专利名称：鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法
技术领域：
本发明 涉及一种用于预防由I型和新型鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(duckviral hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitisvirus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀和出血为特征性病变。I 3周龄的雏鸭易感，发病严重，传播迅速，雏鸭通常出现症状后的I小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率90 95%，已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。鸭肝炎病毒(DHV)血清型DHV有4个独立的血清型，I型、2型、3型和新型。范书才等(范书才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报，2009，10)通过试验证明目前在我国同时存在I型和新型DHV流行。血清中和试验表明，I型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个型的DHV中，I型与新型DHV流行最广泛，毒力最强；对3周龄内的雏鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行，致死率低(约20%)。目前国内、外尚无商品化的二价卵黄抗体，由于I型和新型之间无交叉保护作用，I型卵黄抗体很难对流行的新型鸭肝炎病毒进行预防，因此研制I型和新型二价卵黄抗体是预防和控制鸭病毒性肝炎的必然要求，针对此要求我们研制了鸭病毒性肝炎I型和新型二价精制卵黄抗体。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins),简称为IgY。卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血衆蛋白，IgG被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。卵黄抗体的形成过程是当机体受到外界特异性抗原(尤其是灭活抗原)的刺激后诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体IgG(所有亚群)由卵巢IgG受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来，也正是由于这种卵黄累积作用，使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量，而血清中的其他抗体(主要是IgM, IgA)与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75°C条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90°C处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH < 4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在PH4-12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH > 12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4°C保存可达5年以上，活性仅下降5%左右。由于具有这些稳定的理化性质，所以其的开发应用备受人们所关注。对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也在控制该病的流行中发挥着重要作用。由于卵黄抗体成本比较低且比较容易获得，所以已广泛使用于一些疾病的预防和治疗。但由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，所以人们采取各种办法从卵黄中提取分离IgY。常用的方法有聚乙二醇、硫酸葡聚糖、有机溶剂、水稀释法、辛酸法等。在此基础上，我们进行了鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗的研制工作。研制结果表明，我们研制的卵黄抗体效价高，安全性好，保护率高，为预防鸭病毒性肝炎病奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是制备I型和新型鸭肝炎病毒性的两种抗原，并进行合理配制成鸭病毒性肝炎I型和新型二价油乳剂灭活疫苗，用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，可同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此 卵黄具有抗体效价高、保护率高、安全性好等优点。本发明所涉及的卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的抗体，可同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎。该卵黄抗体的主要相关内容和所采用的技术手段(I)选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出效价高、免疫原性好制苗用毒株——鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株。(2)在卵抗的生产过程中用超滤浓缩柱将卵抗经过超滤浓缩，使卵抗的效价高，保护率高。(3)制备鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体主要步骤为①用鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。②将制备的二价灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋。③将收集的高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活。本发明详细描述一、生产用毒株制苗免疫原用鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus) I型YBHl株和新型YBHX株，均由青岛易邦生物公程有限公司分离、鉴定、保管和供应。国内分离株I型YBHl株和新型YBHX株(两型毒株均是2008年从山东省某鸭场病死鸭的肝脏中分离)，已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。二、疫苗(免疫原)的制备I.制苗用病毒液的制备(I)YBHl株病毒液制备将生产用毒种YBHl株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸡胚，置2 8°C放置4 12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。(2)YBHX株病毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12 13日龄易感鸭胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸭胚，置2 8°C 4 12小时，收取尿囊液、羊水及胚体(去掉头和四肢)。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min,取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。2.浓缩将收获的YBH l株和YBHX株病毒液在2 8°C条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称“现行《中国兽药典》”)规定进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。每O. 2ml病毒含量均应不低于IO6 3ELD5tlt5浓缩后的胚液随即进行灭活。3.灭活分别将浓缩后的YBHl株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为O. 2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时(以罐内温度达到37°C开始计时)后取出，置2 8°C保存，应不超过3个月。4.鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗半成品检验(I)无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。(2)病毒含量测定浓缩后YBHl株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ、个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚O. 2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚O. 2ml。置36 37 °C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算 ELD50。浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6、10_74个稀释度，分别尿囊腔接种12 13日龄易感鸭胚5枚，每胚
O.2ml。同时设生理盐水对照，每胚O. 2ml。置36 37 °C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。 ③灭活检验分别将YBHl株和YBHX株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12 13日龄易感鸭胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C继续孵育，连续观察168小时。5.灭活疫苗的制备经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再加司本一 806份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。水相制备将灭活检验合格的YBHl株和YBHX株病毒液适当比例混合，使每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量均不低于106_ 1ELD5tlt5取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20 30min，使吐温-80完全溶解。乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分钟。乳化后，取IOml,以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相 < O. 5ml。二、疫苗成品检验( I)性状外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均应不扩散。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过O. 5ml。
黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。(4)安全检验用21 35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗2. Oml,同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。(5)效力检验用21 35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，O. 5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定I型和新型鸭肝炎病毒中和抗体效价。免疫组抗体效价，应均不低于1:64，对照组应均为阴性。三、高免蛋的制备I..免疫程序颈部皮下或肌肉注射基础免疫于开产前2 3周做基础免疫，Iml/只；第2次免疫基础免疫后2周，加强免疫，2ml/只；第3次免疫第2次免疫后2周，加强免疫2ml/只；第4次免疫第3次免疫后2周，加强免疫2ml/只；第N次免疫第4次免疫后，每隔6 8周，加强免疫，2ml/只。2..高免蛋收集第4次免疫后第14日，测定卵黄中I型和新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。抗体效价均不低于1:1024为合格。收集高免鸡蛋，2 8°C贮存备用，贮存时间应不超过7日。四、鸭病毒性肝炎卵黄抗体制造及检验I.卵黄抗体制造(I)将高免蛋浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75%的酒精对蛋壳表面消毒后备用。(2)卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。(3)灭活I将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80°C 30min消毒，并冷却至65°C以下),搅拌混勻后,60 65°C保温(灭活)30min。(4)酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄4倍体积冷却至4°C的注射用水。然后加入卵黄液，开启搅拌机搅拌。混匀后用111101/1盐酸调？!1值至5.4。2 8°C静置12小时。酸化完成后，6000r/min离心15min，离心后取上清液。(5)灭活II在分离的上清液中加入终浓度为O. 2% (体积比)的辛酸作灭活剂和萃提剂，搅拌均匀，2 8°C放置4 8小时。(6)粗滤用无菌滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。(7)除菌过滤用O. 22 μ m微孔芯过滤除菌。置2 8°C存放，应不超过14日。同时取样检测I型和新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。(8)浓缩如检测的I型或新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价低于1:256，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2 8°C条件下，用30 50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩至原体积的1/3，浓缩后的I型和新型鸭肝炎病毒中和抗体效价应均不低于1:256。(9)灭活III将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10%的甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为O. 1%，37°C灭活16小时。 (10)阻断灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2% (质量体积比W/V)，充分混合，取样后迅速置4°C保存。2.卵黄抗体成品的检验(I)性状本品为淡黄色的透明液体。pH值应为6. 8 7. 2。(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。(4)安全检验用I 3日龄易感雏鸭(I型和新型鸭肝炎母源抗体均< 1:4)10只，各肌肉分点注射本品2. Oml0观察14日，易感雏鸭应全部健活。(5)效力检验(参见表5)血清学方法按附注I方法测定中和抗体效价，成品中鸭病毒性肝炎YBHl株和YBHX株卵黄抗体效价均应不低于1:256。免疫攻毒法3 7日龄易感雏鸭(I型和新型鸭肝炎病毒母源抗体均< 1:4)40只，随机分成A、B、C、D组，每组10只。A、B为免疫组，颈部皮下或肌肉注射本品，每只O. 5ml ；C、D为攻毒对照组，颈部皮下或肌肉注射生理盐水，每只O. 5ml，隔离饲养。16小时后A、C组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBHl株鸭肝炎病毒，每只O. 5ml ;B、D组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBHX株鸭肝炎病毒，每只O. 5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。A、B组攻毒后应至少8只健活；C、D组应于攻毒16小时后开始发病，10日内至少8只死亡。本发明所涉及微生物本发明涉及鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus) YBHl株和YBHX株，以上2个毒株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。本发明的积极意义本发明涉及鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的生产方法。本发明从鸭病毒性肝炎病毒优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭病毒性肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株疫苗制备毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，能同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此卵黄具有高效、安全性好、保护率高等优点。实施例以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例I——疫苗(免疫原)制备I.制苗用病毒液的制备(I)YBHl株毒液制备将生产用毒种YBHl株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚100枚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育,每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸡胚，置2 8°C放置4 12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。(参见表I)。 (2)YBHX株毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12 13日龄易感鸭胚100枚，每胚O. 2ml, 36 37°C孵育，每日2次照胚检查。接种后48 120小时内死亡的鸭胚，置2 8V 4 12小时，收取尿囊液、羊水及胚体(去掉头和四肢)。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2 8°C保存。(参见表I)。表I毒液的制备
毒株名称~胚品种 I接种胚数(枚) 胚日龄I收获胚液(ml)
YBHl 株SPF 鸡胚 0010 Τ00
YBHX株易感鸭胚1001212002.浓缩将收获的YBHl株和YBHX株病毒液在2 8°C条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。YBHl株病毒液每O. 2ml病毒含量为106· 3ELD5tl, YBHX株病毒液每O. 2ml病毒含量为IO6 5ELD50 0浓缩后的胚液随即进行灭活。(参见表2)。表2毒液浓缩
浓缩前浓缩后
毒株名称病毒含量病毒含量
数量(nil)数量(ml)
(107'0.2ml)(1070.2ml )
YBHI 株11006. I3506. 3
YBHX 株 2006^34006^53.灭活分别将浓缩后的YBHl株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为O. 2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时(以罐内温度达到37°C开始计时)后取出，置2 8°C保存。
4.疫苗半成品检验(I)无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。(2)病毒含量测定I)浓缩后YBHl株病毒含 量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6、10_74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚O. 2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚O. 2ml。置36 37°C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD50,为 IO6 302)浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_4、10_5、10_6、10_74个稀释度，分别尿囊腔接种12 13日龄易感鸭胚5枚，每胚
O.2ml。同时设生理盐水对照，每胚O. 2ml。置36 37 °C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD50,为 IO6 50(3)灭活检验分别将YBHl株和YBHX株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12 13日龄易感鸭胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C继续孵育，连续观察168小时，鸡胚和鸭胚均无死亡。5.灭活疫苗的制备经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计，参见表3)。(I)油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再加司本一 806份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。(2)水相制备将灭活检验合格的YBHl株和YBHX株病毒液混合，检测每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量，分别为IO61ELD5tl和106 3ELD5(I。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20 30min，使吐温-80完全溶解。(3)乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分钟。乳化后,取IOml,以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。(4)分装定量分装，加盖密封。表3疫苗乳化和分装
权利要求
1.一种鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体，其特征在于该卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的抗体，可同时预防由I型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。
2.权利要求I所述鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于 (1)鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442 ； (2)用鸭肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗； (3)用制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋； (4)由高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体。
全文摘要
本发明涉及鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的生产方法。本发明从鸭肝炎病毒优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，此卵黄具有高效、安全性好、保护率高等优点。
文档编号C07K16/02GK102827275SQ20121033659
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者徐保娟, 宫晓, 郭伟伟, 王龙, 孙健, 胡潇 申请人:青岛易邦生物工程有限公司