专利名称：一种乳清蛋白降胆固醇肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乳清蛋白降胆固醇肽及其制备方法，属于生物技术领域，涉及的是一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法以及分离纯化技术。
背景技术：
随着人们生活的日益改善，各种富贵病呈现递增趋势，就胆固醇而言，高胆固醇是对人类健康危害极大的一种慢性疾病，医药业人工合成的药物可能会产生某些副作用，而从蛋白酶解液中提取的降胆固醇肽安全性极高，无毒副作用。其优势在于对于胆固醇值正常的人，没有降低胆固醇的作用，而对于胆固醇值高的人具有降低胆固醇的作用；对胆固醇值正常的人，在食用高胆固醇含量的蛋、肉、动物内脏等食品时，也有防止血清胆固醇值升高的作用；在总胆固醇中，乳清蛋白源降胆固醇肽所降低的胆固醇是对人体有害的低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)，它不降低对人体有益的高密度脂蛋白(HDL)的数 值，除降胆固醇功能外，往往同时具有免疫促进、抗凝血、易消化吸收、抗肿瘤的功能，而且这种肽是经食用级酶在温和条件下获得的，易作为功能因子添加到各类食品中，有着良好的市场前景。Nagaoka. S通过小鼠动物实验表明，牛乳清蛋白源生物活性肽比大豆蛋白或酪蛋白具有更强的降低血液胆固醇的活性，并从乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液中成功地分离出一种五肽IIAGL F(71-75),据目前已有的相关文献可知，乳清蛋白降胆固醇肽的分子量主要集中在2000u左右。本发明采用胰蛋白酶水解，利用其专一性切割特点，尤其对精氨酸、赖氨酸的羧基端肽键有强切割专一性来定点酶解乳清蛋白，制备乳清蛋白水解液，据模拟人体胃肠道试验研究表明胰蛋白酶较其他酶类的水解产物在人体中的稳定性更强。并采用了多级色谱对水解液进行分离纯化，比以往的单一分离得到的多肽纯度和抑制率更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法。本发明所使用的乳清蛋白粉是脱盐乳清粉，其蛋白质含量不少于12. 7%，灰分低于
5.6%，乳糖含量为总干物质的80%左右。本发明制备乳清蛋白降胆固醇肽的方法，其步骤如下
(1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉；
(2)水解液(多肽)离心，取上清液，冷冻干燥，得到粗多肽；
(3)将水解液(多肽)经离子交换树脂脱盐处理，进而纯化精制；
(4)用凝胶过滤色谱(S^)HadexG-15)对水解的肽进行分离纯化；
(5)使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对步骤(4)中得到的HMG-CoA还原酶抑制率高的洗脱组分进行进一步分离纯化。所述步骤(I)中，乳清蛋白粉以脱盐乳清蛋白粉为原料，按照底物质量浓度5%将其水化，65°C水浴加热20 min，使乳清蛋白变性，冷却至40°C，调至pH为8. 0，E/S (酶与底物比)为0. 06，水解时间为6h。所述步骤(2)中，酶解结束后加入适量HCl调制pH=4. 6左右，使未水解的蛋白质沉淀，90°C保持10分钟灭酶活，然后冷却至室温在4500r/min离心，取上清液，冷冻干燥得多肽粗制品。所述步骤(3)中，取(2)的冷冻干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用离子交换树脂进行脱盐，在流速为45ml/h条件下，乳清蛋白水解液总的氮回收率为80%以上，脱盐率为80%以上，并且脱盐前后HMG-CoA还原酶的抑制率无影响。所述步骤(4)中，将水解的多肽溶液利用SepHadex G-15进行降胆固醇肽的分离，洗脱液0. Olmol/LHCl溶液，流速65ml/h，检测波长220nm，上样量450mg，得到吸收组分峰，通过测HMG-CoA还原酶的抑制率，收集抑制率高的组分。 所述步骤(5)中，取(4)中抑制率较高的组分用反相高效液相色谱(RP -HPLC)进一步进行分离纯化，色谱柱C18色谱柱，缓冲液0. 15%三氟乙酸溶液，检测波长220-280nm，洗脱方式梯度洗脱，流速lml/h，收集HMG-CoA还原酶抑制率高组分的洗脱峰，进行冷冻干燥，得粉末状乳清蛋白降胆固醇肽。本发明所具有的优点
(1)所选原料本身已为脱盐乳清粉，使后续的离子交换树脂脱盐得到的乳清蛋白肽更加精制；
(2)本发明制备的乳清蛋白降胆固醇肽经过离子交换树脂、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等多级色谱进行分离纯化使降胆固醇肽的纯度大大提高，其HMG-CoA还原酶抑制率可高达百分之二十以上；
(3)本发明采用凝胶色谱进行降胆固醇肽的分离纯化时选择0.01mol/L的HCl溶液作为洗脱液，与传统的盐缓冲溶液相比，其优点是不会在洗脱样品中带入其它盐离子，消除了某些带电离子与SepHadex凝胶引起的相互作用，也不会破坏肽段的生理活性，而且HCl易挥发，因此在洗脱液蒸发浓缩的同时，即可被除去；
(4)水解所用蛋白酶为胰蛋白酶，其具有专一性切割特点，能获得我所需要的理想肽段，并且在人体模拟胃肠道时其使降胆固醇肽稳定性较其它酶类更具优势。具体实验方式 实例I
原料为脱盐乳清粉，在0-4°C下贮存。将乳清蛋白粉按5%进行水化，在65 °C保持20分钟使乳清蛋白变性，然后降至40°C，调pH为8. 0，按酶与底物质量浓度比为0. 06加入胰蛋白酶后在磁力搅拌器下进行水解，时间为6h，在90°C下保持IOmin灭酶活，冷却后在4500r/min离心，将上清液进行冷冻干燥得到乳清蛋白多肽粗制品，取乳清蛋白粗制肽配成10mg/ml的多肽溶液，然后以45ml/h的流速进离子交换树脂柱，收集流出液，将流出液通过SepHadex G_15进行分离纯化,所用洗脱液为0. 0lmol/L的HCl，收集到的流出液应用分光光度法进行HMG-CoA还原酶抑制率的测定，从中选出抑制率最高的洗脱峰进入下一步反相高效液相色谱进行分离纯化，所用的缓冲溶液为0. 15%三氟乙酸溶液，得到不同的洗脱峰，同上进行抑制率测定，收集抑制率最高的洗脱峰组分冷冻干燥得降胆固醇肽产品。上述SepHadex G-15分离得到的乳清蛋白降胆固醇肽HMG-CoA还原酶抑制率的测定，如表I所示
权利要求
1.一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法，按照如下步骤完成 (1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉； (2)将(I)中得到的水解液进行离心，取上清液，冷冻干燥，得到粗多肽冷冻干燥； (3)将水解液(多肽)经离子交换树脂脱盐处理，进而纯化精制； (4)用凝胶过滤色谱(S^)HadexG-15)对水解的肽进行分离纯化； (5)使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对步骤(4)中得到的HMG-CoA还原酶抑制率高的洗脱组分进行进一步分离纯化。
2.根据权利要求I所述一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法，其特征是步骤(I)中乳清蛋白采用的是脱盐乳清粉，其蛋白质含量不少于12. 7%，灰分低于5. 6%，乳糖含量为总干物质的80%左右，水解条件E/S为O. 05 O. 06，ΡΗ=8. 0 9· 0，时间为6 8h，温度37 40°C。
3.根据权利要求I所述一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法，其特征是步骤(I)中得到的多肽水解液在90°C灭酶IOmin,4500r/min下离心IOmin,保留上清液。
4.根据权利要求I所述一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法，其特征是将步骤(2)的冷冻干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用离子交换树脂进行脱盐，此过程只是减少水解液中盐的含量，在流速为45ml/h条件下，乳清蛋白水解液总的氮回收率为80%以上，脱盐率为80%以上。
5.根据权利要求I所述一种乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法，其特征是将水解的多肽溶液利用SepHadex G_15进行降胆固醇肽的初步分离，收集流出液，采用分光光度法对其HMG-CoA还原酶抑制率进行测定，收集第二组分洗脱峰进行下一个反相高效液相色谱进一步进行分离纯化，收集第四组分洗脱峰，进行冷冻干燥，得粉末状乳清蛋白降胆固醇肽。
全文摘要
本发明旨在水解乳清蛋白，研究其水解机制以及分离纯化技术，以制备一种乳清蛋白降胆固醇肽。该制备水解用具有专一切割性的胰蛋白酶，获得所需肽段优势更强。采用多级色谱进行分离纯化，所得组分纯度以及HMG-CoA还原酶抑制率更高，在凝胶过滤时所用洗脱液为HCl，与以往的盐类洗脱液相比，消除了某些带电离子与SepHadex凝胶引起的相互作用，也不会破坏肽段的生理活性，而且HCl易挥发，因此在洗脱液蒸发浓缩的同时，即可被除去。本发明所得产品具有安全性极高，无毒副作用的优点，易作为功能因子添加到各类食品中，有着良好的市场前景，且其纯度、抑制率均达到相当高要求，可用于食品和医药行业。
文档编号C07K1/20GK102816822SQ201210336978
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者李晓东, 张金凤, 马丽媛, 王妍 申请人:东北农业大学