专利名称：：乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途的制作方法乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途
技术领域：
：本发明属于生物活性肽的
技术领域：
。更具体地，本发明涉及乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途。
背景技术：
：传统合成抗氧化剂，如BHA、BHT、PG、TBHQ等，由于廉价并具有很高的抗氧化活性常作为添加剂防止食品劣变，然而因为其对人体健康的潜在危害而使应用受到限制。现代自由基学说指出活性氧自由基导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退化、激活致癌原、抑制细胞内抗氧化系统等氧化损伤，将引发糖尿病、心血管疾病、神经组织退化紊乱和癌症等多种慢性病的发生和发展。因此，能够安全地提高机体抗衰老能力和抑制脂质氧化的天然抗氧化剂替代品越来越受到人们的关注。抗氧化肽(AntioxidativeP印tides)是最近被广泛研究的一类活性肽，它具有清除自由基、供氢/供电子、螯合金属离子、淬灭单线态氧、分解过氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化等抗氧化功效，易消化吸收，无毒副作用，生物利用率高，营养和加工特性良好。在食品加工中添加抗氧化活性肽能够提高食品稳定性和延长食品的储藏期；同时可以作为功能食品、保健食品以及开发抗氧化药物，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生。在动物饲料中添加抗氧化活性肽可以维持动物健康，或者替代化学抗氧化剂成为饲料防腐剂。将抗氧化活性肽适量添加入化妆品中，可以有效抑制皮肤老化，同时抵抗化妆品自身的氧化，保持其色泽持久。国内外先前对乳蛋白的研究主要集中在其理化和功能特性，在相当长一段时间内，乳蛋白只被认为是氨基酸的主要来源，乳蛋白的生理活性一直未受到足够的重视。近年来，人们对乳源性生物活性肽进行了深入研究，在乳蛋白多肽链内部可能普遍存在着功能区，蕴藏着许多生物活性肽，通过蛋白酶水解释放出来即可在体内发挥特定的生理功能。目前从乳中不同蛋白的降解产物分离出了多种具有生理功能的活性肽，主要来自酪蛋白，如吗啡活性肽，抗高血压肽、免疫调节肽、抗血栓肽、促进金属离子吸收的肽、抗菌肽、促进细胞生长的肽等，为乳的深加工奠定了基础。许多文献报道了乳蛋白酶解物具有抗氧化活性，人们已经从乳蛋白酶解物中分离出了多个具有抗氧化活性的肽段。乳清蛋白(WheyProtein，WP)是乳沉淀酪蛋白后分离出来的蛋白质，它具有很高的生物利用价值，富含多种必需氨基酸，是国际上公认的人体最优质蛋白质补充剂之一。乳清蛋白主要存在于乳清中，乳清是工业生产干酪及干酪素的副产物，其BOD和C0D值都很高，自然排放会造成环境的污染。每年都有上亿吨乳清等待利用和处理，如此丰富的资源如果可以得到有效的利用，将是一件利国利民的好事，既可以解决乳清对环境的污染又能够使其中营养物质得到充分的利用。"十五"期间，我国启动乳业重点专项，利用我国丰富的乳蛋白资源，研究及开发具有抗氧化生物活性肽，对拓展乳功能性食品及新药开发领域，增进乳的开发与利用价值，有一定的理论指导意义，对人类健康事业的发展具有较大的促进作用。国内外对乳源性活性肽的研究多集中于酪蛋白，对于乳清蛋白高纯度抗氧化肽的报道不多。利用酶解将乳清蛋白水解为小肽，不仅改善了乳清蛋白的稳定性和致敏性，而且对人体具有重要的生理功能，具有很大的研究空间。随着研究的不断深入和广泛的开发，乳清蛋白抗氧化肽产品将为企业和社会带来巨大经济效益。但是，目前还缺乏可以具有实际广泛应用的提取乳清蛋白抗氧化肽的方法，以及获得这些乳清蛋白抗氧化肽的氨基酸序列、性质与用途，因此，本申请人进行了大量实验研究，终于作出了本发明。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种乳清蛋白抗氧化肽。本发明的另一个目的是提供所述乳清蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明的另一个目的是所述乳清蛋白抗氧化肽的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种乳清蛋白抗氧化肽的制备方法。该方法的步骤如下(i)酶解步骤在酶反应器中制备浓度10-50mg/mL乳清蛋白去离子水溶液，在温度45-55"C下预处理10-20min，然后用酸或碱将其pH调节到7.0-10.5，再加入以乳清蛋白重量计1-3重量％蛋白酶，在这个温度下进行酶解直到水解度达到18-20%，同时用酸或碱保持该反应介质的pH恒定，然后在85-10(TC灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8_7.2，再在8000-10000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液，或让所述的上清液进行冷冻干燥得到乳清蛋白抗氧化肽酶解物冻干粉；(ii)初步纯化步骤静态法，往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是l:1-2:1，在温度15-30。C与150-200r/min的条件下振荡12-24h，然后分离上清液，该树脂再用50-70体积％乙醇水溶液洗脱12-24h;或动态法，使用尺寸小2.6X30cm柱，让步骤(i)得到的含有乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液以流速l-2mL/min通过上述大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速l-2mL/min洗涤至电导率小于15ys/cm，再用65-75体积％乙醇水溶液以流速0.5-lmL/min进行洗脱；(iii)蒸发浓縮步骤步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在温度50-65t:下进行旋转蒸发浓縮到100-300mg/mL乳清蛋白抗氧化肽，再进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1;(iv)凝胶过滤色谱分离步骤将步骤(iii)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1制备成10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速为2-3mL/min通过凝胶过滤色谱柱，再用去离子水以洗脱流速12-24mL/h洗脱，得到的组分进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2;(v)制备型高效液相色谱分离步骤将步骤(iv)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2制备成10-30mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用制备型反相高效液相色谱柱，以流速2-3mL/min进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-3;(vi)分析型高效液相色谱分离步骤将步骤(v)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-3制备成10-20mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速0.7-1.5mL/min通过分析型高效液相色谱进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-4;(vii)液质联用分析多肽氨基酸序列将步骤(vi)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-4制备成5-10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，以及母离子m/z1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL的两个抗氧化肽肽段。根据本发明的一种优选实施方式，所述的蛋白酶是一种或多种选自2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶、ProteaseN蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白酶。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的酸选自无机酸或有机酸，所述的碱选自无机碱或有机碱；所述的无机酸选自盐酸、磷酸或硫酸，所述的有机酸选自乙酸、酒石酸或柠檬酸；所述的无机碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾，所述的有机碱选自乙胺、丙胺或乙醇胺。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的大孔吸附树脂选自DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D。根据本发明的另一种优选实施方式，在凝胶过滤色谱步骤中使用的色谱柱是S印hadexG_15。根据本发明的另一种优选实施方式，在制备型高效液相色谱分离步骤中使用的色谱柱为Hedern0DS_2C18P/N84176。根据本发明的另一种优选实施方式，在分析型高效液相色谱分离步骤中使用的色谱柱为C18S/NMTIOI。根据本发明的另一种优选实施方式，在液质联用分析多肽氨基酸序列使用的色谱柱为BEHC18。本发明还涉及采用上述制备方法得到的乳清蛋白抗氧化肽。本发明还涉及所述的乳清蛋白抗氧化肽在食品、医药、饲料和化妆品中的用途。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种乳清蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明乳清蛋白抗氧化肽的制备步骤如下。(i)酶解步骤在酶反应器中制备浓度10-50mg/mL乳清蛋白去离子水溶液，在温度45-55"下预处理10-20min，然后用酸或碱将其pH调节到7.0-10.5，再加入以乳清蛋白重量计1-3重量％蛋白酶，在这个温度下进行酶解直到水解度达到18-20%，同时用酸或碱保持该反应介质的pH恒定，然后在温度85-10(TC下灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在8000-10000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液，或将所述的上清液进行冷冻干燥得到乳清蛋白抗氧化肽酶解物冻干粉。在本发明中，所述的乳清蛋白选用新西兰恒天然(NZMP)公司以商品名乳清浓縮蛋白(WPC80)销售的产品，其蛋白浓度大于80%。当然，也可以使用目前在市场上销售的与所述WPC80类似的乳清蛋白。所述的蛋白酶是一种或多种选自2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶、ProteaseN蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白酶。上述蛋白酶都是目前市场上销售的产品，例如无锡雪梅酶制剂有限公司生产的2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、AS1398中性蛋白酶，Novozyme公司生产的Protamex复合蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶，日本天野酶制剂有限公司生产的ProteaseN蛋白酶，Sigma公司生产的EC3.4.23.1胃蛋白酶。优选地，所述的蛋白酶是一种或多种选自2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶或ProteaseN蛋白酶的蛋白酶。更优选地，所述的蛋白酶是2709碱性蛋白酶或胰蛋白酶。在本发明的这个步骤中使用的酸选自无机酸或有机酸，所述的碱选自无机碱或有机碱。例如，所述的无机酸选自盐酸、磷酸或硫酸，所述的有机酸选自乙酸、酒石酸或柠檬酸；所述的无机碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾，所述的有机碱选自乙胺、丙胺或乙醇胺。所述酸或碱的使用浓度一般不宜太高，通常是0.5-1.5mol/L。在本发明中，乳清蛋白酶解进程是用水解度值确定的，该水解度值应该理解是在蛋白质水解反应过程中被裂解的肽键占蛋白质总肽键的百分数。在本发明中，在碱性或中性条件下进行水解时，采用pH-Stat法测定水解度〔参考文献AlderNissenJ.Enzymatichydrolysisoffoodprotein[M]丄ondon:Elsevierappliedsciencepublishers,1986.1214.〕。在酸性条件下进行水解时，采用TNBS法测定水解度〔参考文献AlderNissenJ.Determinationofdegreeofhydrolysisoffoodproteinhydrolysatesbytrinitrobenzenesulfonicacid[J].J.Agri.FoodChem.，1999,27:12561262.〕。(ii)初步纯化步骤该步骤可以两种方式进行静态法，往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是l:1-2:1，在温度15-30。C下以150-200r/min振荡12-24h，然后分离上清液，该树脂再用50-70体积％乙醇水溶液洗脱12-24h;在上述条件下，所述树脂吸附乳清蛋白抗氧化肽的吸附率是68-78%，解吸率是86-96%，回收率是65-75%。在本发明中，大孔吸附树脂应该理解是非离子型高分子多孔性吸附剂，是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构，在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，在整个颗粒内部及外部都具有表面活性，它对化合物的吸附作用主要是基于化合物的疏水基团与非极性吸附剂之间的范德华引力，这样就可以对不同极性的化合物进行分离，同时也可通过本身的多孔网状孔穴结构对分子大小不同的化合物加以筛选。由于树脂与被分离成分之间的吸附为物理吸附，被吸附的物质较易洗脱，并具有成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点，因此大孔吸附树脂分离技术现已大量用于环保、化工、医药和食品行业。本发明采用大孔吸附树脂对乳清蛋白抗氧化肽进行初步分离。在该步骤中，所述树脂吸附乳清蛋白抗氧化肽的吸附率、解吸率和回收率是根据下式进行计算的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中C。_吸附液起始蛋白浓度，mg/mL;Cx_吸附液平衡蛋白浓度，mg/mL;v-吸附液体积，mL;W-树脂(干)重量，g;[OO65]Vd-解吸液体积，mL;[ooee]Cd-解吸液蛋白浓度，mg/mL;[OO67]Md_大孔产物蛋白质量，mg;M。-酶解物蛋白质量，mg。根据本发明的另一个优选实施方式，本发明还可以用大孔吸附树脂柱进行动态纯化，所述的方法具有洗脱液用量少和耗时短的优点，适于工业化生产使用。对同一浓度的上样溶液，若吸附流速过大，被吸附物质来不及扩散到树脂的内表面就提早泄露而造成样品流失，树脂的吸附量就会下降；但吸附流速过小，吸附时间就会延长。确定最佳的吸附流速通常应综合考虑树脂的吸附效果和工作效率。解吸流速一般都比吸附流速慢一倍以上。所述的动态纯化法是使用尺寸小2.6X30cm柱，让步骤(i)得到的含有乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液以流速l-2mL/min通过该大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速l-2mL/min洗涤至电导率小于15ys/cm，再用65-75体积％乙醇水溶液以流速O.5-lmL/min进行洗脱。在这样的条件下，所述树脂吸附乳清蛋白抗氧化肽的吸附率是65-75%，解吸率是78-88%，回收率是60-70%，均低于静态法。在本发明中，所述的大孔吸附树脂在使用前需要进行如下的预处理先用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇清洗至220nm无吸收峰，再用去离子水清洗后备用。所述的大孔吸附树脂选自DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D。优选地，所述的大孔吸附树脂是DA201-B、DA201-C或DA201-D。更优选地，所述的大孔吸附树脂是DA201-C。所述的大孔吸附树脂是江苏苏青水处理工程集团有限公司以商品名DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D销售的产品。(iii)蒸发浓縮步骤步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在温度50-65t:下进行旋转蒸发浓縮至浓度为100-300mg/mL，再进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1。旋转蒸发浓縮使用的是沪西分析仪器厂以商品名RE52-3旋转蒸发器销售的产品，上海亚荣生化仪器厂以商品名RE5220旋转蒸发仪销售的产品。冷冻干燥使用的是北京四环科学仪器厂以商品名LGJ-10冷冻干燥器销售的产品，或LABCON公司以商品名6LFreezeDrySystem销售的产品。(iv)凝胶过滤色谱分离步骤将步骤(iii)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1制备成10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用美国Sigma公司生产的S印hadexG_15凝胶过滤色谱柱，上样流速为2-3mL/min，再使用去离子水以洗脱流速12_24mL/h进行洗脱，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2。冷冻干燥使用的设备如前面所述的设备。凝胶过滤色谱分离条件如下检测波长220或280nm;柱温25°C;上样流速2-3mL/min;进样浓度10-50mg/mL;进样量2-4mL;洗脱条件去离子水，洗脱流速12-24mL/h。在本发明中，乳清蛋白肽抗氧化活性的测定方法如下清除DPra(l，1-二苯基-2-苦基苯肼)自由基法取2mL试样与2mLDPm无水乙醇溶液混合(1X10—4mol/L)，在室温下反应30min后在517nm处测定吸光值Ait)DPPH自由基的清除率按下式计算DPPH自由基清除率(％)乂x100(5)式中Ai-样品组吸光度；Aj-空白组吸光度；A。-对照组吸光度。采用a-脱氧-D-核糖法测定清除羟基自由基。取0.lmL的FeSO厂EDTA混合液(1Ommol/L)于试管中，加入O.3mLa-脱氧-D-核糖(10mmol/L)，然后加入0.2mL—定浓度的样品，用pH7.4的0.lmol/L磷酸缓冲液定容至1.9mL，再加入0.lmLH202(10mmol/L)，混匀后置于37"恒温水浴中反应lh。之后加入lmL2.8%(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液和lmL1.0%(w/v)硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混匀，沸水浴中反应15min，冷却后取lmL反应液稀释5倍，在532nm处测定吸光度值。羟基自由基清除率按照下式进行计算9羟基自由基清除率(％)=1式中4-加入样品后的吸光度；A。-实际空白吸光度；Ac-不加入样品时的吸光度。采用邻苯三酚法测定清除超氧阴离子自由基。在恒温25t:下，取50mmol/LpH8.2的tris-HCl缓冲溶液3mL(其中含有lmmol/L的EDTA)，50mmol/L邻苯三酚10yL，迅速混匀，在325nm处每隔30s测定一次吸光度，反应5min结束，以吸光度对时间作图，求得其曲线的斜率，即为邻苯三酚自氧化速率为A。。在3mLpH8.250mmol/L的tris-HCl缓冲液中加适量样品，采用上述方法测样品在325nm处的邻苯三酚自氧化速率As。清除率按照下式进行计算采用还原Fe"法测定还原力。还原剂可使Fe"铁氰化物复合物中的三价铁还原，并在700nm下检测其吸光度〔参考文献0yaizuM.Studieso即roductsofbrowningreactions:antioxidativeactivitiesofproductsofbrowningreactionpreparedfromglucosamine[J]JpnJNutr，1986(44):307—315.〕。(v)制备型高效液相色谱分离步骤将步骤(iv)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2制备成10-30mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用制备型反相高效液相色谱柱，以流速2-3mL/min进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物_3。抗氧化活性的测定方法如前面所述。在该制备型高效液相色谱分离步骤中，使用的色谱柱是江苏汉邦公司生产的Hedern0DS_2C18P/N84176，其尺寸为(M0X250mm。该制备型高效液相色谱分离的条件如下检测波长220或280nm;柱温35。C;流速2mL/min;进样浓度30mg/mL;进样量25iiL;洗脱条件流动相A:水+0.05%三氟乙酸；B:乙腈+0.05%三氟乙酸，梯度洗脱。(vi)分析型高效液相色谱分离步骤将步骤(v)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-3制备成10-20mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用分析型高效液相色谱柱，以流速0.7-1.5mL/min进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳清蛋白抗氧化肽冻干物_4。抗氧化活性的测定方法如前面所述。在分析型高效液相色谱分离步骤中，使用的色谱柱为Waters公司生产的C18S/NMT101，其尺寸为小4.6X150mm。该分析型高效液相色谱分离的条件如下检测波长220或280nm;柱温35。C;流速lmL/min;进样浓度10mg/mL;进样量超氧阴离子自由基清除率(％)lOiiL;洗脱条件流动相A:水+0.05%三氟乙酸；B:乙腈+0.05%三氟乙酸，梯度洗脱。(vii)液质联用分析多肽氨基酸序列将步骤(vi)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-4制备成5-10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，以及母离子rn/z1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL的两个抗氧化肽肽段。所述的氨基酸是采用氨基酸自动分析仪进行测定的。具体步骤如下将60lOOmg乳清蛋白抗氧化肽置于水解管中，加入6mol/L的HCl溶液，真空封口，在ll(TC下水解24h，冷却后定容、过滤、蒸干，再加入0.02mol/L的HC1溶液，在空气中放置30min，采用AgilentllOO液相色谱仪测定氨基酸的含量。氨基酸分析表明，得到的乳清蛋白抗氧化肽中富含天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸，必需氨基酸质量百分比分别为39.46%，符合FAO/WHO提出必需氨基酸含量在40%左右的要求，可以作为良好的营养补充剂和保健食品。抗氧化肽的活性与其肽段中含有疏水性氨基酸有关，其疏水性氨基酸质量百分比为34.16%。此外，肽的苦味与其平均疏水性有关，通过氨基酸组成计算得到其总疏水性值为4.72kJ/mol，这预示着酶解产物在口感上具有良好的可接受性。所述乳清蛋白抗氧化肽的相对分子质量分布是采用体积排阻高效液相色谱(highperformancesizeexclusionchromatography,HPSEC)领lj定的。具体步骤如下吸取样品2mL于10mL容量瓶中，用流动相稀释到刻度，用微孔过滤膜过滤后进样。检测仪器Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器(波长220nm)和M32工作站)；色谱柱TSKgel2000SWXL小300nmX7.8mm;流动相体积比乙醇水三氯乙酸=45:54:1;检测波长220nm;流量0.5mL/min;柱温3(TC。其测定结果见图4，这些结果表明经过分离纯化后得到的乳清蛋白抗氧化肽主要分布在5682545Da。所述乳清蛋白抗氧化肽的氨基酸序列测定采用的是美国Waters公司生产的WATERSSYNAPTQ-TOFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪，具体步骤如下将步骤(vi)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物_4制备成5-10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，用微孔过滤膜过滤后进样。液相色谱条件如下检测器WATERSACQUITYPDA;分析柱:BEHC1842.IX100mm;检测波长:220nm;柱温30。C;流速0.3mL/min;流动相A-水+0.2%甲酸，8_乙腈，梯度洗脱。质谱仪条件如下离子方式ESI+;毛细管电压2.5kV;锥孔电压30V;离子源温度10(TC;脱溶剂气体温度25(TC;脱溶剂气体流量600L/h;锥孔气体流量50L/h;碰撞能量70V;质荷比扫描范围50-3000m/z;检测电压1600V。其测定结果见图5.为了达到实际应用的目的，本发明人对本发明制备的乳清蛋白抗氧化肽进行了有关性能的研究。(—)产品的稳定性1.耐体外消化稳定性许多来源于食品蛋白质的活性肽在体内测试时就丧失了它们的体外生物活性，这可能是它们本身就是消化酶的作用底物或者在胃肠道的消化过程中被水解而降低了它们11的活性。活性肽在体内活性的稳定性可以直接通过动物实验或者临床测试来完成，但是，通过体外培养的过程来模拟胃肠道消化系统作用的方法比体内测试更加实际、方便。由于胃蛋白酶一胰酶复合酶酶解模式最接近人体自然生理消化过程，于是采用了此模式来检测抗菌肽在体内消化的稳定性。胃蛋白酶一胰酶复合酶酶解模式具体地可以参考文献QianZJ，JungWK，KimSK.Freeradiclscavengingactivityofanovelantioxidativepeptidepurifiedfromhydrolysateofbullfrogskin，RanacatesbeianaShaw[J]，BioresourceTechnology,2008，99(6):1690-1698。本发明乳清蛋白抗氧化肽耐体外消化稳定性的结果见表1。由表1可知，该抗氧化肽在经过胃肠道消化后活性变化不大，尤其是胃蛋白酶水解后的抗氧化肽在胰酶作用下几乎不会对活性有影响。表1:乳清蛋白抗氧化肽的耐体外消化稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注a，b不同字母代表统计学分析有显著差异(P<0.05)。2.耐热耐酸碱稳定性为了稳定开发产品的质量并延长货架期，高温热处理是采取的主要手段。酶解产物耐热耐酸碱稳定性依赖于缓冲液的种类、热处理温度、热处理时间、pH值以及其自身的结构，分析产物耐热耐酸碱稳定性有利于其在生产、储藏和应用过程中减少活性损失。乳清蛋白抗氧化肽耐热(10(TC沸水浴)耐酸碱稳定性的结果见表2，表2:乳清蛋白抗氧化肽的耐热耐酸碱稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注a，b，c，d或A，B，C，D不同字母代表统计学分析有显著差异(P<0.05)。从表2可以看出，在中性和微酸性条件下，乳清蛋白肽保持了较高的抗氧化活性和耐热稳定性，这为其在该体系中的应用提供了理论依据。但在强酸性和碱性条件下，一些抗氧化肽被分解或变成不具有活性的沉淀，但仍具有一定的耐热稳定性。3.耐储藏稳定性活性物质若要在食品、医药等行业中加以利用，必须具备一定的储藏稳定性，结果见表3。表3:乳清蛋白抗氧化肽的耐储藏稳定性储藏时间/月储藏温度厂C-184250123479.73±0.82b'F75.49±0.62e'E70.84±0.71C'D63.97±0.71c'c57.31±0.71C'B50.51±0.53e'A80.40±0.6l(对照)78.52±0.91b'F73.40±0.7lb'E67.88±0.53b'D60.40±0.73b'c50.10±0.61b'B35.45±0.5lb'A74.75±0.73a'F66.33±0.62a'E57.51±0.82a'D47.95±0.95a'c35.35±0.81a'B22.63±0.40a'A注a，b，c，d或A，B，C，D不同字母代表统计学分析有显著差异(P<0.05)。从表3可以看出，在低温条件下储藏与常温相比具有显著的稳定性，在_181:下储藏3个月，活性下降10%，6个月下降30%。在-4t:下储藏3个月内与冷冻保藏效果相似，6个月后活性下降40%，常温储藏6个月后活性下降50%，这表明产物在低温下保存能较好地保存其活性。(二)产品的抗氧化活性测定了本发明乳清蛋白抗氧化活性，包括对DPra自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力和还原力的测定，其结果见表4。表4:乳清蛋白肽的抗氧化活性酶解蛋白IC50/(mg/mL)特定浓度/(mg/mL，A柳)DPPH自由基羟基自由基超氧阴离子自由基还原力乳清蛋白(自制)5.526.257.16(8，0.725)麦胚蛋白1.33.56.2(40，1.45)米糟蛋白3.97//(10,0.146)大豆蛋白/6.22/(10,0.046)汉麻籽蛋白2.38.253.5(5,0.38)鹰嘴豆蛋白1.0///草鲤蛋白/1.81//罗非鱼蛋白/3.383.13/鳘鱼蛋白0.6///牡蛎蛋白8.083.958/海湾扇贝蛋白5.92.019.54/醋蛋蛋白//8/从表中可以看出，与国内外文献报道相比，乳清蛋白肽的抗氧化活性相对较高，本发明制备得到的乳清蛋白抗氧化肽将广泛应用于食品、医药、饲料和化妆品等行业，成为生物化学研究领域中的一个热点。[OH4][有益效果]本发明采用有效的制备、分离纯化方法得到纯度高的乳清蛋白抗氧化肽，它具有良好的耐体外消化稳定性、耐热耐酸碱稳定性与耐储藏稳定性，具有较高的抗氧化活性，具有较小分子量和特定氨基酸序列，能够有效清除自由基，阻断氧化反应，减少氧化损伤的产生，因此在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有很广阔的应用前景。图1是S印hadexG_15凝胶过滤色谱分离纯化乳清蛋白抗氧化肽图谱；上图抗氧化活性测定图，下图色谱分离洗脱曲线图2是制备型高效液相色谱分离纯化乳清蛋白抗氧化肽图谱；图3是分析型高效液相色谱分离纯化乳清蛋白抗氧化肽图谱；图4是乳清蛋白抗氧化肽各步分离纯化的相对分子质量分布图；(a)乳清蛋白抗氧化肽冻干物-I;(b)乳清蛋白抗氧化肽冻干物_2;(c)乳清蛋白抗氧化肽冻干物_3图5是乳清蛋白抗氧化肽冻干物_4氨基酸序列的质谱分析图。(a)母离子m/z1568.70质谱分析图;(b)母离子m/z1731.70质谱分析图。具体实施方式通过下述实施例将更详细地说明本发明。实施例1:乳清蛋白抗氧化肽的制备称取新西兰恒天然(NZMP)公司以商品名乳清浓縮蛋白(WPC80)销售的蛋白浓度大于80%的乳清蛋白放到酶反应器中，加入去离子水搅拌均匀制备得到浓度30mg/mL乳清蛋白溶液，该溶液在5(TC预处理15min，再用1.Omol/LHC1或NaOH将其溶液的pH调节到7.6，以乳清蛋白重量计加入2%无锡雪梅酶制剂有限公司生产的胰蛋白酶，然后控制反应体系的pH值恒定，在这个温度下进行酶解，采用pH-stat法测定水解度，直到水解度达到18%，反应结束后，在IO(TC灭酶10min，将其溶液的pH调节到7.0，在8000r/min下进行冷冻离心30min，将该上清液进行冷冻干燥，该乳清蛋白抗氧化肽酶解物对DPra自由基清除率IC50为5.52mg/mL。采用江苏苏青水处理工程集团有限公司以商品名DA201-C销售的大孔吸附树脂在下述条件下进行静态初步纯化往酶解物上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是l:1，在温度25t:下以160r/min振荡24h，然后分离上清液，该树脂用60%乙醇水溶液洗脱24h;在上述条件下，所述树脂吸附乳清蛋白抗氧化肽的吸附率是77.80%，解吸率是95.24%，回收率是74.86%。洗脱液采用沪西分析仪器厂以商品名RE52-3旋转蒸发器销售的旋转蒸发器进行5(TC浓縮并冷冻干燥，其对DPra自由基清除率IC50为4.33mg/mL。然后，进行S印hadexG_15凝胶过滤色谱分离纯化乳清蛋白抗氧化肽。将样品溶解在2mL流动相中上柱，上样浓度为50mg/mL，并用去离子水以流速24mL/h洗脱，同时用紫外检测仪在220nm进行检测；自动分部收集器每5min收集一管。所述凝胶过滤色谱结果如图l所示，本实施例制备的乳清蛋白抗氧化肽经S印hadexG-15凝胶过滤色谱分离共得到5个组分，采用上述方法测定各组分的抗氧化活性，结果表明A号峰表现出最强的DPra自由基清除率，其对DPra自由基清除率IC5。为0.491mg/mL，收集A号峰，冷冻干燥。其次，对A号峰相应组分进行Hedern0DS_2C18P/N84176(小10X250mm)制备型高效液相色谱分离。使用A号峰相应组分制备30mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速2mL/min进行所述制备型高效液相色谱分离，其制备型高效液相色谱结果如图2所示，收集主要4个峰，采用上述方法测定各组分的抗氧化活性，结果表明A-3号峰表现出最强的DPra自由基清除率，其对DPra自由基清除率IC5。为0.0381mg/mL，收集A_3号峰，冷冻干燥。再对峰A-3相应组分进行C18S/NMT101(小4.6X150mm)分析型高效液相色谱纯化。使用峰A-3相应组分制备10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽的去离子水溶液，以流速lmL/min进行分析型高效液相色谱分离，其分析型高效液相色谱结果如图3所示，得到2个纯度很高的抗氧化活性的乳清蛋白抗氧化肽段A-3-a和A-3-b，其对DPra自由基清除率IC5。分别为0.00251mg/mL，0.00495mg/mL，收集这两个肽段冷冻干燥。最后对肽段A-3-a和A_3_b进行WATERSSYNAPTQTFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪序列分析，从一级质谱产生的分子离子中选择m/z1568.70和m/z1731.70为母离子，进入二级质谱，由于y和b型系列离子的丰度相对较高，同一系列内相邻2个碎片离子的质荷比差值含有它们之间相差氨基酸的信息，经过软件序列分析，得到A-3-a的氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，A_3_b的氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL。实施例2:乳清蛋白抗氧化肽的制备按照与实施例1同样的实施方式进行，不同之处只是使用无锡雪梅酶制剂有限公司生产的2709碱性蛋白酶。其结果是水解度25.09%，DPPH自由基清除率为63.85%。实施例3:乳清蛋白抗氧化肽的制备按照与实施例1同样的实施方式进行，不同之处只是使用无锡雪梅酶制剂有限公司生产的木瓜蛋白酶。其结果是水解度4.50%，DPPH自由基清除率为47.84%。实施例4:乳清蛋白抗氧化肽的制备按照与实施例1同样的实施方式进行，不同之处只是使用DA-201B大孔树脂。其结果是所述树脂吸附乳清蛋白抗氧化肽的吸附率是65.30%，解吸率是81.02%，回收率是61.85%。1权利要求一种乳清蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下(i)酶解步骤在酶反应器中制备浓度10-50mg/mL乳清蛋白去离子水溶液，在温度45-55℃下预处理10-20min，然后用酸或碱将其pH调节到7.0-10.5，再加入以乳清蛋白重量计1-3重量％蛋白酶，在这个温度下进行酶解直到水解度达到18-20％，同时用酸或碱保持该反应介质的pH恒定，然后在85-100℃灭酶5-10min，用碱或酸将其反应介质的pH调节到6.8-7.2，再在8000-10000r/min下冷冻离心10-30min，得到含有10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液，或让所述的上清液进行冷冻干燥得到乳清蛋白抗氧化肽酶解物冻干粉；(ii)初步纯化步骤静态法，往步骤(i)得到的上清液中加入大孔吸附树脂，所述上清液与大孔吸附树脂的体积比是1∶1-2∶1，在温度15-30℃与150-200r/min的条件下振荡12-24h，然后分离上清液，该树脂再用50-70体积％乙醇水溶液洗脱12-24h；或动态法，使用尺寸φ2.6×30cm柱，让步骤(i)得到的含有乳清蛋白抗氧化肽酶解物的上清液以流速1-2mL/min通过上述大孔吸附树脂柱，然后该树脂用去离子水以流速1-2mL/min洗涤至电导率小于15μs/cm，再用65-75体积％乙醇水溶液以流速0.5-1mL/min进行洗脱；(iii)蒸发浓缩步骤步骤(ii)得到的乙醇洗脱液在温度50-65℃下进行旋转蒸发浓缩到100-300mg/mL乳清蛋白抗氧化肽，再进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1；(iv)凝胶过滤色谱分离步骤将步骤(iii)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-1制备成10-50mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速为2-3mL/min通过凝胶过滤色谱柱，再用去离子水以洗脱流速12-24mL/h洗脱，得到的组分进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2；(v)制备型高效液相色谱分离步骤将步骤(iv)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-2制备成10-30mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用制备型反相高效液相色谱柱，以流速2-3mL/min进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽冻干物-3；(vi)分析型高效液相色谱分离步骤将步骤(v)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-3制备成10-20mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，以流速0.7-1.5mL/min通过分析型高效液相色谱进行分离，得到的组分然后进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分进行冷冻干燥，得到所述的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-4；(vii)液质联用分析多肽氨基酸序列将步骤(vi)得到的乳清蛋白抗氧化肽冻干物-4制备成5-10mg/mL乳清蛋白抗氧化肽去离子水溶液，使用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，以及母离子m/z1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL的两个抗氧化肽肽段。2.根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白酶是一种或多种选自2709碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex复合蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶、ProteaseN蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白酶。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酸选自无机酸或有机酸，所述的碱选自无机碱或有机碱；所述的无机酸选自盐酸、磷酸或硫酸，所述的有机酸选自乙酸、酒石酸或柠檬酸；所述的无机碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾，所述的有机碱选自乙胺、丙胺或乙醇胺。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂选自DA201-A、DA201-B、DA201-C或DA201-D。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在凝胶过滤色谱步骤中使用的色谱柱是S印hadexG_15。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在制备型高效液相色谱分离步骤中使用的色谱柱为Hedern0DS-2C18P/N84176。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在分析型高效液相色谱分离步骤中使用的色谱柱为C18S/NMT101。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在液质联用分析多肽氨基酸序列使用的色谱柱为BEHC18。9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述制备方法得到的乳清蛋白抗氧化肽。10.根据权利要求9所述的乳清蛋白抗氧化肽在食品、医药、饲料和化妆品中的用途。全文摘要本发明涉及一种乳清蛋白抗氧化肽及其制备方法与它们的用途。本发明利用干酪副产物乳清蛋白和酶制剂，通过酶法水解，制备得到乳清蛋白抗氧化肽酶解物，再将上述酶解物经大孔吸附静态或动态初步纯化、凝胶过滤色谱、制备型高效液相色谱和分析型高效液相色谱分离纯化后得到纯的乳清蛋白抗氧化肽产品，并测定多肽氨基酸序列，该产品具有良好的耐消化、耐热耐酸碱和耐储藏稳定性，较小分子量和特定氨基酸序列，能够有效清除自由基，阻断氧化反应，减少氧化损伤的产生，因此在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有很广阔的应用前景。文档编号A23L1/305GK101775429SQ20101013272公开日2010年7月14日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者凌玉芳,卢蓉蓉,吴慧,孙震,沈浥,赵新灿申请人:江南大学