专利名称：降低胆固醇的制剂、食品增补剂和食品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及降低胆固醇的制剂，尤其是一种用作降低血浆胆固醇水平的药物的细菌制剂。本发明还涉及药物制剂、包含该制剂的食品增补剂、包含该食品增补剂的食品及它们的制备方法。
背景技术：
心血管疾病由许多协同因素引起，最重要的因素是血液胆固醇水平过高。因为胆固醇是细胞膜的一种组分，所以它是动物细胞和人细胞的基本构件。人细胞可以自身合成胆固醇，但是胆固醇也可以从食物中吸收。这两种方法在胆固醇的新陈代谢中都有重要的作用。
除了胆固醇具有作为细胞膜构件的基本生理作用之外，它对人类健康还具有负面影响，是心血管疾病(例如心肌梗塞、卒中和外周血管疾病)的一个原因，更具体地，它与血管壁内动脉粥样硬化损伤的发生有关。对于心血管疾病和动脉粥样硬化的发生，血浆胆固醇水平的提高是最重要的前兆危险因素。
在血浆中，胆固醇在所谓的脂蛋白中运输，根据脂蛋白的直径和比重，它们可以被细分为许多不同的种类。极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)组成了脂蛋白的最重要种类。
实验研究和临床研究已经表明，在VLDL、IDL和LDL类脂蛋白中运输的胆固醇(所谓促动脉粥样硬化的胆固醇)的量是心血管疾病发生的危险因素。相反地，在HDL粒子中运输的胆固醇可防止心血管疾病的发生(抗动脉粥样硬化的胆固醇)。
随机的、安慰剂对照的前瞻性临床研究已经证实，降低血浆胆固醇对心血管疾病的发生和死亡率具有有利的影响。但是，前提是胆固醇的减少应归因于在VLDL、IDL和LDL中存在的促动脉粥样硬化的胆固醇的减少。因此，对于心血管疾病的治疗和预防，有必要减少促动脉粥样硬化的胆固醇，并增加抗动脉粥样硬化的胆固醇的绝对或相对比例。有许多方法用于减少血浆胆固醇。最重要的是■抑制胆固醇的生物合成；■增加胆固醇(和/或它的代谢物，具体地为胆汁酸)从组织进入肠腔内的转移；■减少胃肠道对胆固醇和胆汁酸的吸收。
现今用于抑制胆固醇合成的药物通常是酶羟甲基-戊二酰-辅酶A还原酶(HMGCoA还原酶)的抑制剂，该酶在胆固醇的合成途径中是限速酶。这些所谓的“抑制素”是能竞争性地抑制酶作用的分子。例子有辛伐他汀(“Zocor”)、普伐他汀(“Pravachol”)和阿托伐他汀(“Lipitor”)。抑制素通常是天然真菌代谢物的化学合成衍生物。
为了提高胆固醇的去除率，可以使用胆汁酸吸附树脂(例如消胆胺，“Questran”)。由于胆汁酸被树脂吸附，它们在粪便中的排泄增加，被肠再吸收进入血液的胆汁酸减少，导致身体中胆汁酸的相对损失。因此，肝脏增加了胆固醇到胆汁酸的转化，导致身体中胆固醇分泌物(代谢物)的净增加。由于胆汁酸(通过溶解胆固醇)对于从内腔摄取胆固醇进入肠组织是必需的，所以肠腔内胆汁酸含量的减少也会导致胆固醇摄取的下降。
通过抑制肠上皮细胞中胆固醇(和相关固醇)的细胞运输系统，从而抑制胆固醇从肠腔主动转运到血液的药物还处于开发阶段。一种这样的化合物(“Ezetimibe”)近来已经在一些国家注册；其它相关药物还正处于临床试验中。
除了使用药物之外，通过使用天然化合物、或来源于天然产物的化合物也能达到上述目的(Hassel，1998)。一种类抑制素化合物以所谓的“红米”自然地产生，这是一种携带霉菌的稻菌株，该霉菌可产生洛伐他汀。这种真菌代谢物与减少胆固醇的药物“Mevacor”是同样的。另一个例子是植物中所谓植物固醇的出现，它们竞争性地抑制肠道对胆固醇和胆汁酸的摄取。当前植物固醇在人造奶油“Benecol”和“Becel Proactif”中被用作降低胆固醇的添加剂。
然而，对降低胆固醇的制剂的需要依然存在，特别是用在食品工业中，优选地针对人类营养。
发明概述令人惊讶地，我们发现，在实验动物的食物中加入一种冻干深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum(R.rubrum))制剂可以显著降低这些动物的血液胆固醇水平。
在第一方面，本发明现在提供了用作药物的一种红螺菌属(Rhodospirillum spp.)和/或褐螺菌属(Phaeospirillum spp.)制剂。所述制剂可以是任一类型制剂，如只包括细胞化合物、优选膜组分的无细胞制剂，或包括活的或死的红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂。
在另一方面，本发明提供了一种药物制剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属、和一种或多种赋形剂。
在又一方面，本发明提供了一种降低血浆胆固醇的药剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
在还一方面，本发明涉及使用红螺菌属和/或褐螺菌属制剂来制备降低血浆胆固醇的药物。
在还一方面，本发明提供了一种具有降低胆固醇性质的食品增补剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
在另一方面，本发明提供了一种具有降低胆固醇性质的益生菌，包含活红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂。
在另一方面，本发明提供了一种食品，包括本发明的食品增补剂。
在另一方面，本发明提供了一种制备红螺菌属和/或褐螺菌属制剂的方法，包括将一个或多个红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞培养为多细胞培养物，收获所述培养物，将所述培养物的细胞加工成制剂。这种方法的优选实施方案包括将所述培养物的细胞加工成活红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂。
在另一方面，本发明提供了一种制备本发明食品增补剂的方法，包括制备适于消费的红螺菌属和/或褐螺菌属制剂，该制剂计划用作本发明的药物。
在另一方面，本发明提供了一种制备本发明食品的方法，包括将食品增补剂掺合到食品中。
附图简述
图1显示了在Wistar大鼠中喂食正常食物、或含10％(w/w)深红红螺菌食物对血浆胆固醇和甘油三酯的影响，如实施例2所解释的。*表示相对于对照物，p＜0.001。
图2显示了在喂食正常食物的Wistar大鼠和喂食含10％(w/w)深红红螺菌食物的Winstar大鼠的血浆中脂蛋白的模式，如实施例2所解释的。(通过快速蛋白质液相色谱法分离)。
图3显示了在C57B1/6小鼠中喂食正常食物和含10％(w/w)深红红螺菌食物对血浆胆固醇和甘油三酯的影响，如实施例3所解释的。*表示相对于对照物，p＜0.003。
图4显示了在C57B1/6小鼠中喂食高胆固醇血的“西方类型”的食物和含10％(w/w)深红红螺菌的高胆固醇血“西方类型”食物对血浆胆固醇和甘油三酯的影响，如实施例4所解释的，*表示相对于对照物，p＜0.0003。**表示相对于对照物，p＜0.011。
图5显示了在喂食高胆固醇血“西方类型”的食物和含10％(w/w)深红红螺菌的高胆固醇血“西方类型”食物的C57B1/6小鼠中血浆的脂蛋白模式，如实施例4所解释的。(通过快速蛋白质液相色谱法分离)。
图6显示了在喂食“西方类型”食物1和2周后，不同浓度的深红红螺菌对血浆胆固醇的影响，如实施例5所解释的。*表示2周后与对照物的显著不同(相对于对照物，p＜0.001)。**表示1周后与0％深红红螺菌的显著不同(相对于对照物，p＜0.001)(数据显示为平均值±标准差)。
图7显示了在喂食高胆固醇血“西方类型”的食物和含不同浓度的深红红螺菌的高胆固醇血“西方类型”食物的APOE3*Leiden小鼠中脂蛋白的模式，如实施例5所解释的。(通过快速蛋白质液相色谱法分离)。
图8显示了在喂食“西方类型”食物2周后，不同浓度的深红红螺菌对血浆胆固醇和7-烯胆烷醇的影响，如实施例5所解释的。*表示与对照物显著不同(数据显示为平均值±标准差)。
图9显示了喂食“西方类型”食物2周后，不同浓度的深红红螺菌对血浆胆固醇和β-谷固醇的影响，如实施例5所解释的。(数据显示为平均值±标准差)。
图10显示了在喂食含不同浓度深红红螺菌的“西方类型”食物的小鼠中，VLDL-甘油三酯(框图a)和VLDL的脂质组合物(框图b)的合成，如实施例5所解释的。
图11显示了在喂食含不同浓度深红红螺菌的“西方类型”食物的小鼠中，其粪便内的中性固醇的排泄，如实施例5所解释的。
图12显示了在喂食含不同浓度深红红螺菌的“西方类型”食物的小鼠中，其粪便内的胆汁酸的排泄，如实施例5所解释的。
图13显示了在喂食含不同浓度深红红螺菌的“西方类型”食物的小鼠中，其粪便内的中性固醇以及胆汁酸的排泄，如实施例5所解释的。
发明详述红螺菌属是红螺菌科中的一个属，这个科为红螺菌目和α-蛋白细菌纲的紫色非硫细菌的一个科。其中，红螺菌科的特征在于是向光性的、既可以有氧生长又可以厌氧生长，使用光作为能量源。为此目的，细菌包含叶绿素b。在红螺菌属中，有三个种被分出，例如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)(Imhoff和Trüper，1992)、世纪红螺菌(Rhodospirillum centenum)和度光红螺菌(Rhodospirillumphotometricum)。另外，有四个种没有被正式认可，即需盐红螺菌(Rhodospirillum salexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、好盐红螺菌(Rhodospirillum sodomense)和纤细红螺菌(Rhodospirillumtenue)。在褐螺菌属(红螺菌科的另一成员)中，包括两个种微黄褐螺菌(Phaeospirillum fulvum)和莫氏褐螺菌(phaeospirillum molischianum)。(命名法参见Imhoff et al(1998)；Euzéby(2003)；和参考文献1)。
其中，在天然水、泥浆和污水处理车间中发现深红红螺菌。在污水纯化中细菌用于动物食品(例如作为家禽和鱼的饲料)的生物量生产并作为肥料。由于光养菌的生物量富含维生素和氨基酸，所以被认为是动物饲料的优良原材料。
将深红红螺菌用作动物饲料已经实施了一段时间(Imhoff和Trüper，1992)。然而，本发明人惊讶地发现，通过降低血浆和/或血清(血液)中的胆固醇水平，深红红螺菌对防止心血管疾病的发生作出了重要的贡献。
本发明中降低胆固醇性质是指当组合物、制剂、食品增补剂或食品以合适的方式施用至受验者的身体时，它们可降低所述受验者的血液胆固醇水平的性能。测量血液胆固醇水平的方法为本领域技术人员所知。
本发明中红螺菌属和/或褐螺菌属制剂是指一定量的红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞物质，它已经以某种方式被加工。根据本发明的几个实施方案，红螺菌属和/或褐螺菌属制剂可包括细胞提取物、或从细胞中分离的具有降低胆固醇性质的组分、或整个细胞的浓缩物、或破坏的细胞碎片的浓缩物。这种制剂优选地可以包括膜组分。另外，根据本发明，制剂可以包含冻干的红螺菌属和/或褐螺菌属，其细胞仍然大量的活着，并且能够在较有利的环境下重新开始细胞分裂。
根据本发明，制剂可以完全由来自红螺菌属的一个种所组成，但是也可以使用如下不同红螺菌种的混合物，如深红红螺菌、世纪红螺菌、纤细红螺菌、度光红螺菌、需盐红螺菌、盐场红螺菌和/或好盐红螺菌，或如下褐螺菌属的混合物，如微黄褐螺菌和莫氏褐螺菌。红螺菌属和/或褐螺菌属的组合物也包括在本发明中。
优选地，红螺菌属和/或褐螺菌属制剂包括深红红螺菌和/或莫氏褐螺菌，还更优选模式种深红红螺菌菌株ATCC 11170(菌株DSM 467)或菌株ATCC 25903和/或莫氏褐螺菌菌株DSM 120。(ATCC，AmericanType Culture Collection；DSMZ，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)。
在本发明的实施方案中，红螺菌属和/或褐螺菌属制剂可以包含20-100％(w/w)，优选40-100％(w/w)，甚至更优选60-100％(w/w)，最佳为80-100％(w/w)的来自红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞物质，所述细胞物质优选地为膜组分或活的或冻干的整个细胞。另外，根据所选制剂的制备方法，制剂可以包含其它组分。例如，制剂还可以包含水，或者在冻干制剂的情况下，可以包含甘油或蔗糖。
在一个优选实施方案中，红螺菌属和/或褐螺菌属的冻干制剂与填充材料如微晶纤维素(MCC)或甘露糖醇、粘合剂如羟丙基纤维素(HPC)、和/或滑润剂如硬脂酸、和/或其它赋形剂混合，并被压丸成为干粉，或以不同的方法制备应用。
这种红螺菌属和/或褐螺菌属制剂非常适合用作药物或药物制剂，以降低血浆胆固醇水平，优选降低人血浆胆固醇水平。制剂还可以包含活红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞、或死细胞、或细胞残留物等。
根据本发明，制剂的替代实施方案是同样可行的。例如，制剂可以被提供作为含固体组分的流体制剂，所述固体组分被悬浮、分散或乳化在含水流体中。根据本发明，这种组合物可以被直接用作制剂，或在替代实施方案中加工成食品增补剂。
在本发明中，食品增补剂是指如下配方，它除了正常饮食之外可以被消费，并且包含正常饮食中不会出现的、或以少量或不足量出现的组分，并且希望充分地消费这些组分或增加对这些组分的消费。优选地，食品增补剂由那些适合人类消费的组分组成。因此，本发明所指的食品增补剂应优选具有组织、味道和气味，并具有营养价值，这使添加剂适合人类的消费。
在本发明的实施方案中，具有降低胆固醇性质的食品增补剂包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
根据本发明，食品增补剂可适当地包含0.1-99.9％(w/w)的红螺菌属制剂。优选地，食品增补剂包含10-90％(w/w)、甚至更优选30-75％(w/w)的红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
为了制备适合消费的含红螺菌属和/或褐螺菌属制剂的食品增补剂，可以加入组分以改善如组织、味道或气味。因此，根据本发明，食品增补剂可以包括(附加的)蛋白质源、糖类、脂肪、维生素、矿物质、电解质、痕量元素和其它合适的组分，所以该食品增补剂自身可以用作营养食品。
作为蛋白质源，适用于营养配方内的每种蛋白质和它们的混合物可以在本发明的食品增补剂中使用。这类蛋白质包括例如动物蛋白，如乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清粉末、卵蛋白、卵白蛋白、酪蛋白、或乳白蛋白，和植物蛋白如大豆蛋白、大豆粉、或来自豆奶的蛋白。对于选择所用的蛋白质源，蛋白质的生物值构成了重要标准。例如，酪蛋白酸盐包括酪蛋白钙，也包括乳清、乳白蛋白、卵白蛋白和所有的卵蛋白，它们都是具有很高生物值的蛋白质，因为它们包含大量必需氨基酸。
适用于本发明食品增补剂的糖类可以是简单短链糖类，如单糖和二糖，也可以是多糖，或两者的混合物。糖类可以根据它合适的器官感觉性质来选择。复合糖适合用作食品纤维。
在一些实施方案中，本发明的食品增补剂可包含简单糖类和复合糖的混合物。可以使用作为脂肪的所有可食用油和脂肪。
依照卫生管理机构的规定，可以加入维生素和矿物质，它们可以包括被以上机构认可的所有维生素和矿物质，例如维生素A、B1、B2、B12、C、D、E、K、叶酸、烟酸、泛酸和维生素H。可以加入矿物质如铁、锌、碘、钙、镁、铬和硒。
电解质如钠、钾、氯、和痕量元素及其它添加剂也形成了本发明食品增补剂的一部分。这些组分如果存在，优选地在推荐浓度下使用它们。另外，本发明的食品增补剂可以包含改善组织、色彩和香味的组分、芳香物质、香料、填充物、乳化剂、稳定化合物、防腐剂、抗氧化剂、纤维，和其它增补剂如氨基酸、胆碱、卵磷脂和脂肪酸等。这种组分的选择取决于配方、设计和偏爱。可以加入的这些组分的量为技术人员所知，而加入量的选择可以通过考虑儿童和成人的推荐日用量(RDA)为指导。
可以加入乳化剂以稳定最终产品。可接受的乳化剂的例子为卵磷脂(如大豆或鸡蛋)、和/或单酸甘油酯和甘油二酯。作为稳定剂，可以使用如角豆树胶(carobe)、瓜耳豆或角叉菜聚糖。
可以加入防腐剂以提高产品的储存期限。优选地，使用的防腐剂有例如山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钾、苯甲酸钠、或EDTA二钠钙。
除了以上提到的糖类之外，可以将天然或合成的增甜剂如糖类、环拉酸盐、天冬甜素、丁磺氨钾和/或山梨糖醇加入到食品增补剂中。
待消费的食品增补剂的量可以在大小上变化，并且不必受建议用量中提到的用量的限制。术语“食品增补剂”不是指受限于指定重量，或食品增补剂的指定剂量。
本发明的食品增补剂组合物原则上可以采取任意适合人类或动物消费的形式。在优选实施方案中，增补剂为干粉，该干粉适合在含水流体如咖啡、茶、肉汤或果汁中悬浮、分散或乳化。为此，粉末可以在分配器内提供。
在一个替代优选实施方案中，增补剂从干粉开始配制成片剂形式。为此，本发明食品增补剂的组合物可以适当地加入填充物如微晶纤维素(MCC)和甘露糖醇，粘合剂如羟丙基纤维素(HPC)、润滑剂如硬脂酸和其它赋形剂。
本发明的食品增补剂也可以作为流体提供，其中固体组分已经被悬浮、分散或乳化。这种组合物可以直接混合入食品中，或可以例如被挤压和制成颗粒或其它形式。
在替代实施方案中，食品增补剂可以配制成固体形式，如条状、饼状或辊状。
优选地，食品增补剂被配制成经口消费，可能与可接受的载体如胶囊、片剂、与水混溶的粉末、或可以接受的给药用的其它形式组合，但是也可以被加工成食品。
本发明的其它方面涉及制备本发明的制剂、食品增补剂或食品的方法。
一种制备本发明制剂的方法可以适当地包括必需的步骤，以培养一个或多个红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞，收获所述培养物，并且将所述培养物的细胞加工成制剂。
其中，这些方法的细节描述于下述的实施例中。本领域的技术人员会理解，可以使用各种替代方法。
在培养红螺菌属和/或褐螺菌属细胞的过程中，应用了厌氧和光养条件。作为碳源，使用了各种有机营养素。非常适合红螺菌属和/或褐螺菌属细胞的培养基和生长条件为例如“Segers和Verstraete培养基”(Segers and Verstraete，1983)，使用乳酸(约2.7g/L)为碳源，pH为约6.8-6.9，温度为25-37℃，优选地，在来自例如条形照明(光强300μM量子.m-2.s-1)的恒定光强和厌氧条件下，适合所涉及的微生物的特定要求。其它适于培养红螺菌属和/或褐螺菌属的培养基为例如“改性的红螺菌科培养基(DSMZ培养基#27，DSMZ GmbH，Braunschweig，Germany)，或Cens培养基(DSMZ培养基#748)。适合培养的细胞密度为0.01-50mg/mL，优选1-5mg湿重/mL。
细胞可以在如下条件下同等地厌氧生长30℃下，在包含培养基的1升烧瓶中，所述培养基由3.1ml/l 60％DL-乳酸盐溶液、3g/l细菌蛋白胨和3g/l自来水中的酵母抽提物构成，培养基的pH为6.8，使用40w的3盏钨灯以平均光辐射强度50μM量子.m-2.s-1进行照射。生长3天后，在660nm下的光密度总计达3.5(1.2g/kg干重)。
一旦细胞已经达到合适的细胞密度，通过从生长培养基中分离、或通过如离心分离或过滤来收获，就可以将这些细胞加工成本发明制剂。浓缩细胞团可以直接用作本发明的制剂，或在进一步加工后用作本发明的制剂。
将红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞物质加工得到可用制剂的其他步骤，可以包括例如洗涤步骤，但是也可以包括通过提取或冻干来进一步加工细胞。
将红螺菌属和/或褐螺菌属的细胞物质加工得到可用制剂的另一步骤，可以包括细胞的超声处理，接着通过离心分离将膜物质从细胞质物质中分离，接着进行进一步的洗涤和再离心分离步骤。本发明的食品增补剂可以适当地用来减少肠的胆固醇吸收，从而减少血浆胆固醇水平。
本发明的另一实施方案包括在食品中应用具有降低胆固醇性质的食品增补剂。
一种制备降低胆固醇的食品的方法包括掺合了食品增补剂的食品的制备。这种方法可包括如下步骤，其中食品首先以普通方式制备，接着将红螺菌属和/或褐螺菌属制剂加入到所制的食品中。同样，在制备过程中，将红螺菌属和/或褐螺菌属制剂加入到食品中也是可行的。
本发明的具有降低胆固醇性质的食品特征性地包含0.1-20％(w/w)、优选1-10％(w/w)的上述食品增补剂。
本发明最终包括用于药物的红螺菌属和/或褐螺菌属制剂，以降低血浆胆固醇水平。优选地，这种制剂应包括菌种深红红螺菌和/或莫氏褐螺菌。
现在，将用下列实施例说明本发明，这不应解释为以任何方式来限制本发明。
实施例实施例1.深红红螺菌的制备深红红螺菌菌株ATCC 25903用于实验中所用生物量的制备。冻干细胞在培养基R8AH(ATCC培养基550)中被再水化，在“Segers和Verstraete培养基”中(见上)培养，使用乳酸(2.7g/L)作为碳源，pH为6.9±0.1。用于实验的生物量的最终培养在20L的生物反应器中进行，培养基相同，在30±1℃下，pH为6.8±0.1，恒定光强(条形照明；300μM量子.m-2.s-1)，在厌氧条件下。培养5天后，利用连续离心分离收获生物量(3.4g湿重/L)，储存于-40℃下并冻干。
实施例2.制备深红红螺菌的另一种方法为了检查培养条件对降低胆固醇水平的效力的影响，深红红螺菌ATCC 25903也在30℃下、在包含培养基的1升烧瓶中厌氧生长，所述培养基由3.1ml/l 60％DL-乳酸盐溶液、3g/l细菌蛋白胨和3g/l自来水中的酵母抽提物构成。培养基的pH为6.8。烧瓶在培养箱(NewBrunschwick Scientific，modle G 25)中在磁力搅拌器(Variomagmultipoint HP15)上培育。烧瓶使用3盏40W钨灯、在平均光子辐射强度50μM量子.m-2.s-1下照射。生长3天后，在660nm下光密度总计为3.5(1.2g/kg干重)，通过离心分离收获的细胞达6500g，用脱矿质水洗涤并冻干(VirTis freezemobile 24)。以这种方式培养的深红红螺菌和按实施例1所述培养的深红红螺菌细胞，对血浆胆固醇水平的影响相同，这些深红红螺菌用于大部分实施例中。
实施例3.另一个深红红螺菌菌株的应用另一个深红红螺菌菌株，DSM 467，在25℃下、在如实施例2所述相同的培养基中以同样的方式厌氧生长。生长3天后，在660nm下的光密度为4.5(干重1.4g/kg)，收获细胞，并用如实施例2所述的方法干燥。菌株DSM 467与菌株ATCC 25903一样，对血浆胆固醇水平的影响相同，该菌株在绝大部分实施例中使用。
实施例4.菌种莫氏褐螺菌的应用另一种光合细菌，莫氏褐螺菌DSM 120在25℃下、在如实施例2所述的厌氧条件下、用ATCC 550培养基、在1升烧瓶中生长。生长3天后，在660nm下光密度为4.0(干重1.2g/kg)，收获细胞，并用如实施例2所述的方法干燥。
实施例5.深红红螺菌对喂食大鼠的影响雄性Wistar大鼠以半合成的大鼠食物喂食，满足营养要求(如参考文献9所述)(Hope Farms，Woerden，the Netherlands)。第一组8只大鼠喂食这种基本食物。第二组8只大鼠喂食同样的食物，但现在另外包含10％(w/w)的冻干深红红螺菌(代替蔗糖)。这两组都消费了近似相同量的食物(31±7g/天)，经一段时间显示相同的体重增加。8周后，除了血浆胆固醇和血浆甘油三酯，两组中测量的所有临床化学参数(血浆葡萄糖、尿酸、脲、肌酸酐、GOT、GTP、血细胞比容、血红蛋白、尿糖和蛋白质)都相似。喂食含深红红螺菌食物的这组的血浆胆固醇明显降低(1.2±0.1mmol/L对1.6±0.1mmol/L；t-检验，p＜0.0001)，血浆甘油三酯也如此(0.5±0.1mmol/L对1.4±0.6mmol/L；p＜0.001)(图1)。
通过快速蛋白质液相色谱法(fplc，KTA system ofPharmacia-Amersham)分离血浆脂蛋白显示，胆固醇和甘油三酯的减少是由于血浆LDL级分的减少，而HDL级分在喂食深红红螺菌的动物中保持不变(图2)。因此，深红红螺菌引起的血浆胆固醇下降特别地归因于LDL胆固醇的下降。用于测量胆固醇和甘油三脂的方法和通过fplc分离脂蛋白的方法，已由van Vlijmen等人(1996)和Post等人(2000)描述。
实施例6.深红红螺菌对喂食小鼠的影响10只C57Black/6小鼠喂食正常的半合成小鼠食物7天。随后，5只小鼠以同样的食物再喂食7天，而剩下的5只小鼠喂食同样的小鼠食物7天，但是现在包含10％(w/w)的深红红螺菌。两组之间食物摄取量并无明显不同，平均为2.6-2.8g/小鼠/天。7天后，喂食深红红螺菌的小鼠的血浆胆固醇水平为1.52±0.07mmol/L，明显低于对照组的血浆胆固醇水平(1.86±0.15mmol/L；t-检验，p＝0.003)(图3)。血浆甘油三酯水平不变。
实施例7.在喂食“西方类型”食物小鼠内深红红螺菌的影响10只C57Black/6小鼠以半合成食物、所谓的“西方类型”的食物、含15％(w/w)脂肪和0.25％(w/w)胆固醇的食物喂食3周(Nishina等人，1990)。随后，5只小鼠以同样的食物喂食7天，而另外5只小鼠喂食同样的食物，但是包含另外的10％(w/w)的深红红螺菌(某种胆固醇也加入这种食物中以保持胆固醇含量为0.25％)。7天后，对照组中胆固醇水平为3.07±0.18mmol/L，而喂以含深红红螺菌食物的这一组的胆固醇水平为2.26±0.21mmol/L(t-检验，p＝0.003)(图4)。血浆甘油三酯没有下降。通过fplc分离脂蛋白显示，LDL胆固醇实际上已经从喂食含深红红螺菌的西方类型食物的小鼠血浆中消失，而HDL胆固醇显示两组之间没有不同(图5)。
实施例8.在喂食“西方类型”食物的转基因APOE*3Leiden小鼠内深红红螺菌的影响在这个实验中使用了小鼠，其中用于载脂蛋白E3的所谓Leiden突变(APOE*3Leiden)的人基因通过转基因掺入。由于这种转基因变化，这些所谓的APOE*Leiden小鼠具有人化脂蛋白的分布图，且特别适合研究化合物对脂蛋白新陈代谢的影响(van Vlijmen et al，1996；1998)。
研究计划如下几组小鼠喂食含0.25％(w/w)胆固醇的“西方类型”的食物(见上)5周。这种食物将它们的血浆胆固醇水平提高至13-14mmol/L。随后，根据它们的血浆胆固醇水平，将小鼠随意分组，每组6只小鼠。这几组喂食同样的食物，但包含另外加入的0、0.625、1.25、2.5、5或10％(w/w)的冻干深红红螺菌。通过加入所需的胆固醇，使食物的胆固醇含量保持在0.25％。
在该实验中，对体重和食物摄入量进行监控。当饮食改变后，每周取血以确定血浆胆固醇和甘油三酯的水平。同样地，利用fplc按组确定在合并样品中的血浆脂蛋白图案。另外，以组为基础，每周采集粪便。3周后，测量喂食0％和10％的深红红螺菌的小组的VLDL分泌物(最后实验)。然后，喂食0.625％深红红螺菌的组改成喂食含0％深红红螺菌的食物，喂食2.5％的深红红螺菌的组改成喂食5％的深红红螺菌，喂食5％的深红红螺菌的组改成喂食10％的深红红螺菌，以替代死亡的两组。又1周后，再次从剩余的四组中采集血样。结果总结如下■喂食5％或10％深红红螺菌的组内，血浆胆固醇水平明显下降。
■在10％深红红螺菌的组中，1周后，胆固醇的下降已经非常明显(p＜0.0001)，2周后，在5％深红红螺菌的组中也是这样(p＜0.001)，这样保持3周(图6)。
■这种胆固醇水平降低是由于VLDL和LDL级分中胆固醇的下降，而HDL级分中胆固醇的量没有变化(图7)。
为了确定胆固醇的下降是否是由于胆固醇合成的抑制，测量了7-烯胆烷醇(胆固醇合成途径的副产品)的血浆浓度(Kempen et al，1988)。在喂食0、5或10％深红红螺菌的组之间，血浆7-烯胆烷醇水平没有明显不同；但是，如上所述，在5％和10％的组中，血浆胆固醇水平明显下降(图8)。在喂食深红红螺菌的小鼠中，血浆7-烯胆烷醇与血浆胆固醇的比率甚至明显地升高(ANOVA＜p＜0.026)。因为(相对的)7-烯胆烷醇浓度是胆固醇合成速度的有效反映(Kempen等人，1988)，可以得出结论在喂以5％和10％深红红螺菌的组中，血浆胆固醇的降低不是由于胆固醇合成速度的下降而引起的。
Camposterol和β-谷固醇的血浆水平(这两种固醇只出现于植物中，因此只有在被肠摄取后存在于血浆中)在喂食5％或10％的深红红螺菌的组中明显降低(图9)。然而，β-谷固醇与胆固醇的血浆浓度比率没有明显变化(AVNOVA，p＝0.26)；camposterol与胆固醇的血浆比率也没有变化(AVNOVA，p＝0.98)。因为胆固醇的血浆浓度是由它的合成速度和被肠吸收的速度确定的，所以这些比率保持相似(camposterol和β-谷固醇的比较，Miettinen等人，1990)或升高(7-烯胆烷醇)的事实证明血浆胆固醇浓度的下降不能归因于胆固醇合成的下降，而应归因于肠腔对固醇吸收的下降。
相对于对照组，在喂食10％深红红螺菌的组中，通过肝脏合成的VLDL量(按Post等人，1990所述测量)没有明显的不同(图10a，b)。虽然在注射Triton WR1339后，血浆甘油三酯浓度在喂食10％深红红螺菌的组中比对照组中增加得更快(图10a)，但是这应归因于在喂食深红红螺菌的小鼠中VLDL级分中的较高量的甘油三酯(图10b)，而不归因于通过肝脏产生的VLDL粒子分泌物的上升。
在用深红红螺菌处理的小鼠中，中性固醇(尤其是胆固醇)的粪便排泄物增加(图11)，而胆汁酸的粪便排泄物也略有增加(图12)。因此，所有固醇(中性固醇加上胆汁酸)的粪便排泄物一起增加了(图13)(也可见正文表1a和b)。
实施例9.APOE*3Leiden小鼠中深红红螺菌的膜组分对血浆胆固醇水平的影响将5g冻干的深红红螺菌悬浮于25ml水中，在Branson SonifierB-12中全强度下超声处理1分钟。然后，超声处理液在21,000rpm下离心分离，上清液与颗粒分离。颗粒被再悬浮并再次离心分离。颗粒和上清液被分别混入含0.25-10％(w/w)胆固醇的W-食物(如上所述)中，假设颗粒和上清液都等价于5g冻干深红红螺菌(即原材料)。6只APOE3*Leiden小鼠为一组的几组小鼠被喂以W食物、或还含颗粒(膜)物质的W食物、或还含细胞质物质的W食物，时间为2周。2周后，喂食对照W食物的小鼠中，血浆胆固醇为15.7±1.6mmol/L；喂以还含细胞质物质的W食物的小鼠中，血浆胆固醇为14.4±2.1mmol/L，而喂以还含膜物质的W食物的小鼠中，血浆胆固醇为6.7±0.9mmol/L，相对于对照组明显下降了57％(t-检验；p＜0.001)。
实施例10.莫氏褐螺菌对APOE*3Leiden小鼠的血浆胆固醇水平的影响11只APOE*3Leiden小鼠被喂以含0.25％(w/w)胆固醇的“西方类型”食物(见上)。该食物将它们的血浆胆固醇水平提高至9±3mmol/L。随后，根据它们的血浆胆固醇水平，小鼠被任意分组，每组6只。有2组喂以同样的食物，但包含另外加入的0或10％(w/w)的冻干莫氏褐螺菌，如以上所述的深红红螺菌。喂食10天后，没有喂以莫氏褐螺菌的组中，血浆胆固醇平均为10±4mmol/L(配对t-检验不明显)；饲料中含10％莫氏褐螺菌的组中，血浆胆固醇平均为5±2mmol/L(配对t-检验p＜0.05)。
总结这些实验表明，对于APOE*3Leiden小鼠，将5％(w/w)或10％(w/w)的深红红螺菌加入“西方类型”食物中，使血浆胆固醇水平明显下降。这种下降
1.可完全归因于在(促动脉粥样化)VLDL和LDL粒子中携带的胆固醇的下降，而(抗动脉粥样化)HDL胆固醇保持不变；2.不是由胆固醇合成下降所造成的，因为血浆7-烯胆烷醇的水平没有改变，而由肝脏合成/分泌的VLDL也没有改变；3.不归因于胆汁酸排泄物的增加，这只是略有增加；而是4.因此，最有可能归因于肠对固醇吸收的下降，如粪便中胆固醇排泄物的增加(见正文表1a)、和血浆camposterol和β-谷固醇浓度的下降所反映的。
5.是由膜的细胞物质引起的，而不是由可溶的细胞质的细胞物质所引起的。
胆固醇下降效应是由在不同条件下培养的深红红螺菌所引起的，是由至少两种不同的深红红螺菌菌株(ATCC 25903和DSM 467)所引起的，也是由相关菌种莫氏褐螺菌所引起的。
所有数据表示为μmol/100g小鼠/天
(a)和(b)指正文表1a。
参考文献1.Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH.Bacterial nomenclature up-to-date.Accessed December 6th，2003.http//www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm.
2.Euzéby JP.List of bacterial names with standing in nomenclature.
Accessed December 6th，2003.
http//www.bacterio.cict.fr/qr/rhodospirillum.html andhttp//www.bacterio.cict.fr/qr/phaeospirillum.html.
3.Hassel CA.Animal modelsnew cholesterol raising and loweringnutrients.Curr Opin Lipidol 1998；97-10.
4.Imhoff JF，Trüper HG.The genus Rhodospirillum and relatedgenera.Chapter 101 inBalows A，Trüper HG，Dworkin M，Harder W，Schleifer K-H.The Prokaryotes.A Handbook on the Biology of BacteriaEcophysiology，Isolation，Identification，Applications.Springer-Verlag，NewYork/Berlin/Heidelberg，Volume III，2ndedition 1992，pp.2141-2155.
5.Imhoff JF，Petri R，Suling J.Reclassification of species of thespiral-shaped phototrophic non-sulfur bacteria of the alpha-Proteobacteriadescription of the new genera Phaeospirillum gen.nov.，Rhodovibriogen.nov.，Rhodothalassium gen.nov.and Roseospira gen.nov.as well astransfer of Rhodospirillum fulvum to Phaeospirillum fulvum comb.nov.，ofRhodospirillum molischianum to Phaeospirillum molischianum comb.nov.，of Rhodospirillum salinarum to Rhodovibrio salexigens.Int J SystemBacteriol 1998；48793-798.
6.Kempen HJ，Glatz JF，Gevers Leuven JA，van der Voort HA，KatanMB.Serum lathosterol concentration is an indicator of whole-bodycholesterol synthesis in humans.J Lipid Res 1988；291149-1155.
7.Miettinen TA，Tilvis RS，Kesniemi YA.Serum plant sterols andcholesterol precursors reflect cholesterol absorption and synthesis involunteers of a randomly selected male population.Am J Epidemiol 1990；13120-31.
8.Nishina PM，Verstuyft J，Paigen B.Synthetic low and high fat dietsfor the study of atherosclerosis in the mouse.J Lipid Res 1990；31859-869.
9.Nutrient Requirements of Laboratory Animals.National Academyof Sciences publication#10，3rd revised edition.Washington DC，1978.
10.Post SM，de Roos B，Vermeulen M，Afman L，Jong MC，Dahlmans VEH，Havekes LM，Stellaard F，Katan MB，Princen HMG.Cafestol increases serum cholesterol levels in apolipoprotein E*3-Leidentransgenic mice by suppression of bile acid synthesis.Arterioscler ThrombVasc Biol 2000，201551-1556.
11.Segers L，Verstraete W.Conversion of organic acids to H2 byRhodospirillaceae grown with glutamate or dinitrogen as nitrogen source.Biotechnol Bioeng 1983；25283-2853.
12.Van Vlijmen BJM，van′t Hof HB，Mol MJTM，van der Boom H，van der Zee A，Frants RR，Hofker MH，Havekes LM.Modulation of verylow density lipoprotein production and clearance contributes to age andgender-dependent hyperlipoproteinaemia in apolipoprotein E3-Leidentransgenic mice.J Clin Invest 1996；971184-1192.
13.Van Vlijmen BJ，Pearce NJ，Bergo M，Staels B，Yates JW，GribbleAD，Bond BC，Hofker MH，Havekes LM，Groot PH.ApolipoproteinE*3-Leiden transgenic mice as a test model for hypolipidaemic drugs.
Arzneimittelforschung 1998；48396-402.
权利要求
1.用作药物的红螺菌属(Rhodospirillum spp.)和/或褐螺菌属(Phaeospirillum spp.)制剂。
2.如权利要求1所述的制剂，包括活红螺菌属和/或褐螺菌属、或所述细菌的膜组分。
3.药物制剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂、和一种或多种赋形剂。
4.降低血浆胆固醇的药剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
5.红螺菌属和/或褐螺菌属制剂的用途，用于制备降低血浆胆固醇的药物。
6.具有降低胆固醇性质的食品增补剂，包括红螺菌属和/或褐螺菌属制剂。
7.如权利要求6所述的食品增补剂，其中所述制剂包括膜组分、或活的或冻干的细菌。
8.具有降低胆固醇性质的益生菌，包含活红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂。
9.食品，包括权利要求6或7的食品增补剂。
10.制备红螺菌属和/或褐螺菌属制剂的方法，包括将红螺菌属和/或褐螺菌属的一个或多个细胞培养成多细胞培养物，收获所述培养物，并将所述培养物的细胞加工成制剂。
11.如权利要求10所述的方法，包括将所述培养物的细胞加工成活红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂。
12.制备权利要求6或7的食品增补剂的方法，包括使权利要求1或2的制剂适合消费。
13.制备权利要求9的食品的方法，包括将权利要求6或7的食品增补剂掺合到食品中。
全文摘要
本发明涉及降低胆固醇的制剂，尤其是用作降低血液胆固醇水平的药物的细菌制剂。本发明特别提供了具有降低胆固醇效应的红螺菌属和/或褐螺菌属的制剂、含所述制剂的食品增补剂和食品、及其制备和使用的方法。
文档编号A23L1/30GK1738630SQ200380108626
公开日2006年2月22日 申请日期2003年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者约瑟夫斯·简·埃迈斯, 克里斯托夫·拉瑟尔 申请人:荷兰应用科学研究组织