专利名称：抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域中的一种免疫球蛋白及其制备方法，尤其是涉及抗孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)毒鸡卵黄抗体及其制备。
背景技术：
毒蛇咬伤突发性强、病情重、进展快及死亡率高，尽快、尽早应用特异性抗蛇毒血清是治疗蛇伤最有效的方法。在我国南方的剧毒蛇中，属眼镜蛇亚科的眼镜蛇主要有2种，即中华眼镜蛇(Naja atra)及孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)。中华眼镜蛇又称舟山眼镜蛇，以其项背具有明显的白色眼镜状斑纹为特征，该蛇咬伤的首选特效药为精制中华眼镜蛇抗毒血清。孟加拉眼镜蛇又称泰国眼镜蛇，项背的＂眼镜＂状斑仅有单个圆圈，原分布于广西西南部、云南南部及西部、孟加拉、印度东北部、尼泊尔、泰国、缅甸、越南与柬埔寨等地，近年来该蛇大量流入广东、福建等地。孟加拉眼镜蛇毒性较中华眼镜蛇更大，因国内尚无孟加拉眼镜蛇抗毒血清，故被该蛇咬伤者致残、致死率较高。目前，临床多采用两种抗毒血清联合注射(精制中华眼镜蛇抗毒血清+银环蛇血清)的方式以治疗孟加拉眼镜蛇咬伤。
国产的精制抗蛇毒血清系用脱毒的蛇毒免疫马匹，血浆经胃酶消化、硫酸铵盐析后，再进一步精制提纯，制成以去除Fc片段的IgG为主要成分的单价抗血清制剂。由于该制剂的制备至今还采用上世纪70年代的生产工艺，且价格昂贵、过敏反应率高(多见有皮疹、喉头水肿、血压下降，四肢关节疼痛、血清病、过敏性休克等III型变态反应)，故极大地限制了其的临床应用。
近年来的研究表明，用原始、脱毒或γ射线照射的蛇毒作抗原，免疫母鸡后12-15天，即可从鸡卵黄中分离出相应的免疫球蛋白，简称为卵黄抗体(Immunoglobulin yolk，简称IgY)。IgY在结构上类似哺乳动物IgG，其分子量为180～210KD，包括1条67-70KD的重链和2条22-30的轻链。与现有的马血清IgG相比，IgY具有产率高、成本低、稳定性好、特异性强、过敏性小及显著减少由于抗体采集而造成对动物的伤害等优点，因此，IgY已成为新一代蛇伤特效药物研制的一个重要方向。由于多价鸡卵黄蛇毒抗体制备成本低、产量大、安全性高，除可替代马血清供注射外，还可开发为口服制剂，后者在蛇伤预防方面有广阔的应用前景，社会及经济效益更为可观。
目前，国内外学者已制备出了抗巴西抗响尾蛇毒、抗具窍腹蛇毒、抗蝰蛇毒、抗蝮蛇毒抗眼镜王蛇毒及抗中华眼镜蛇等数种IgY，其在亲和力及特异性方面均明显高于马源抗血清，但至今尚无抗孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)毒鸡卵黄抗体制备及其应用方面的报道。
发明内容
为了克服现有的品种及制备方面的不足，本发明的目的是提供一种抗孟加拉眼镜蛇毒IgY。
本发明所提供的孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体IgY，其特征是在非还原型SDS-PAGE上呈现单一条带，分子量约为200KD；在还原SDS-PAGE上显示为65KD及35KD 2条带，所述的还原SDS-PAGE的分离胶浓度为10％；采用Western Blot检测，PVDF膜上可见至少13条染色条带，分子量为100～0.7KD。
本发明的另一个目的是提供一种抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法。
它通过以下技术措施来实现的，一种抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法包括以下步骤(1)鸡卵黄抗体提取取经注射孟加拉眼镜蛇毒抗原免疫后的母鸡产下的鸡蛋，用水稀释法从蛋黄液中提取卵黄抗体IgY粗品，去离子水与蛋黄液的比率5～12∶1，调pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤浓缩，溶液浓度15～25mg/ml；(2)用硫酸铵盐析法纯化IgY，加入饱和硫酸铵至40～60％饱和度，4℃放置2小时，离心，弃上清，沉淀溶入PBS，超滤脱盐、浓缩。
本发明可进一步纯化用阴离子交换层析进一步纯化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分别以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH 7.0)梯度洗脱，收集目的溶液，超滤脱盐、浓缩，冻干，4℃保存。所得抗孟加拉眼镜蛇毒IgY的纯度可达95％以上，其分子量约为200KD。
本发明步骤1中抗原制备利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼镜蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸馏水稀释，离心，低温真空干燥为冻干粉。使用戊二醛对蛇毒进行减毒处理，毒性测定，层析除盐，与福氏佐剂乳化而制成抗原；本发明步骤1中鸡卵黄抗体制备抗原经鸡皮下及肌肉多位点注射，初次免疫采用福氏完全佐剂乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐剂乳化蛇毒，第二次免疫与第一次间隔2周，后续免疫间隔为4周。于初次免疫后的第12d收集鸡蛋，可持续收集达6～8个月；本发明所述的步骤1中，去离子水与蛋黄液的比率优选为9∶1，pH优选为5.1，4℃放置时间优选8h，浓缩所得的溶液浓度优选为20mg/ml。
本发明所述的步骤2中，所述的加入饱和硫酸铵的饱和度为50％。
本发明的抗孟加拉眼镜蛇毒IgY的制备方法适用范围较广泛，可用于制备各种抗蛇毒IgY，所得到的抗体可用于制备预防和/或治疗因毒蛇咬伤所引起的相关重症的药品、保健食品等，也可用于制备检测相关蛇毒的检验试剂。
本发明的抗孟加拉眼镜蛇毒IgY由孟加拉眼镜蛇毒免疫产卵母鸡而得，不但对孟加拉眼镜蛇毒有专一的特异性，对眼镜蛇科的其他属、种的毒蛇，如中华眼镜蛇等咬伤也有良好的治疗效果。
本发明的抗孟加拉眼镜蛇毒IgY采用鸡卵为载体，避免了因抗体采集而造成对动物的伤害，符合欧、美对动物权益的保护法规，还因为其化学性质稳定、产量高、成本低等优势，故更适于产业化生产。
图1是制备抗孟加拉眼镜蛇毒IgY方法及其检测的工艺流程图。
具体实施例方式
抗孟加拉眼镜蛇毒IgY的制备实施例1(1)孟加拉眼镜蛇毒抗原制备成年孟加拉眼镜蛇，体重1.5～2.0kg，使用专利号为200420046279.9所公开的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸馏水稀释，离心，真空、低温干燥为冻干粉。取蛇毒冻干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得温度下放置2h后，利用Sephadex G-25层析除去盐分，测定蛇毒LD50。
(2)佐剂乳化及鸡免疫取22周龄的莱杭母鸡(体重1.0±0.1kg)，将孟加拉眼镜蛇毒与福氏佐剂按1∶1(V/V)充分乳化后，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射。初次免疫采用福氏完全佐剂乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐剂乳化蛇毒，第二次免疫与第一次间隔2周，后续免疫间隔为4周。于初次免疫后的第12d收集鸡蛋，可持续收集达6～8个月，编号后于4℃保存，留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。
动物饲养条件单元式笼养，一鸡一舍，舍内配有栖木及干草束，喂以标准蛋鸡饲料及清洁水。
(3)提取水稀释法取免疫后鸡蛋，去蛋白，分离出蛋黄液，用10倍去离子水搅拌下稀释，用0.1mol/L HCl调pH至5.1，4℃放置8h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤，浓缩为IgY水提物，溶液浓度为20mg/ml。
(4)纯化
①硫酸铵盐析IgY水提物加入饱和硫酸铵至50％饱和度，充分混匀，4℃放置2小时，离心，弃上清，沉淀溶入PBS，用孔径为100KD的滤膜超滤脱盐、浓缩为IgY盐析物；②阴离子交换层析IgY盐析物再经DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)层析，分别以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脱，收集目的溶液，超滤脱盐、浓缩为IgY层析物，冻干，4℃保存备用。
实施例2(1)孟加拉眼镜蛇毒抗原制备成年孟加拉眼镜蛇，体重1.5～2.0kg，使用专利号为200420046279.9所公开的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸馏水稀释，离心，真空、低温干燥为冻干粉。取蛇毒冻干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得温度下放置2h后，利用Sephadex G-25层析除去盐分，测定蛇毒LD50。
(2)佐剂乳化及鸡免疫取22周龄的莱杭母鸡(体重1.0±0.1kg)，将孟加拉眼镜蛇毒与福氏佐剂按1∶1(V/V)充分乳化后，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射。初次免疫采用福氏完全佐剂乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐剂乳化蛇毒，第二次免疫与第一次间隔2周，后续免疫间隔为4周。于初次免疫后的第12d收集鸡蛋，可持续收集达6～8个月，编号后于4℃保存，留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。
动物饲养条件单元式笼养，一鸡一舍，舍内配有栖木及干草束，喂以标准蛋鸡饲料及清洁水。
(3)提取水稀释法取免疫后鸡蛋，去蛋白，分离出蛋黄液，用6倍去离子水搅拌下稀释，用0.1mol/LHCl调pH至4，4℃放置8h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤，浓缩为IgY水提物，溶液浓度为15mg/ml。
(4)纯化③铵盐析IgY水提物加入饱和硫酸铵至40％饱和度，充分混匀，4℃放置2小时，离心，弃上清，沉淀溶入PBS，用孔径为100KD的滤膜超滤脱盐、浓缩为IgY盐析物；④子交换层析IgY盐析物再经DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)层析，分别以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脱，收集目的溶液，超滤脱盐、浓缩为IgY层析物，冻干，4℃保存备用。
实施例3(1)孟加拉眼镜蛇毒抗原制备成年孟加拉眼镜蛇，体重1.5～2.0kg，使用专利号为200420046279.9所公开的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸馏水稀释，离心，真空、低温干燥为冻干粉。取蛇毒冻干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得温度下放置2h后，利用Sephadex G-25层析除去盐分，测定蛇毒LD50。
(2)佐剂乳化及鸡免疫取22周龄的莱杭母鸡(体重1.0±0.1kg)，将孟加拉眼镜蛇毒与福氏佐剂按1∶1(V/V)充分乳化后，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射。初次免疫采用福氏完全佐剂乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐剂乳化蛇毒，第二次免疫与第一次间隔2周，后续免疫间隔为4周。于初次免疫后的第12d收集鸡蛋，可持续收集达6～8个月，编号后于4℃保存，留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。
动物饲养条件单元式笼养，一鸡一舍，舍内配有栖木及干草束，喂以标准蛋鸡饲料及清洁水。
(3)提取水稀释法取免疫后鸡蛋，去蛋白，分离出蛋黄液，用13倍去离子水搅拌下稀释，用0.1mol/L HCl调pH至8，4℃放置8h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤，浓缩为IgY水提物，溶液浓度为25mg/ml。
(4)纯化⑤铵盐析IgY水提物加入饱和硫酸铵至60％饱和度，充分混匀，4℃放置2小时，离心，弃上清，沉淀溶入PBS，用孔径为100KD的滤膜超滤脱盐、浓缩为IgY盐析物；⑥子交换层析IgY盐析物再经DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)层析，分别以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脱，收集目的溶液，超滤脱盐、浓缩为IgY层析物，冻干，4℃保存备用。
试验例1抗孟加拉眼镜蛇毒IgY的效价及纯度检测抗孟加拉眼镜蛇毒IgY效价及纯度检测的具体步骤如下(1)效价测定①双向免疫扩散法用0.9％氯化钠溶液配制成1.5％琼脂糖凝胶，煮沸熔化后倒入平板中，室温放置15min，打孔，7孔为一组，中央1孔，周边6孔，孔径均为4mm，中心孔加孟加拉眼镜蛇毒150μg/15μl，周围孔加1∶2～64倍比稀释的IgY溶液15μl，1∶2孔的抗体起始浓度均为30mg/ml，置37℃水浴锅孵育24～48h，考马斯亮兰R-50染色。结果显示IgY水提物的效价为1∶2，IgY盐析物的效价为1∶8，IgY层析物的效价达到1∶16。
②间接Elisa法以20μg/ml pH9.6孟加拉眼镜蛇毒碳酸缓冲液100μl/孔包被96孔酶标板，4℃放置过夜；以pH7.4 0.05％PBS Tween 20缓冲液洗涤酶标板3次，再以含3％BSA的0.01％PBS-Tween 20封闭液100μl/孔封闭酶标板，37℃温育2h；取出后洗涤、甩干，每孔加IgY稀释液100μl，以非免疫卵黄的提取液作阴性对照，37℃温育1.5h；洗涤后加入兔抗鸡IgY-HRP，显色，酶标仪测定A值，计算批内及批间差异。结果显示IgY水提物效价为6.33×104；IgY盐析物效价为65.17×104，IgY层析物效价为104.58×104。批内差异为1.57％，批间差异为7.32％。
(2)纯度及分子量测定参照《分子克隆实验指南》，按SDS-PAGE法进行。还原、非还原SDS-PAGE浓缩胶浓度均为5％，分离胶浓度均为10％，上样量约为100μg。结果显示IgY水提物含6个主要杂质带，分子量分别为25KD和50～66KD之间，经50％硫酸铵沉淀去除了56～66KD之间的4条杂质带，经DEAE柱层析进一步去除了25KD附近的2条杂质带，IgY层析物在非还原型SDS-PAGE上仅显示一条浓染带，达到电泳纯度。加入DTT后，IgY二硫键被打开，显示IgY的重链约为65KD，轻链约为35KD，据此计算出IgY分子量约为200KD。
(3)交叉免疫性测定制备琼脂糖凝胶板，打孔，5孔为一组(中央1孔，周边4孔)，中央孔加蛇毒15μl，周边孔加倍比稀释(1∶2～16)的IgY层析物溶液15μl，1∶2孔的IgY起始浓度均为30mg/ml，，于37℃培养箱放置40小时作免疫扩散。观察中央孔与周边孔之间的沉淀线。结果显示经层析纯化的抗孟加拉眼镜蛇毒IgY对舟山眼镜蛇(Naja atra，Na)及眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah，Oh)有高度交叉免疫(+++)，对银环蛇(Bungarusmulticinctus，Bm)、金环蛇(Bungarus fasciatus，Bf)及国产圆斑蝰(Vipera russelii inChina，VrC)有中度交叉免疫(++)。该结果表明，抗孟加拉眼镜蛇毒IgY除可用于眼镜蛇科毒蛇咬伤的治疗外，还可作为抗圆斑蝰抗体的替代品用于临床急救。
试验例2抗孟加拉眼镜蛇毒IgY对蛇毒的中和及保护性实验抗孟加拉眼镜蛇毒IgY中和及保护性实验的具体步骤如下(1)Western Blot检测孟加拉眼镜蛇毒经SDS-PAGE电泳，转入PVDF膜，封闭液中缓慢摇荡1小时，抗体层析物孵育，4℃静置12h，用PBST漂洗，兔抗鸡IgY-HRP孵育1h，漂洗，DAB显色。结果显示PVDF膜上可见13条黄褐色条带，分子量从100～0.7KD，说明IgY层析物对孟加拉眼镜蛇毒的主要抗原均有特异性地结合。
(2)动物保护实验选用NIH系健康小鼠20只，随机分成2组，每组10只。试验组将孟加拉眼镜蛇毒1.5mg/kg与IgY层析物10mg/kg在无菌试管内混合，置25℃恒温水浴箱中孵育60min，腹腔注射。对照组将孟加拉眼镜蛇毒1.5mg/kg直接进行腹腔给药，记录给药后24h内小鼠的存活率。结果显示试验组10只小鼠全部存活，而对照组均2h内死亡。该试验表明，IgY层析物可特异性中和孟加拉眼镜蛇毒，阻止孟加拉眼镜蛇毒对机体的攻击。
权利要求
1.一种制备孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体其特征是在非还原型SDS-PAGE上呈现单一条带，分子量约为200KD；在还原SDS-PAGE上显示为65KD及35KD 2条带，所述的还原SDS-PAGE的分离胶浓度为10％；采用Western Blot检测，PVDF膜上可见至少13条染色条带，分子量为100～0.7KD。
2.一种制备抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体的方法，其特征是包括以下步骤(1)鸡卵黄抗体提取取经注射孟加拉眼镜蛇毒抗原免疫后的母鸡产下的鸡蛋，用水稀释法从蛋黄液中提取lgY粗品，去离子水与蛋黄液的比率5～12∶1，调pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤浓缩，溶液浓度15～25mg/ml；(2)用硫酸铵盐析法纯化IgY，加入饱和硫酸铵至40～60％饱和度，4℃放置2小时，离心，弃上清，沉淀溶入PBS，超滤脱盐、浓缩。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是对步骤(2)所得的产物进一步纯化用阴离子交换层析进一步纯化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分别以0.075、0.15及0.3mol/LpH 7.0的PB梯度洗脱，收集目的溶液，超滤脱盐、浓缩，冻干，4℃保存。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤(1)中孟加拉眼镜蛇毒抗原抗原制备利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼镜蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸馏水稀释，离心，低温真空干燥为冻干粉；使用戊二醛对蛇毒进行减毒，层析除盐，与福氏佐剂乳化而制成抗原。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的步骤(1)中，去离子水与蛋黄液的比率为9∶1，pH为5.1，4℃放置8h，4℃离心15min/19000g，上清经超滤浓缩，溶液浓度为20mg/ml。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的步骤(2)中，所述的加入饱和硫酸铵的饱和度为50％。
全文摘要
本发明的目的是提供一种抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体(IgY)及其制备方法。本发明通过水稀释法从蛋黄液中提取IgY粗品，再用硫酸铵盐析法纯化IgY，取沉淀溶入PBS，超滤脱盐、浓缩；用阴离子交换层析进一步纯化lgY，超滤脱盐、浓缩，冻干，保存备用。所述的IgY在非还原型SDS－PAGE上呈现单一条带，分子量约为200KD；在还原SDS－PAGE上显示为65KD及35KD 2条带，所述的还原SDS－PAGE的分离胶浓度为10％；采用Western Blot检测，PVDF膜上可见至少13条染色条带，分子量为100～0.7KD。该抗孟加拉眼镜蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法适用范围较广泛，可用于制备各种抗蛇毒鸡卵黄抗体，所得到的抗体可用于制备预防 和/或治疗因毒蛇咬伤所引起的相关重症的药品、保健食品等，也可用于制备检测相关蛇毒的检验试剂。
文档编号C07K1/00GK1858064SQ20061003576
公开日2006年11月8日 申请日期2006年6月2日 优先权日2006年6月2日
发明者孔天翰, 刘四红, 董伟华, 黄热平, 黄劭, 覃媛 申请人:广州蛇毒研究所, 孔天翰