专利名称:一种乳清蛋白降血压肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳清蛋白降血压肽及其制备方法与应用。
技术背景
高血压是当今困扰全球的一种慢性心血管疾病，具有潜伏期长、并发症多的特点， 是冠心病、心肾功能衰竭的最主要发病因素。近年来，全球患高血压人数逐年上升，且呈年轻化趋势，高血压已经成为全球性的重大公共卫生问题。高血压患者只有通过长期药物治疗，才能有效地控制病情发展。目前用于降高血压的药物都有一定的副作用，积极研究天然食物中的降血压功能因子，开发来源于食物中的安全、天然、高效的降压肽产品已成为今后高血压非药物治疗的重要部分。如中国专利200810167798. 3，于雪初、罗永康从羊血红蛋白中制得了 ACE抑制率达90%的多肽产品；中国专利200710071251. 9，王金玲等采用弹性蛋白酶、胃蛋白酶复合酶解带鱼脊骨从而获得一种降血压肽。
乳清蛋白富含必需氨基酸、生物学效价高，越来越受到人们重视。乳清蛋白包含有多种生物活性序列，用适当的蛋白酶水解并从乳清蛋白中释放出来之后，可成为具有抑菌、 抗氧化、降血压等生理活性的肽段(Aubois等，1991 ；欧洲专利公开号4745506)。其水解产物的降血压活性已经得到了广泛的研究。新西兰的拉尔夫-克里斯蒂安 施洛特豪尔在中国专利01818725中利用多种酶水解乳清浓缩蛋白，得到了较高ACE抑制率的降血压多肽； 罗永康等在中国专利200410009910. 2中从众多酶中筛选出碱性蛋白酶为酶解乳清蛋白制备ACE抑制肽的最适蛋白酶，并通过后续脱盐、干燥等方式获得降血压产品。
从目前已有的相关研究报道发现，国内外主要采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解乳清蛋白制备降血压肽，传统的酶解过程往往要加入大量NaOH 以维持PH稳定，导致酶解液中盐份过高。而对人体来说盐份过量是引发高血压疾病的重要原因之一，食盐能大量吸收水分，引起钠、水潴留，增加机体的血容量，使心输出量增多， 加重心脏负荷，从而引发高血压病。所以酶解液中盐份过高不仅会影响其最终肽产品的口味和生物学活性，还会给人体带来危害。因此，必须对酶解液进行脱盐处理。因活性肽的分子量多在1500Da以下，不易与盐份分开，采用纳滤膜技术(Cuartas，B.，Alcaina, Μ· I· &Soriano，E· (2004). Separation of mineralsalts and lactose solutions through nanofiltration membranes. Food Science andTechnology International,10,255-262.) 或凝胶过滤层析法虽然能达到脱盐的目的，但是操作繁琐且耗时、效率低，不利于工业化生产。
此外，由于传统酶解过程的复杂性、随机性以及水解度测定过程中带来的种种误差，导致酶解反应操作不易控制，重复性较差，不利于规模化生产，而生物传感器的引入则可以解决上述问题。作为一类特殊的化学传感器，它通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而得出被测物的浓度。目前，生物传感器以其选择性高、分析速度快、仪器操作简单、价格低廉和可在线分析等特点，已广泛应用于环境监测、食品工业、生物医学等领域。[0006]目前，通过改变酶解方式控制盐份的产生量，并引入生物传感器精确控制酶解反应的进行，在国内外酶法制备乳清蛋白降血压肽的研究中尚未发现。因此，开发一种可控制的酶法制备低盐份、高活性的乳清蛋白降血压肽的方法具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳清蛋白降血压肽及其制备方法。
本发明所提供的乳清蛋白降血压肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的
1)将乳清蛋白溶液水化后调节pH值为7. 0 10. 0，然后加入蛋白酶I，使乳清蛋白和蛋白酶I在40 60°C的条件下进行酶解反应；其中，所述蛋白酶I选自下述任意一种 碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶；具体可为购于诺维信公司的碱性蛋白酶，购于北京欣经科生物技术有限公司的木瓜蛋白酶；
2)步骤1)中所述酶解反应进行120 240分钟后，保持所述酶解反应的反应体系的温度不变，将所述反应体系的PH值调节至6. 5 8.0，然后向所述反应体系中加入蛋白酶 II，在40-60°C的条件下继续进行酶解反应，反应120 240分钟后，停止反应，得到粗酶解液；其中，所述蛋白酶II选自下述任意一种中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；
3)使步骤2、得到的粗酶解液中的蛋白酶I和蛋白酶II灭活，并将灭活后的粗酶解液的PH值调节至所述乳清蛋白的等电点(5. 1 5. 3)，接着离心取上清液，调节所述上清液的PH值为6. 0 8. 0，并将所述上清液通过截留分子量为3000 IOOOOkDa的超滤膜，收集超滤液，得到乳清蛋白降血压肽。
其中，步骤1)中对所述乳清蛋白溶液进行水化的条件为将所述乳清蛋白溶液调节PH值到7. 0 8. 5，然后在75°C 85°C水化15 20min。
步骤1)所述乳清蛋白溶液中乳清蛋白的质量浓度可为2% 10%。
步骤1)中所述蛋白酶I可按照每IOOg乳清蛋白加入200KU 800KU蛋白酶(1U 定义为40°C下每分钟水解酪蛋白产生Iyg酪氨酸的量)的比例加入；步骤幻中所述蛋白酶II可按照每IOOg乳清蛋白加入200KU 800KU蛋白酶的比例加入。
步骤幻中可采用下述方法使所述蛋白酶I和蛋白酶II灭活将酶解液升温至 75°C 95°C，保持 10 20min。
步骤3)中将所述上清液调至中性后会使水解物更稳定，也便于后面的超滤操作， 酸性或碱性可能会对超滤膜造成污染，不利于超滤过程进行。
为了更好的控制酶解反应的进程并对酶解过程实施连续在线监测，还可在步骤 1)和步骤幻的酶解体系中引入生物传感器，将所述生物传感器的电极始终插入酶解反应体系中，通过电流信号和酶解液中生成的谷氨酸含量之间的关系在线监测酶解进程，确定终止复合酶解反应的最适时间点。该生物传感器是以电化学电极为信号转换器、以电流为特征检测信号，主要通过测定恒电压下工作电极在反应过程中的电流值变化，对根据电流信号和谷氨酸含量之间存在的线性比例关系来确定酶解反应终止时间的。经过大量的试验发现，在本发明的酶解过程中，当传感器的电流信号为3. 2-3. 6 μ A时，酶解液中谷氨酸含量可达到1.6-2.0 μ mol/mL，此时乳清蛋白水解度适宜，ACE抑制率又较高(可达 85% -90% )，那么此时生物传感器上对应的电流值就是该反应终止的信号。
上述提供的所述方法还包括对得到的乳清蛋白降血压肽进行冷冻干燥或真空浓缩后冷冻干燥得到粉末状乳清蛋白降血压肽的步骤。
本发明中所使用的乳清蛋白具体可为乳清浓缩蛋白(WPC)或乳清分离蛋白 (WPI)。
乳清浓缩蛋白(WPC)是通过物理分离技术如沉淀、超滤等从液体乳清生产而来。
乳清分离蛋白(WPI)是通过物理和化学分离技术如过滤和离子交换生产而来的。
本发明的再一个目的是提供所述乳清蛋白降血压肽的应用。
本发明所提供的乳清蛋白降血压肽的应用是将所述乳清蛋白降血压肽添加到各种大宗食品或直接作为保健品功能成分，用于食源性降血压食品及保健品的制备。
本发明所提供的制备乳清蛋白降血压肽的方法，在酶解过程中通过限制NaOH和 HCl的加入量来控制酶解液中盐的含量，通过适当延长水解时间，获得了灰分含量小于 3. 0%、水解度在20% 30%之间、ACE抑制率大于80%的降血压肽。
与现有方法相比，本发明的方法具有如下优点
1、本发明所采用的原料乳清蛋白作为干酪生产的副产物，来源广泛，经本发明的技术转化可有效提高这种副产物的附加值；
2、本发明采用双酶复合分步酶解的方式，并通过对酶解过程中盐份含量的有效控制达到低盐产品的效果，无需后续脱盐步骤，工艺简单易行，便于工业化生产；
3、本发明在酶解体系中引入生物传感器，对酶解过程实施连续在线监测，更好地控制酶解过程的进行以获得所需目标产物；体积小、易操作、选择性好、快速精准的生物传感器具有广阔的应用前景；
4、采用本发明方法制备的降血压肽是食用级乳清蛋白粉经蛋白酶水解而得，安全无副作用，对高血压患者可起到降压作用，对血压正常者可起到保健作用，对正常血压无影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中所用的乳清分离蛋白(WPI)购于Hilmar 公司，名称为 Hilmar 9400o也可以是乳清浓缩蛋白(WPC)，购于Hilmar 公司，名称为Hilmar 8000乳清浓缩蛋白。
实施例1、制备乳清蛋白降压肽
称取IOg乳清分离蛋白，溶于200mL水中，85°C水浴加热20min，降温至40 60°C， 调节PH至9.0，加入碱性蛋白酶(诺维信公司)30KU，在恒温水浴锅中于55°C水解3小时后， 加入木瓜蛋白酶(北京欣经科生物技术有限公司)30KU，于60°C继续搅拌酶解，酶解过程中生物传感器的电极始终插在酶解液中，进行在线监测，当传感器上的电流值达到3. 2μ A时终止反应，此时又酶解了 3小时，测定此时酶解液水解度为28. 4%。反应结束后将酶解液升温至90°C，保持15min，灭酶、冷却，调节溶液pH至乳清蛋白等电点(5. 2),4000rpm离心 15min，取上清液。将所述上清液经截留分子量为IOkDa的超滤膜超滤，滤液冻干后得到乳清蛋白降压肽。对该产物进行分析，结果表明灰分含量小于2%，蛋白回收率接近90%，TCA可溶性氮含量超过85%，游离氨基酸含量为75. 38 μ mol/mL, ACE抑制率为85. 6%。
酶解液中灰分含量低可以省去后续繁琐的脱盐处理，利于工业化生产；三氯乙酸 (TCA)是一种蛋白沉淀剂，它可以沉淀蛋白和较长的肽段，TCA氮溶解指数也可以定性地反应蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短多肽的含量越高；游离氨基酸过多说明水解程度过大，不利于目标活性肽的生成。
上述各参数按照下述方法进行测定
灰分的测定(测定方法参考范天吉.乳和乳制品分析检测与执行标准实务全书.呼和浩特内蒙古人民出版社，2003 :209-227)
取5mL液体样品于已恒重的瓷柑祸中，在电炉上加热使水分蒸发并炭化，炭化完全后置于马福炉中550°C灼烧至残渣呈白色或浅灰色为止，冷却后称量。灰分的含量为
m3灰分含量·^^^"700^ m2式中ml-坩埚质量，g;
m2-样品加坩埚质量，g ；
m3_残灰加坩埚质量，g。
三氯乙酸溶解指数(TCA-NSI)的测定；
将20mL20%三氯乙酸(TCA)溶液加到20mL酶解液中，混合震荡，静置60min后于 4000r/min离心分离20min，取上清液测定总氮量。
TCA-NSI (% )=上清液中总氮量(mg) /酶解液中总氮量(mg) X 100%。
酶解产物游离氨基酸的测定(甲醛滴定法)
取IOmL的蛋白水解液，加30mL去(X)2蒸馏水，混勻，以酸度计测其pH值，用 0. lmol/L NaOH标准溶液预滴定至pH为8. 2，加入中性甲醛溶液20mL，摇勻，放置片刻后用 0. lmol/L NaOH标准溶液滴定至pH为9. 2，记录消耗碱液的体积V1 (mL)，做空白试验并记录消耗碱液体积V2(HiL)。则水解物游离氨基酸含量(μ mol/mL)
M(V1-V2)
游离氨基酸的含量(μ mol/mL)= —^-x 1000
式中…样品加甲醛后消耗的氢氧化钠体积(mL)；
V2空白加甲醛后消耗的氢氧化钠体积(mL)；
M氢氧化钠的浓度(mol/L)。
ACE 抑制活性测定参照文献(Cushman，D. W.，Cheung, H. S. · Concentrations ofangiotensin-converting enzyme in tissues of the rat, BBA-Enzymology 1971 ； 250(1) :261-265)的方法进行，并根据具体情况对反应体系进行了一定改进。
具体方法如下:50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8. 3)，含 300mmol/L NaCl ；5mmol/ LHHL (马脲酰组氨酰亮氨酸)(溶解于缓冲液中)；50mU/mL ACE (溶解于缓冲液中)。样品 50yL与25yL ACE溶液混合，37°C反应lOmin。加入50 μ L HHL溶液，37°C反应30min后， 加入150yL IN HCl终止反应。实验重复三次。反应中马尿酸生成量采用HPLC法测定，色谱条件为进样量 20 μ L ；柱条件 C18 (4. 6 X 250mm, 5mm ；Phenomenex, Torrance, CA, USA)；流动相水甲醇(0. 1% TFA) =5:5 ；流速lmL/min ；检测波长228nm。
ACE 抑制率(% ) = (B-A)/(B-C)
其中，A为抑制反应的峰面积(样品)；B为完全反应的峰面积(对照)；C为先加入HCl的，ACE不与HHL反应的峰面积(空白))
实施例2、制备乳清蛋白降压肽
称取IOg乳清浓缩蛋白，溶于200mL水中，85°C水浴加热20min，降温至40 60°C， 调节PH至9. 0，加入碱性蛋白酶(诺维信公司)30KU，在恒温水浴锅中于50°C水解3小时后，将反应液PH值调节至7.5，加入木瓜蛋白酶(北京欣经科生物技术有限公司)30KU，于 60°C继续搅拌酶解，酶解过程中生物传感器的电极始终插在酶解液中，进行在线监测，当传感器上的电流值达到目标值时终止反应，此时又酶解了 2小时，测定此时酶解液水解度为洲.1%。反应结束后将酶解液升温至90°C，保持15min，灭酶、冷却，调节溶液pH至乳清蛋白等电点(5. 2)，4000rpm离心15min，取上清液。将所述上清液经截留分子量为IOkDa的超滤膜超滤，滤液冻干后得到乳清蛋白降压肽。对该产物进行分析，结果表明灰分小于2%， 蛋白回收率接近90 %，TCA可溶性氮含量超过90 %，游离氨基酸含量为70. 23 μ mol/mL, ACE 抑制率为89. 3%0
对比例1、制备乳清蛋白降压肽
称取IOg乳清分离蛋白，溶于200mL水中，85°C水浴加热20min，降温至40 60°C， 调节PH至8.0，加入碱性蛋白酶(诺维信公司)30KU，在恒温水浴锅中水解，水解过程中不断添加0. IN NaOH使pH保持在一个恒定值。将生物传感器的电极插入酶解液中，通过电流信号与生成的特定氨基酸含量之间的关系在线监测酶解过程，当传感器的电流值达到目标值时终止反应，此时测定酶解液水解度为23. 5%。反应结束后灭酶、冷却，调节溶液pH至乳清蛋白等电点，4000rpm离心15min，取上清液。经IOkDa的超滤膜超滤，滤液冻干后得到具有ACE抑制活性的酶解产物。对该产物进行分析，结果表明灰分超过5%，蛋白回收率接近90%，TCA可溶性氮含量超过95%，游离氨基酸含量为79. 77 μ mol/mL, ACE抑制率为 78. 4%。
与实施例1中复合酶解他相比，实施例2复合酶解证在获得相同水解度的同时能获得更高的ACE抑制活性，与对比例1中的单一蛋白酶酶解4h相比，复合酶解证同样能达到更高的水解度和ACE抑制率，且两者在蛋白回收率和TCA可溶性氮含量上相近；复合酶解产物的游离氨基酸含量，尤其是灰分含量要明显低于单一蛋白酶酶解产物。
权利要求
1.一种乳清蛋白降血压肽的制备方法，包括下述步骤1)将乳清蛋白溶液水化后调节PH值为7.0 10. 0，然后加入蛋白酶I，使乳清蛋白和蛋白酶I在40-60°C的条件下进行酶解反应；其中，所述蛋白酶I为碱性蛋白酶；2)步骤1)中所述酶解反应进行120 240分钟后，保持所述酶解反应的反应体系的温度不变，将所述反应体系的PH值调节至6. 5 8. 0，然后向所述反应体系中加入蛋白酶 II，在40 60°C的条件下继续进行酶解反应，反应120 240分钟后，停止反应，得到粗酶解液；其中，所述蛋白酶II为木瓜蛋白酶；3)使步骤幻得到的粗酶解液中的蛋白酶I和蛋白酶II灭活，并将灭活后的粗酶解液的PH值调节至所述乳清蛋白的等电点，接着离心取上清液，调节所述上清液的PH值为 6. 0 8. 0，并将所述上清液通过截留分子量为IOkDa的超滤膜，收集超滤液，得到乳清蛋白降血压肽；所述蛋白酶I按照每IOOg乳清蛋白加入200 SOOkU蛋白酶的比例加入；所述蛋白酶 II按照每IOOg乳清蛋白加入200 800kU蛋白酶的比例加入。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤1)中对所述乳清蛋白溶液进行水化的条件为将所述乳清蛋白溶液调节PH值到7. 0 8. 5，然后在75°C 85°C水化15 20mino
3.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中所述乳清蛋白溶液中乳清蛋白的质量浓度为2. 0 10. 0 %。
4.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于步骤幻中按照下述方法使所述蛋白酶I和蛋白酶II灭活将酶解液升温至75°C 95°C，保持10 20min。
5.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述乳清蛋白为乳清浓缩蛋白或乳清分离蛋白。
6.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于在步骤1)和步骤2)的酶解反应的反应体系中引入生物传感器，将所述生物传感器的电极始终插入反应体系中，通过电流信号和酶解液中生成的谷氨酸含量之间的关系在线监测酶解进程，确定终止步骤2、酶解反应的时间点。
7.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述方法还包括对步骤幻得到的乳清蛋白降血压肽进行冷冻干燥或真空浓缩后冷冻干燥得到粉末状乳清蛋白降血压肽的步马聚ο
专利摘要
本发明公开了一种乳清蛋白降血压肽及其制备方法与应用。该乳清蛋白降血压肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的将乳清蛋白溶液水化后调节pH值为7.0-10.0，然后加入蛋白酶I进行酶解反应；反应进行120～240分钟后，保持反应温度不变，将pH值调节至6.0～8.0，然后向反应体系中加入蛋白酶II，继续进行反应，反应120～240分钟后，停止反应，得到粗酶解液；使粗酶解液中的酶灭活，并调节pH值至乳清蛋白的等电点，离心取上清液，调节上清液pH值为6.0～8.0，并通过10kDa的超滤膜，收集超滤液，得到乳清蛋白降血压肽。对产物进行分析表明，所制备的乳清蛋白降压肽中灰分含量小于2％，蛋白回收率接近90％，TCA可溶性氮含量超过85％，游离氨基酸含量为70.23μmol/mL，ACE抑制率大于85％。
文档编号C12P21/06GKCN101736067 B发布类型授权 专利申请号CN 201010033759
公开日2012年4月18日 申请日期2010年1月8日
发明者成雪, 毛学英, 王磊, 陈耿华 申请人:中国农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),