构；2)富含C和A的序列片段；3)与共有HCAYYY序列(H＝C或U或A；Y＝C或U，参见表1)具有高达83％同源性的基序，暴露并频繁重复和/或位于具有低熔解点尾部的发夹结构中。
表1.某些RNA病毒前导序列片段中的结构性保守序列(H＝C/U/A；Y＝C/U)。
根据上述前提，我们设计了人工翻译增强子，其中发夹-环结构中的每一HCAYYY样序列内都插入45碱基的富含C和A的序列。该人工翻译增强子与提供其构建(confection)所用理论前提的RNA病毒前导序列的同源性不超过55％，甚至没有一个序列片段有6个以上的核苷酸具有100％同源性。这就是为什么我们可以肯定我们的翻译增强子不是先前报道或受保护(EP 0270611)的任何翻译增强子的衍生物；也不具有直接源自其中的序列。
为便于操作及目的基因融合，给我们的翻译增强子添加限制性位点。最后，在新的翻译增强子与我们制备的人工外显子/内含子融合之前，其体内功能性显示，具有与TMVω片段相同的增强嵌合基因表达的能力。我们制备的人工翻译增强子称为Eureka。(图2).
为构建本专利所要求的启动子序列，首先设计由共有序列TATA盒(Joshi C.P.Nucleic Acids Res.1987，156643-6653)形成的核心启动子，与CaMV 35S-24至-4区(距转录起始位点)融合，后接提供转录起始位点和C和A丰富区的肌动蛋白-1-5至+27启动子区。将玉米遍在蛋白-1距转录起始位点+26至+72区融合到下游，提供AC-和TC-丰富区，得到第一个人工外显子，再连接玉米肌动蛋白-1第二个外显子的IVS2内含子5’拼接位点前12个碱基并包括其自身。根据计算方法的预测在连接附近进行碱基改变、添加或缺失，以避免据推测可影响RNA成熟的二级结构。我们设计的人工内含子的组成如下，IVS2内含子的前54个碱基，融合玉米遍在蛋白-1第一个内含子5’区对应距转录起始位点+89至+126的37个碱基，后接稻肌动蛋白-1第一个内含子的375个碱基(距基因转录起始位点+103至+477)，融合玉米遍在蛋白-1内含子3’端的33个碱基(距转录起始位点+1051-1083)，连接肌动蛋白-1 IVS2内含子第二部分(距其3’加工起始位点-52至+5)以及包含限制性位点和翻译起始共有序列的29碱基嵌合序列。(Lütcke H.A；Chow K.C；Mickel F.S；Moss K.A；Kern H.F；Scheele G.A.The EMBO Journal.1987，643-48)。我们制备的人工外显子/内含子/外显子ART序列如图3所示。一旦通过烟草和稻细胞中的瞬时表达测试所构建人工外显子/内含子/外显子的有效加工，便将翻译增强子Eureka融合到其3’端，图4显示本发明目标启动子序列的最终结构(PARTB启动子)。
必须强调，我们设计的增强子元件ART比通常使用的稻肌动蛋白-1基因第一个外显子/内含子/外显子显示更高的基因表达增强子效率。Eureka片段是其活性的另一增强子。
此工作首次获得了两个人工的高效遗传元件，可增强任何类型转基因植物细胞中任何DNA序列的表达，证明了我们所根据的理论原则的正确性。AT含量低于52％的人工启动子可在双子叶植物细胞中充分加工，促进高IME表达，这也是首次。构建与ARN病毒前导序列同源性低的完全人工的高效翻译增强子，也是新颖的。
将不同的转录增强子序列融合到本发明目标启动子序列的5’。因此，如图5所示，将稻肌动蛋白-1的-43至-310区(距转录起始位点)融合到启动子PARTE 5’端，形成启动子区APARTE，还具有as-1样转录增强子元件(Benfey P.N；Chua N.H.Science，1990，250959-966)和玉米遍在蛋白-1启动子5’区556碱基片段(距转录起始位点-299至-855)，最终获得U3ARTE启动子，结构如图6所示。
从所述遗传元件构建了许多启动子序列变体(参见图7)，均通过体内分析表明了其功能性，证明所用的增强子和活化子区域对基因表达都具有协同效应。
在我们的构建体中用作转录增强子的as-1元件(参见图6)具有创新设计，因为它与章鱼氨酸合酶回文结构增强子的同源性低于50％(Ellis J.G；Llewellyn D.J；Walker J.C；Dennis E.S；Peacock W.J.EMBO J.1987，63203-3208；EP0278659)，不同于Ellis等人(BouchezD；Tokuhisa J.G；Llewellyn D.J；Dennis E.S；Ellis J.G.EMBO J.1989，84197-4204；美国专利5,837,849)所做研究中要求的任何该类型的序列变体(同一性低于85％)，并且其中发现的TGACG基序具有独特的侧翼序列内容。
尽管已经描述稻肌动蛋白-1基因并用于表达不同基因(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171；WO9109948)，但重要在于强调我们的工作揭示了其5’区的转录增强子活性及其作为异源表达增强子的用途。类似地，尽管已经要求玉米遍在蛋白-15’转录增强子区的用途(EP0342926)，但我们利用的556碱基片段并不包含被确定为该增强子功能性所必需的“热休克”元件(位于该启动子序列-188至-214)，因而是原始的，并不排除我们所用遍在蛋白序列的转录增强子活性。
PARTE启动子也与稻gluB-1基因(Takaiwa F；Oono K；Kato A.Plant Mol.Biol.1991，1649-58)距转录起始位点-31至-245区对应的214碱基小片段融合，形成新的启动子区CARTE(图8)。瞬时表达分析证明，该新的人工启动子GARTE在种子胚乳中高效表达DNA序列。
因此，我们断定这些嵌合5’转录增强子的功能性组合具有新颖性，极适用于制备可在植物细胞中(而不论其所属类型)获得DNA序列高水平表达的遗传元件。
显然，来自不同启动子的其它5’调节区可与本发明目标顺式融合，以便获得高水平表达和/或赋予该表达的时间(temporal)、器官或组织特异性。
对遗传工程技术的熟练人员而言，此处所述将使利用ART和Eureka增强子与植物细胞的任何转录启动子元件联合成为可能，以增强任何DNA序列在单、双子叶植物细胞中的转录/翻译。类似地，从我们的观察中获得的、引导我们设计ART和Eureka的理论原则，可以被分子生物学技术熟练人员用于构建植物细胞中新的DNA表达增强子序列。
考虑到过去20年间植物遗传工程的迅猛发展，连接任何基因和转录终止子序列的本发明的目标启动子显然可以插入植物细胞遗传转化载体，并通过使用成熟有效的技术而获得能够表达目的基因的转基因植物。
在本发明申请中，遗传转化载体是指作为运载体将预先插入其中的任何DNA片段引入植物细胞的DNA分子(已纯化或包含于细菌细胞或病毒之中)。
附图描述图1.稻肌动蛋白-1(Act)、玉米遍在蛋白-1(Ubi)和玉米蔗糖合酶(Shrun)距转录起始位点的基因序列。大写字母所示为第一个外显子，小写字母为第一个内含子的5’区，下划线为重复及共有序列基序的位置。
图2.所示为Bureka人工翻译增强子序列的相关元件及限制性内切酶识别位点。
图3.ART外显子/内含子/外显子人工序列，显示其每一组成片段的起源(小写字母人工内含子；双下划线为插入产生UUUUUAU样序列的碱基；单下划线标识限制性内切酶的某些相关识别位点)。
图4.本发明目标(PARTE启动子)的一级结构，显示融合到ART外显子/内含子/外显子区(内含子碱基小写，外显子大写)以及人工翻译增强子EUREKA的核心启动子(小写斜体)。下划线为限制性内切酶的某些相关识别位点。双下划线为TATA盒，黑体为翻译起始密码子。
图5.APARTE启动子的一级结构，显示融合到PARTE启动子(斜体小写为启动子，小写为内含子，大写为外显子)的稻肌动蛋白-1 5’调节区(距转录起始位点-43至-310的区域)。下划线标识限制性内切酶的某些相关识别位点。双下划线为TATA盒，黑体为翻译起始密码子。
图6.U3ARTE启动子的一级结构，显示其组成元件玉米ubi-1基因转录起始位点-299至-855区，大写；as-1样转录增强子，大写黑体；稻act-1基因转录起始位点-43至-310区，大写斜体；PARTE启动子为小写(双下划线为TATA盒，斜体为ART内含子，单下划线为翻译起始位点)。
图7.带有本发明目标增强子元件的启动子变体。A35SEureka；B35SART；C35SARTE；DPARTE；EAPARTE；F2A1PARTE；G2APARTE；HU3ARTE. 35S启动子(1.3Kb)； 翻译增强子Eureka ART外显子/内含子/外显子； 人工启动子核心； 稻肌动蛋白-1基因5’活化区(-43至-221)； 稻肌动蛋白-1基因5’活化区(-226至-310)； ASP(as-1样增强子)； 玉米遍在蛋白-1启动子5’活化区(-299至-855)。
图8.GARTE启动子一级结构，显示其组成元件稻gluB-1基因转录起始位点-31至-245区，大写斜体；PARTE启动子(启动子为小写斜体，内含子为小写；外显子为大写；某些相关限制性位点为下划线；TATA盒为双下划线；翻译起始密码子为黑体)。
图9.pUC-GUSint图。
图10.pBPFΩ(omega)7图。
图11.pBPFA19-接头图。
图12.通过加速微粒轰击引入带有GUSint基因的不同遗传构建体的瞬时表达，利用X-Gluc组织化学染色的ART和EUREKA元件在稻细胞中功能性的比较验证。
微生物保藏物质粒pC-EURGUSint；pC-ARTEGUSint；pGARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint按微生物保存布达佩斯条约保藏于BelgianCoordinated Collection of Microorganism，Plasmid Collection(BCCM/LMBP)Universiteit Gent，′Fiers-Schell-Van Montagu′building，Technologiepark 927，B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgica。质粒pC-EURGUSint；pC-ARTEGUSint；pGARTEGUSint的登录号分别为LMBP 4727；LMBP 4725；LMBP 4728，日期为2003年5月19日，pC-U3ARTEGUSint号码为4791，2003年11月25日。
实施例实施例1构建用于在植物细胞中表达DNA序列的新的嵌合系统的组成元件制备所有合成的DNA序列均带有不同II型限制性内切酶限制性位点的粘性末端，以便使其正确克隆更为容易。
a)Eureka翻译增强子克隆利用在合成的DNA片段设计中包括的酶粘性末端，将翻译增强子EUREKA(SEQ ID NO1)对应的86碱基对(bp)DNA片段克隆到预先经限制性酶PstI和SacI消化的载体pBluescript II SK(Stratagene，USA)。所得质粒命名为pBS-Eureka。
b)人工外显子/内含子/外显子区ART装配通过一个接一个地克隆、装配所设计的DNA片段，构建人工外显子/内含子/外显子区ART。首先，将包含核心启动子、第一个外显子及部分人工内含子的名为P35AcU(SEQ ID NO2)的DNA合成片段克隆到经Eco RI和Spe I限制性酶消化的pBluescript II SK载体，获得质粒pBS-AcU。此后，用Spe I和Sac I消化该质粒，在其中插入编码部分人工内含子的DNA合成片段I-U/Ac(SEQ ID NO3)。这样获得pBS-AcUAc质粒。
然后将带有人工内含子末端的DNA合成片段I-Ac/U(SEQ ID NO4)插入经限制性酶BamHI和Sac I消化的pBS-AcUAc质粒，生成质粒pBS-AcUAcU。
将片段IniT(SEQ ID NO5)插入SpeI/SacI消化的pBS-AcUAcU，便完成了人工外显子/内含子/外显子ART(SEQ ID NO6)，形成质粒pBS-ART，其位于pBluescript II载体限制性位点EcoRI和SacI间的一级结构如序列SEQ ID NO7所示。
c)PARTE启动子构建为构建本发明目标启动子序列(PARTE启动子)，通过XhoI/PstI消化pBS-ART质粒获得包含核心启动子和外显子/内含子/外显子区ART(没有3’区)的DNA片段，插入经相同酶消化的pBS-Eureka质粒。至此我们获得了质粒pPARTE(图4、图7D)，其EcoRI和SacI位点间序列如序列SEQ ID NO9所示。
实施例2Eureka和ART增强子元件在植物细胞中功能性的证明a)翻译增强子Eureka在烟草细胞中的功能性为检验Eureka在烟草和稻细胞中的增强子实力而制备一系列辅助性遗传构建体。
利用Nco I/Sac I消化质粒pUC-GUSint(图9)，获得在Sna BI位点插入马铃薯ST-LSl基因IV2内含子的报告基因uidA(GUSint)，克隆到质粒pBS-Eureka的相同位点，得到载体Pbs-EURGUSint。该载体进一步经限制性酶PstI和SalI消化并用S-1核酸酶处理，获得质粒pBS-ΔEURGUSint；经Xho I/Kpn I消化获得的DNA片段包含融合GUSint基因的Eureka增强子，将其插入pBPFΩ(omega)7载体(图10)。至此我们获得pBPF-EURGUSint载体(图7A)，具有位于CaMV 35S启动子(1.3kb形式)、Eureka增强子和根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)nos基因转录终止信号(tNOS)控制下的GUSint基因表达。
将质粒pUC-GUSint经SalI/Klenow和KpnI消化获得GUSint基因，克隆到pBPFΩ(omega)7载体的SmaI和KpnI位点，构建质粒pBPFΩ(omega)-GUSint，作为对照来评价构建体pBPF-EURGUSint的表达。该质粒类似于pBPF-EURGUSint，只是存在控制GUSint的翻译增强子Ω(omega)，而非Eureka。
通过Xho I-Nco I消化去除质粒pBPFΩ(omega)-GUSint的增强子Ω，经Klenow处理及质粒自连，获得pBPF-GUSint载体，构建另一对照质粒。
质粒pBPFΩ(omega)-GUSint，pBPF-GUSint，和pBPF-EURGUSint经HindIII消化，获得在植物中的GUSint表达盒；克隆到HindIII消化的双载体pCAMBIA2300，分别得到双载体pC-Ω(omega)7GUSint，pC-GUSint和pC-EURGUSint。
将所得双载体引入根瘤土壤杆菌株LBA4404，我们继续通过在NT1烟草细胞中的瞬时表达实验，按照有所修改的An等人所述规程(AnG.Plant Physiol.1985，79568-570)，分析增强子Eureka的功能性。烟草细胞与携带每个双载体的根瘤土壤杆菌共培养4天以后，收集细胞并如Jefferson所述处理(Jefferson R.A.1988.Plantreporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum Publishing Corporation.P.247-263)，以测定其β-葡糖醛酸酶(GUS)活性。每个实验重复3次，每次每一构建体5次重复。结果如下表所示。
表2.翻译增强子Eureka在烟草细胞中的功能性证明
如表2所示结果可知，Eureka与TMVω前导序列相比，其增强子活性没有显著差异，证明首次获得完全人工的有效翻译增强子。这也证实了我们的理论原则，表明有可能通过将C和A丰富的序列区域与基序HCAYYY(H＝C/T/A；Y＝C/T)同源的序列相结合，构建具有显著特性的遗传元件，以增强在其3’端下游融合的DNA序列的翻译。
b)人工外显子/内含子/外显子ART在烟草细胞中的功能性为测试ART元件在烟草细胞中的功能性，首先从Nco I-Sac I消化的质粒pUC-GUSint获得GUSint片段，克隆到相同酶消化的pBS-ART，获得质粒pBS-ARTGUSint。然后该质粒经SalI-BglII消化及S1核酸酶处理，获得pBS-ΔARTGUSint，再经XhoI-KpnI消化得到ARTGUSint片段，克隆到经相同酶消化的载体pBPFΩ(omega)7-GUSint，得到质粒pBPFARTGUSint(图7B)，，其中GUSint表达位于CaMV 35S启动子(1.3kb形式)、人工外显子/内含子/外显子区ART以及根瘤土壤杆菌nos基因转录终止信号(tNOS)控制之下。
利用XhoI/PstI消化从质粒pBS-ΔARTGUSint获得包含ART元件的条带，融合到经相同酶消化的pBS-BURGUSint载体，获得质粒pBS-ARTEGUSint。该质粒经XhoI/KpnI消化获得DNA片段，得到位于遗传元件ART和Eureka信号控制之下的GUSint基因，引入同样消化的pBPFΩ(omega)7载体，产生pBPFARTEGUSint质粒(Figure 7C)。
质粒pBPFARTGUSint和pBPFARTEGUSint经HindIII消化，得到GUSint的植物表达盒；将其克隆到双载体pCAMBIA2300，分别产生双质粒pC-ARTGUSint和pC-ARTEGUSint。
将所得双质粒引入根瘤土壤杆菌株LBA4404以后，我们使用本实施例部分(a)所述NT1烟草细胞，在瞬时表达试验中继续分析翻译增强子Eureka的功能性。所得结果如表3所示。
表3.遗传元件ART和Eureka在烟草细胞中的功能性证明
烟草细胞中的ART功能性评价结果显示，人工内含子正确加工并在双子叶植物细胞中具有表达增强子活性。我们的实验结果还表明构建体pBPFARTEGUSint中ART和Eureka元件相互作用所获正协同作用，将已知天然启动子CaMV 35S的表达能力提高5倍。
同时证明，所设计的人工遗传元件(ART和Eureka)可以功能性插入在植物细胞中起作用的任何启动子(本例CaMV 35S启动子)和任何其它DNA序列(本例GUSint)之间，提高其转录/翻译。
c)增强子元件Eureka和ART在稻细胞中的功能性制备一组新的构建体，以证明我们的人工增强子在单子叶植物细胞中的功能性。首先，质粒pBPFARTGUSint的XhoI-KpnI片段带有融合到人工外显子/内含子ART 5’端的uidA(gus)基因，将其插入经相同限制性酶消化的pBPFA19-linker载体(图11)，形成质粒pBPFA19ARTGUSint。在该质粒中，pBPFA19-linker中存在的稻肌动蛋白-1外显子/内含子/外显子区已被人工ART元件取代，保留其它调节元件，包括嵌合启动子A19(其中四份章鱼氨酸合酶as-1样增强子融合到CaMV 35S启动子(400bp形式))和tNOS转录终止信号。
类似地，将质粒pBS-ARTEGUSint的XhoI-KpnI片段克隆到pBPFA19-linker载体，获得构建体pBPFA19ARTEGUSint。将质粒pUC-GUSint的GUSint片段克隆到NcoI/SacI消化的pBPFA19-linker载体，制备构建体pBPFA 19GUSint，用作对照。所用另一对照质粒为pBPFΩ(omega)-GUSint。
通过分析多种indica Perla愈伤组织中的瞬时表达，定量评价ART和Eureka增强稻细胞中基因表达的能力。愈伤组织得自预先经次氯酸钠和乙醇消毒的成熟种子，在N6-2培养基N6盐和维生素(chuC.C等人Scientia Sinic 1975，18659)；0.1g/L myo-肌醇；1g/L酪蛋白水解物；2mg/L 2，4D；30g/L蔗糖；3g/L植物凝胶(Phytagel)，pH 5.7)中暗处培养21天。通过微粒轰击进行转化轰击之前将愈伤组织传代培养于添加0.4M Manitol的N6-2培养基中，进行渗透预处理。按照发表的规程，使用1μm球状金颗粒(BioRad)作为轰击用微粒(Russel1 D.R.，Wallace K.M.，Bathe J.H.等人Plant Cell Rep.1993，12165-169)。利用PDS-1000/He系统(BioRad)进行转化。将30个愈伤组织置于平皿中心进行轰击，条件为1100psi压力、距离6cm、每皿轰击一次。轰击之后，将愈伤组织保持在相同渗透培养基中暗处16小时，然后在不含Manitol的N6-2培养基中传代培养2天。利用组织化学方法由X-Gluc显示GUS活性(Jefferson R.A.1988.Plant reporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum PublishingCorporation.P.247-263)。在立体显微镜下计数每一愈伤组织的蓝色点片，进行评价(图12)。表4显示4次实验、每次3个重复所得结果。
表4.ART和Eureka在稻细胞中的功能性比较证明
可以看出，这些实验结果也证实ART和Eureka在单子叶植物细胞中作为基因表达增强子元件的功能性。重要的是要强调，在我们的分析中，由人工外显子/内含子/外显子ART(pA19ARTGUSint)所产生的IME活性高于稻肌动蛋白-1基因第一个外显子/内含子/外显子(pBPFA19GUSint)，是具有认可的基因表达增强子能力的遗传元件。此外，尽管在我们的实验中，构建体pA19ARTGUSint和pA19ARTEGUSint所得结果之间的显著差异不可理解，但在图12中是显著的，由于pA19ARTEGUSint轰击的愈伤组织经X-Gluc组织化学染色后的蓝色区片的大小及密度，后一构建体中存在的Eureka片段强力提高表达(图12)。
总之，本实施例表明人工遗传元件ART和Eureka在任何类型植物细胞中作为基因表达增强子的功能性。此外，证明这些增强子元件高效增加表达水平，与其所融合的启动子无关。最后，还证明ART和Eureka可以联合起来，更协同增强下游基因的表达。
另外表明ART和Eureka可以功能性插入任何植物活性的启动子(例如A19)和任何DNA序列(GUSint基因)之间，提高其转录/翻译。
实施例3利用不同5’转录增强子区域的PARTE表达系统变体a)为PARTE启动子添加稻肌动蛋白-1 5’转录活化子区为将稻肌动蛋白-1基因5’转录增强子区与PARTE启动子顺式融合，利用酶EcoRI和EcoRV消化pPARTE质粒，其中插入带有这些酶连接末端的合成DNA片段En-Ac1(稻肌动蛋白-1基因转录起始位点-43至-221；SEQ ID NO10)。所得质粒pA1PARTE经Eco RV和Hind III消化，插入合成DNA片段En-Ac2(稻肌动蛋白-1基因转录起始位点-226至-310；SEQ ID NO11)，完成肌动蛋白-1基因启动子5’活化区，得到质粒pAPARTE(图5、图7E)，其限制性位点HindIII和SacI之间的核苷酸序列如序列SEQ ID NO12所示。
b)为APARTE启动子添加as-1样转录增强子序列质粒pA1PARTE经NruI和SalI消化，其中插入称为ASP的DNA合成片段(SEQ ID NO13)，该片段具有所述限制性酶的粘性末端并编码as-1样转录增强子序列，从而产生构建体pASPΔA1PARTE。该质粒经Sal I消化、S1核酸酶处理、再经Pst I消化，获得约900bp DNA片段后，克隆到NruI和PstI消化的载体pA1PARTE，最终获得质粒pASPA1PARTE，其中具有在NruI位点插入稻肌动蛋白-1 5’转录活化区的ASP增强子。经过EcoRV-XhoI消化，将第二个ASP增强子插入质粒pASPA1PARTE，得到载体p2A1PARTE(在序列SEQ ID NO14中，显示限制性位点KpnI和SacI之间的核苷酸序列)，其结构如图7F所示。
如上文针对pA1PARTE所述，也将En-Ac2片段插入pASPA1PARTE，获得构建体pASPAPARTE，其中第二个ASP增强子经EcoRV-SalI消化而插入，最终获得载体p2APARTE(图7G)。位点SalI和SacI之间的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。
c)U3ARTE启动子构建首先，使用引物Oli-U1(S3Q ID NO16)和Oli-U2(SEQ ID NO17)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增对应于玉米ubi-1基因转录起始位点-299至-680区约395bp DNA片段。扩增的片段经限制性酶KpnI和XhoI消化(两位点均包括在引物内部)，克隆到同样处理的pBluescript II SK载体，获得构建体pBS-Ubil。此后，将编码玉米ubi-1基因-680至-855(序列SEQ ID NO18)的合成DNA片段(En-U2)克隆到NcoI/KpnI消化的pBS-Ubil载体，得到构建体pBS-Ubi2，其中包含玉米遍在蛋白-1基因5’活化子区(-299至-855，序列SEQ IDNO19)。
通过Xho I-Kpn I消化质粒pBS-Ubi2，获得不包含“热休克”盒的玉米遍在蛋白-1基因5’转录活化子克隆区，并通过SalI-KpnI消化该载体而顺式插入启动子2APARTE的5’端，获得所述构建体pU3ARTE(图6、图7H)。载体pU3ARTE介于位点Kpn I和Sac I之间的序列如序列SEQ ID NO20所示。
d)GARTE启动子构建为证明本发明目标的可塑性，我们决定将启动子的5’调节区与器官、组织或发育特异性相融合，赋予所述特征高水平表达。因此，控制谷蛋白(gluteline)器官特异性表达的稻gluB-1基因5’调节区顺式融合到PARTE启动子5’端。为达此目的，合成了对应于gluB-1转录起始位点-31至-245区(SEQ ID NO21)以及方便的克隆位点的214bp片段(GLU)，插入EcoRI和XhoI消化的pPARTE质粒，产生pGARTE载体(图8)，其XhoI和SacI位点间的一级结构如序列SEQ ID NO22所示。
实施例4PARTE表达系统不同变体在烟草和稻细胞中的功能性为评价本发明目标的每个启动子变体在单子叶和双子叶植物细胞中的表达水平，通过SmaI-SpeI消化缺失双载体pC-ARTE-GUSint中控制GUSint表达的CaMV 35S启动子，在其位置插入来自构建体pAPARTE、p2A1PARTE、p2APARTE和pU3ARTE的KpnI/S1核酸酶-SpeI片段，产生新的双载体pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint。
a)烟草中分析将双载体pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint引入根瘤土壤杆菌细胞，如实施例2部分(a)所述，在NT1烟草细胞中进行瞬时表达分析实验。所用对照质粒pC-GUSint的GUS表达位于CaMV 35S启动子(1,3kb形式)和tNOS终止子控制下。实验进行两次(每次处理5次重复)，结果如下表所示
表5.PARTE表达系统不同变体在烟草细胞中的功能性
显然，我们的结果确证了本发明目标中不同启动子变体的功能性，也表明有可能依靠融合到PARTE的5’转录调节区调节其活性。必须强调，我们利用我们的遗传构建体在双子叶植物中达到了比天然启动子CaMV 35S控制下更高的表达水平。
b)稻中分析如实施例2部分(c)所述，利用双载体pC-APARTEGUSint、pC-2A1PARTEGUSint、pC-2APARTEGUSint和pC-U3ARTEGUSint轰击稻愈伤组织，以便进行PARTE启动子不同变体活性的瞬时评价。对照质粒pActl-F(McElroy D；Zhang W；Cao J；Wu R.Plant Cell 1990，2163-171)的gus基因表达位于稻肌动蛋白-1基因启动子和tNOS终止子控制下。经KpnI-XbaI消化，从这些质粒中分离表达盒，插入经系统限制性酶消化的双质粒pCAMBIA 2300，产生载体pC-Act1F。
轰击实验进行3次，待评价的每个构建体3次重复。所得结果如下表所示表6.PARTE启动子表达系统不同变体在稻细胞中的功能性
该表所示结果证明PARTE启动子不同变体在单子叶植物细胞中的功能性，获得高于稻肌动蛋白-1基因天然启动子的表达水平。因而证实本发明目标作为置于其顺式控制下的DNA序列获得高水平表达的有效遗传工具的用途。
c)稻种中分析为评价GARTE启动子在稻细胞胚乳中的组织特异性，将pBPFARTEGUSint载体约2.5Kb的SalI/Klenow-RstI片段(其中包含与带有nos终止子(tNOS)的GUSint基因融合的Eureka片段)克隆到XbaI/Klenow-PstI消化的pGARTE载体，得到构建体pGARTEGUSint。
还构建了对照质粒，将pGARTEGUSint中的GARTE启动子经Xho I-Nco I消化而替换为pGEM-T-GluB-1质粒经SalI-NcoI消化获得的种子胚乳特异性高效稻谷蛋白B-1启动子。从而获得pGluGUSint。
根据Y-S.Hwang(Hwang Y-S；McCullar Cass；Huang N.PlantScience.2001，1611107-1116)所述，通过轰击从温室培养的稻品种indica Perla的谷穗颖果(ear cariopsis)中分离的未成熟胚乳(极化后8-9天)，评价GARTE启动子并与GluB1比较。利用包裹待评价质粒DNA的金微粒轰击后24小时，根据Jefferson(Jefferson R.A.1988.Plant reporter genesthe GUS gene fusion system.InJ.K.Setlow(Ed)，Genetic Engineering.Vol.10，Plenum PublishingCorporation.P.247-263)所述进行荧光分析，以测定胚乳中的GUS活性。两次独立实验(每次5个重复)所获GUS活性结果如表7所示。
表7.GARTE启动子在稻种胚乳中的功能性
这些结果证实，基于我们所设计的人工元件的嵌合启动子GARTE在种子胚乳中高效表达基因；尽管插入GARTE启动子的GLU序列能够赋予表达的特异性，其自身并不能保证高水平，还依赖于构成该启动子的其它元件(Takaiwa F；Yamanouchi U；Yoshihara T；Washida H；Tanabe F；Kato A；Yamada K.Plant Mol Biol.1996，301207-1221)。
所示数据再次确认，在本发明目标元件上游插入调节区可使其用于有效导致任何DNA序列的发育、器官或组织特异性表达。分子生物学的熟练人员显而易见，插入GARTE启动子的GluB-1启动子调节序列可以成功替换为响应生物压力(例如病原体攻击)、非生物因素(例如伤害、极高或极低温度、盐度、干旱、存在某些化学物质)、氧化压力、不同器官和组织发育阶段等的调节序列。
还很明显，利用已知的生物学或物理-化学转化方法，可以将克隆于本发明目标调节区之下的DNA序列引入植物细胞并稳定插入，并有可能从这些遗传修饰的细胞中再生可繁殖的植物，其中DNA序列将按照其所融合的启动子变体而适宜表达。因此，本发明揭示其有助于生成具有较高水平的对害虫、疾病、多种压力的抗性、较高的农业产量或高效生产医学或工业应用的化合物以及其它用途的转基因植物的潜力。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>用于在植物细胞中表达DNA序列的人工启动子<130>用于植物中DNA表达的启动子<140>0000<141>2002-11-18<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>86<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Eureka转录增强子<400>1gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac aacacaaaca caacacaact caatcattta 60tttgacaaca caactaaaca accatg 86<210>2<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段P35AcU.
<400>2gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagt 198
<210>3<211>231<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段I-U/Ac.
<400>3ctagaccgcc gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt 60ttttccgtct cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg 120cccagatcgg tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg 180tgcggccgga ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatccgagct c 231<210>4<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段I-Ac/U.
<400>4gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca 60agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct 120cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc 180tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt 240tatactagtg agctc 255<210>5<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段IniT.
<400>5
ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg tataactgca 60ggaaacaaca acaataacca tggtctagag ctc 93<210>6<211>692<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工外显子/内含子/外显子ART.
<400>6accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660tataactgca ggaaacaaca acaataacca tg 692<210>7<211>750<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体pBS-ART的EcoRI和SacI位点间的序列<400>7gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360
ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720aacaacaaca ataaccatgg tctagagctc 750<210>8<211>757<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工外显子/内含子/外显子ARTE.
<400>8accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660tataactgca ggaaacaaat tgaacatcat tctatcaata caacacaaac acaacacaac 720tcaatcattt atttgacaac acaactaaac aaccatg 757<210>9<211>815<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体pPARTE的EcoRI和SacI位点间的序列<400>9
gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca atcatttatt 780tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc815<210>10<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-Acl.
<400>10atcaccgtga gttgtccgca ccaccgcacg tctcgcagcc aaaaaaaaaa aaagaaagaa 60aaaaaagaaa aagaaaaaac agcaggtggg tccgggtcgt gggggccgga aaagcgagga 120ggatcgcgag cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatca 180attc 184<210>11<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-Ac2.
<400>11aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cact 94
<210>12<211>1087<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体pAPARTE的HindIII和SacI位点间的序列<400>12aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cactatcacc gtgagttgtc cgcaccaccg 120cacgtctcgc agccaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg 180tgggtccggg tcgtgggggc cggaaaagcg aggaggatcg cgagcagcga cgaggccggc 240cctccctccg cttccaaaga aacgcccccc atcaattcta tatataggaa gttcatttca 300tttggagccc cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tcctccttca cacaacacac 360acacaacaga tctcccccat cctccctccc gtcgcgccgc gcaacacctg gtaagatggc 420tgtgcgctca gatatatata gtgatatgca ctacaaagat cataactaga ccgccgcctc 480cccccccccc cctctctacc ttctctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcgtct 540cgatctttgg ccttggtagt ttgggggcga gaggcggctt cgtcgcccag atcggtgcgc 600gtttttttat ttggaggggc gggatctcgc ggctgggtct cggcgtgcgg ccggattctc 660gcggggaatg gggctctcgg atgtggatct gatccgccgt tgttggggga gatatggggc 720gtttaaaatt tcgccatgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta 780atttttatat atttctgctg ctgctcgtca ggattagatg tgcttgatct ttctttcttc 840tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc ggtagttttt cttttgtcga 900tgctcaccct gttgtttggt gtttttatac tagtggctat cctgacacgg tctctttgtc 960aaatatctct gtgtgcaggt ataactgcag gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac 1020aacacaaaca caacacaact caatcattta tttgacaaca caactaaaca accatggtct 1080agagctc 1087<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段ASP.
<400>13gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc c 31
<210>14<211>1065<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体p2A1PARTE的KpnI和SacI位点间的序列<400>14ggtaccgggc cccccctcga ctgacgcttc gaatgacgca catgccatca ccgtgagttg 60tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa aagaaaaaga 120aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat cgctgacgct 180tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 240cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc 300accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc 360tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt 420gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt 480ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt 540gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg 600gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat 660gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa 720acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct 780gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat 840ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 900ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat 960aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca 1020atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1065<210>15<211>1135<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体p2APARTE的SalI和SacI位点间的序列<400>15gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc catccatagc aagcccagcc caacccaacc 60caacccaacc caccccagtg cagccaactg gcaaatagtc tccacacccc ggcactatca 120
ccgtgagttg tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa 180aagaaaaaga aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat 240cgctgacgct tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct 300tccaaagaaa cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc 360caaccctacc accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc 420tcccccatcc tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga 480tatatatagt gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc 540tctctacctt ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc 600ttggtagttt gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt 660ggaggggcgg gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg 720gctctcggat gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc 780gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat 840ttctgctgct gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta 900gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt 960tgtttggtgt ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt 1020gtgcaggtat aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca 1080acacaactca atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1135<210>16<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物Oli-U1.
<400>16gaaggtaccg ccatggtcta aaggacaatt g 31<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物Oli-U2.
<400>17ctcctcgagg gcgtttaaca ggctggc 27
<210>18<211>186<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段En-U2.
<400>18ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatgg186<210>19<211>563<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述玉米遍在蛋白-1基因的转录活化子序列(-299至-855区).
<400>19ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540ccagcctgtt aaacgccctc gac 563<210>20<211>1692<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述载体pU3RTE的KpnI和SacI位点间的序列<400>20ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540ccagcctgtt aaacgccctc gactgacgct tcgaatgacg cacatgccat ccatagcaag 600cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtgcag ccaactggca aatagtctcc 660acaccccggc actatcaccg tgagttgtcc gcaccaccgc acgtctcgca gccaaaaaaa 720aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc 780ggaaaagcga ggaggatcgc tgacgcttcg aatgacgcac atgcccgagc agcgacgagg 840ccggccctcc ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcaa ttctatatat aggaagttca 900tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 960cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 1020atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 1080gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 1140cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 1200tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 1260ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 1320ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1380gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 1440tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 1500gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 1560ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 1620aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1680ggtctagagc tc 1692<210>21<211>223<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成片段GLU.
<400>21ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttc 223<210>22<211>1032<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述载体pGARTE的XhoI和SacI位点间的序列<400>22ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttctatatat aggaagttca 240tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 300cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 360atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 420gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 480cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 540tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 600ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 660ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 720gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 780tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 840gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 900ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 960aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1020ggtctagagc tc 103权利要求
1).人工启动子，其特征在于是启动融合到其3’端的任何DNA序列在植物细胞中表达的重组DNA分子，包含a).5’转录调节元件，后接b).包含TATA盒、GC含量少于64％的核苷酸序列以及转录起始位点的人工核心启动子，其3’端融合到c).可转录但不可翻译的合成核苷酸序列，包含第一嵌合外显子、一个能够增强与其融合的基因在植物中表达的人工内含子及对下游插入的任何基因具有翻译增强特性的第二嵌合外显子。
2).权利要求1的人工启动子，特征在于它是具有人工的5’转录调节元件的重组DNA分子。
3).权利要求1的人工启动子，特征在于它是具有与天然增强和/或调节植物细胞中基因表达的DNA序列同源的5’转录调节元件的重组DNA分子。
4).权利要求3的人工启动子，其5’转录调节元件来自稻肌动蛋白-1基因。
5).权利要求4的人工启动子，其5’转录调节元件包含稻肌动蛋白-1基因转录起始位点的-43至-310区。
6).权利要求5的人工启动子，其5’转录调节元件核苷酸序列对应于SEQ ID NO10序列或其片段。
7).权利要求5的人工启动子，其5’转录调节元件核苷酸序列对应于SEQ ID NO11序列或其片段。
8).权利要求3的人工启动子，其5’转录调节元件来自玉米遍在蛋白-1基因。
9).权利要求8的人工启动子，其核苷酸序列包含玉米遍在蛋白-1基因转录起始位点的-299至-855区。
10).权利要求9的人工启动子，其5’转录调节元件对应于SEQ IDNO19序列或其片段。
11).权利要求2和3的人工启动子，其5’转录调节元件是as-1样转录增强子。
12).权利要求11的人工启动子，其as-1样转录增强子的核苷酸序列与对应于SEQ ID NO13中核苷酸7-26或互补序列的序列片段基本相同。
13).权利要求3的人工启动子，其5’转录调节元件来自病毒启动子。
14).权利要求13的人工启动子，其5’转录调节元件来自CaMV35S启动子。
15).权利要求2和3的人工启动子，其5’转录调节元件控制植物细胞中发育、器官或组织特异性的基因表达。
16).权利要求15的人工启动子，其5’转录调节元件控制种子中的表达。
17).权利要求16的人工启动子，其5’转录调节元件来自稻谷蛋白B-1基因。
18).权利要求17的人工启动子，其5’转录调节元件包含稻谷蛋白B-1基因转录起始位点-31至-245区的片段。
19).权利要求18的人工启动子，其中5’转录调节元件对应于SEQID NO21序列或其片段。
20).权利要求15的人工启动子，其中5’转录调节元件控制植物细胞中生物或非生物压力下的基因表达。
21).权利要求15的人工启动子，其中5’转录调节元件控制植物创伤组织中的基因表达。
22).权利要求1的人工启动子，其中5’转录调节元件包含有效融合的2个或多个不同来源的调节元件，它们分别符合权利要求2-21所述的任意特征。
23).权利要求1的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的第一个外显子包含富含C和A的序列基序。
24).权利要求1的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的第一个外显子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC频繁重复的序列。
25).权利要求1的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的内含子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC频繁重复的序列。
26).权利要求23-25的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的核苷酸序列对应于SEQ ID NO6或其片段。
27).权利要求1的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的第二个外显子包含高C和A含量的序列基序。
28).权利要求1的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的第二个外显子包含至少与基序HCAYYY(H＝C或T或A；Y＝C或T)具有83％同源性的序列。
29).权利要求27和28的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的第二个外显子的核苷酸序列对应于SEQ ID NO1序列。
30).权利要求23-29的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的核苷酸序列对应于SEQ ID NO8或其片段。
31).权利要求1-30的人工启动子，其中人工外显子/内含子/外显子区的核苷酸序列至少部分对应于SEQ ID NO20中的序列。
32).权利要求1-31的人工启动子的DNA片段，在与植物中具有功能的任何启动子融合以后，有助于增强受该启动子控制的DNA序列的表达。
33).权利要求32的人工启动子片段，能够增强与其融合的基因的翻译。
34).权利要求33的人工启动子片段，包含至少与基序HCAYYY(H＝C或T或A；Y＝C或T)具有83％同源性的序列。
35).权利要求33的人工启动子片段，具有富含C和A的序列基序。
36).权利要求33的人工启动子片段，其中核苷酸序列对应于SEQID NO；1序列。
37).权利要求33-36的人工启动子片段，有助于增强植物细胞中由CaMV 35S启动子生成的mRNA的翻译。
38).权利要求32的人工启动子片段，对应于外显子/内含子/外显子区。
39).权利要求38的人工启动子片段，其中第一个外显子包含富含C和A的序列基序。
40).权利要求38的人工启动子片段，其中第一个外显子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC频繁重复的序列。
41).权利要求38的人工启动子片段，其中内含子包含其中CTCC基序和/或其同源性序列CTC、TCC和TC频繁重复的序列。
42).权利要求38的人工启动子片段，其中核苷酸序列对应于SEQID NO6中的序列。
43).权利要求38的人工启动子片段，其中核苷酸序列对应于SEQID NO8中的序列。
44).权利要求38-43的人工启动子片段，有助于增强植物细胞中CaMV 35S启动子控制下的任何基因的表达。
45).权利要求32的人工启动子片段，对应于as-1样转录增强子。
46).人工启动子片段，其核苷酸序列与SEQ ID NO13中核苷酸7-26对应片段或其互补序列基本相同。
47).权利要求32的人工启动子片段，对应于5’转录调节元件。
48).权利要求47的人工启动子片段，其中5’转录调节元件来自稻肌动蛋白-1基因。
49).权利要求48的人工启动子片段，其中核苷酸序列包含稻肌动蛋白-1基因转录起始位点-43至-310区的片段。
50).权利要求49的人工启动子片段，其中核苷酸序列对应于SEQID NO10中序列或其片段。
51).权利要求49的人工启动子片段，其核苷酸序列对应于SEQID NO11序列或其片段。
52).权利要求47的人工启动子片段，其5’转录调节元件来自玉米遍在蛋白-1基因。
53).权利要求52的人工启动子片段，其中核苷酸序列包含玉米遍在蛋白-1基因转录起始位点的-299至-855区。
54).权利要求53的人工启动子片段，其中5’转录调节元件对应于SEQ ID NO19中的序列或其片段。
55).在植物细胞中DNA序列表达盒子，其包含符合权利要求1-31中任一项的人工启动子。
56).在植物细胞中DNA序列表达盒子，其包含与相应于权利要求32-54中任一项的DNA片段功能性融合的转录增强子元件。
57).用于植物细胞转化的DNA载体，包含具有权利要求55或56特征的表达盒之一。
58).带有权利要求57的载体的细菌细胞及其后代。
59).权利要求57的载体转化的植物细胞及其后代。
60).权利要求59的植物细胞，在通过权利要求57所述载体引入的表达盒中的人工启动子控制下表达DNA片段。
61).权利要求59的植物细胞，其基因组中稳定整合了具有权利要求55或56特征的表达盒。
62).由具有权利要求61特征的植物细胞再生的转基因植物。
63).权利要求62的转基因植物，在通过权利要求57所述载体引入的表达盒所含人工启动子控制下表达DNA片段。
64).具有权利要求63特征的转基因植物后代。
65).权利要求64的植物，是双子叶植物。
66).权利要求65的植物，是茄科植物。
67).权利要求66的植物，属于以下物种之一烟草、番茄或马铃薯。
68).权利要求64的植物，是单子叶植物。
69).权利要求68的植物，是禾本科植物。
70).权利要求69的植物，属于以下物种之一稻、甘蔗、玉米、小麦或大麦。
71).权利要求60或63的细胞或植物因位于通过权利要求57所述载体引入的表达盒所含人工启动子控制下表达DNA片段而生成的重组蛋白质的纯化或用途。
全文摘要
本发明涉及特征在于包含嵌合重组DNA分子的人工启动子，当引入任何类型的植物细胞以后，可促进与其3′端融合的任何DNA分子的高水平表达。本发明所述启动子的基本遗传元件为具共有序列TATA盒的核心启动子后接外显子/内含子/外显子区以及翻译增强子元件，均为人工构建。转录调节元件可插入所述启动子上游，以提供具有器官或组织特异的时间应答能力的表达。所设计的人工遗传元件可功能性插入在植物细胞中起作用的任何启动子与任何DNA序列之间，以提高其转录/翻译水平。
文档编号C12N15/82GK1738902SQ200380108708
公开日2006年2月22日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月27日
发明者G·塞尔曼－豪森索莎, A·萨拉查罗德里格斯, D·阿布雷乌雷梅迪奥斯, O·拉莫斯冈萨雷斯 申请人:遗传工程与生物技术中心