一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用。一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM的MgCl2，反应体系pH值为6.5-8.0。酶制剂为缓冲溶液时，该缓冲溶液一般为pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。酶制剂中邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量一般为0.03-0.1mg／mL。本发明的酶制剂通过优选添加金属化合物，使得本发明的酶制剂酶活高，降解ONBA效果优异；所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制备，成本低，有利于大规模推广；采用酶法降解ONBA，不仅效果好，且操作简单、安全、所需反应条件温和，不形成二次污染。
【专利说明】一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用。【背景技术】
[0002]随着我国工业化进程的加快，有机工业合成废水的排放量越来越大。有机工业合成废水不仅含大量有机物，且存在大量对生物体有毒害作用的物质，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。参照急性毒性分级标准，邻硝基苯甲醛(o-nitrobenzaldehyde，0ΝΒΑ)为中等毒性化合物。ONBA是重要的精细有机化工中间体,广泛用于医药、染料和有机合成，如用于合成抗心绞痛药物硝基吡唳(心痛定)、邻硝基苯乙烯类及邻硝基肉桂酸类系列产品等。将其硝基还原成氨基后，所得到的邻氨基苯甲醛还可用于喹啉类化合物的合成，其工业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家(污染转移)，这一点在我国东南部地区尤为明显。具不完全统计，东南地区年产邻硝基苯甲醛在70万吨以上，且绝大多数生产废水未经处理就直接排放，对周边环境造成了极大的损害。在一定程度上，可以说这一点源污染已成为面源污染。
[0003]硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化学法和微生物降解法三种。物理和化学方法虽然能够有效去除此类物质，但成本高，需要特制的仪器和装备，且酸、碱易腐蚀，具有一定的危险性。实际上，硝基芳香化合物在环境中的降解和转化主要是由微生物完成的(微生物对其的代谢多通过一系列酶促反应完成)。因此，如何充分利用功能微生物资源，去除特异性污染物，成为了相关环境修复的研究热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂。
[0005]本发明的另一目的是提供该酶制剂的应用。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0007]—种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM的MgCl2,反应体系pH值为6.5-8.0。酶制剂为缓冲溶液时，该缓冲溶液一般为pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。酶制剂中邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量一般为0.03-0.1mg / mL。进一步的，所述的MgCl2终浓度为0.2mM。
[0008]一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂的制备方法，其特征在于:取纯化酶液样本20mL和氯化镁，用pH值7.5的80mM磷酸钠缓冲液定容至IL制成酶制剂，酶制剂中氯化镁的终浓度为 0.1-0.3mM0
[0009]所述纯化酶液样本的制备方法如下:挑取含有重组质粒的菌株，该重组质粒上含有nbaA基因编码片段，用LB培养基于37°C培养，待A6tltlnm值为0.6时，加入IPTG至终浓度ImM,随后于20°C过夜表达；离心收集细胞，重悬于80mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，在冰水浴中超声破碎细胞——功率为400W超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环；随后，于4°C，1000Og离心30min去除细胞碎片，上清液即为粗酶提取液；使用一站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒对所述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本。
[0010]一种所述的酶制剂在降解土壤中邻硝基苯甲醛中的应用。应用所述酶制剂降解土壤中邻硝基苯甲醛时，体系温度为18-40°c，pH为6.0-8.5。
[0011]本发明通过克隆Pseudomonas sp.0NBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了 ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。该菌是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.8095。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为假单胞菌 Pseudomonas sp.。
[0012]本发明采用的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U / mg,分别是NahF酶活力(552U / mg)和 NahV 酶活力(245U / mg)的 442.4%和 996.7%，显著强于二者。而 nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62%和89%。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。
[0013]本发明酶制剂的有益效果主要体现在以下几个方面:
[0014](I)通过优选添加金属化合物，使得本发明的酶制剂酶活高，降解ONBA效果优异；
[0015](2)本发明的酶制剂，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制备，成本低，有利于大规模推广；
[0016](3)本发明的酶制剂`，采用酶法降解0ΝΒΑ，不仅效果好，且操作简单、安全、所需反应条件温和，不形成二次污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA(Genomic DNA)电泳检测图。
[0018]图2是pH值对NbaA酶活力的影响图。
[0019]图3是不同处理土壤样品中ONBA含量变化曲线。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0021]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
[0022]实施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA (Genomic DNA)的提取
[0023]1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的扩大培养
[0024]在无菌操作环境下，将_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接种针挑取小块，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固体培养基之上。28°C，静置培养3d。挑选单菌落，经2次转接，观察发现平板上菌落形态一致(无杂菌)。这里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固体/液体培养基等均为微生物研究/生产领域常见术语、培养基、技术和方法，具体参见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，等著.分子克隆实验指南(第三版)[M].黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008)。下文中如无特别备注或说明，均为微生物研究常用技术、方法、培养基、试剂和药品，且均在《分子克隆实验指南》中有所记录。
[0025]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA 的提取
[0026]菌体总DNA的提取采用SDS高盐沉淀法。挑取LB平板上的单菌落，接至IOOmL的LB液体培养基培养至稳定期。离心收集菌体，加等体积的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0),0.1M NaCl]洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 IOmLTE [IOmM Tris-Cl (pH8.0), ImM EDTA (pH8.0)]溶液中，加入 100 μ L 溶菌酶(IOOmg / mL)，37°〇水浴111，加入4(^1^蛋白酶1((2011^ / mL)，再加入 300 μ L20% (w / v% )的 SDS，37°C水浴过夜(约12h)。加入I / 2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000g离心lOmin，上清用等体积酚:氯仿抽提2次，12000g离心lOmin，收集上清，加入等体积TE溶液(稀释调整NaCl浓度)，0.6倍体积异丙醇沉淀，12000g离心15min，70% (v / v% )乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100 μ L TE中。
[0027]将提取到的菌体总DNA适当稀释后，经0.75% (w / ν% )琼脂糖电泳检测其质量(如图1所示)，发现所提取的总DNA大部分集中在23kb左右，基本上没有RNA存在，纯度较好，浓度较高。
[0028]实施例20NBA降解酶编码基因nbaA的获得
[0029]经过大量的分析实验，从40对自行设计的引物中筛选出一对有效扩增引物(分别记为 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0030]nbaA-f，5’ ~ACGACCATATGAAGGTACAACTGGTGAT~3J (下划线为 NdeI 酶切位点，基因序列为 SEQ ID N0.3)；
[0031]nbaA-r, 5，_CATCAAAGCTTGAAGGGATAAGGCTGGCC_3，(下划线为 Hi ndl I I 酶切位点，基因序列为SEQ ID N0.4) ο
[0032]25 μ L扩增体系:10 X Taq DNA聚合酶反应缓冲液2.5 μ L ;dNTP (25mM) 2 μ L ;引物(25pmol / μ L)各 0.5 μ L ；Mg2+ 缓冲液(25mM) 2.5 μ L ;实施例1 中所得总 DNA0.5 μ L (约IOOng) ;Taq 酶(5U / μ L) 0.3 μ L ;ddH2016.2 μ L。反应参数:95°C预变性 5min，94°C变性30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸25 个循环，最后 72°C终延伸 5min。
[0033]扩增产物经0.75% (w / v%)琼脂糖电泳检测，发现扩增片段与预期大小(1.4kb左右)相符。切取含有nbaA基因扩增片段的凝胶，放入无菌1.5mL离心管中称重，使用B10MIGA胶回收纯化试剂盒进行目的片段回收，4°C保存备用。
[0034]参照《分子克隆实验指南》，用Nde I和HindIII消化上述回收片段，再将片段插入到用上述同种内切酶消化过的pET21b(+)载体中。挑取质粒，经琼脂糖凝胶电泳验证插入片段后，挑取克隆子交上海生工测序。所得nbaA编码基因序列如SEQID N0.2所示(由1446个核苷酸组成)，其相应氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(482个氨基酸组成)。基因序列比对先是登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，再经BLAST搜索引擎搜寻GenBank完成。结果显示，同nbaA编码基因序列同源的功能基因最高序列同源性仅为90% (GQ848198.1)，且GQ848198.1指代基因未见其关于ONBA降解的报道。而同NbaA氨基酸序列同源的蛋白(水杨醛脱氢酶，YP_006536128.1)最高序列同源性不足90 %，且YP_006536128.1指代蛋白未见其关于ONBA降解的报道。
[0035]实施例3表达载体的构建、表达与纯化
[0036]用NdeI和HindIII消化上述实施例2中的nbaA基因扩增产物，再将片段插入到用上述同种内切酶消化过的pET21b(+)载体中。在重组质粒中，nbaA基因由T7启动子启动，表达产物C端带有6个组氨酸标签，氨苄青霉素为筛选标记。联入片段经上海生工测序验证，以确保PCR过程中没有引入突变。
[0037]重组质粒转入Escherichia coli BL21 (DE3)，随后挑取含有重组质粒的菌株(编号为K-7)，经上海生工测序验证外源基因导入情况，证实外源基因导入成功。
[0038]K-7用LB培养基于37°C培养，待A6tltlnm值为0.6时，加入IPTG至终浓度ImM，随后于20°C过夜表达，以避免包涵体产生。离心收集细胞，重悬于80mM的磷酸钠缓冲液(pH7.5)，在冰水浴中超声(功率为400W)破碎细胞——超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环。随后，于4°C，10000g离心30min去除细胞碎片。上清液即为粗酶提取液，低温保存。该步骤实验进行同时，设置未转入重组质粒的E.coli BL2KDE3)作为对照，并同样进行诱导、离心、破碎和收集粗酶提取液等步骤。
[0039]使用一站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(N1-NTA Spin Ki t，QIAGEN)对上述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本(其中邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为3.5mg /mL)，所有操作均在低温环境下进行。
[0040]实施例4NbaA蛋白对ONBA的作用效果
[0041]参照赵化冰等人研究(赵化冰，李永君，陈威，蔡宝立.恶臭假单胞菌ND6菌株中与萘降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV.科学通报，2007，52:1257-1262)，采用上述实施例3中的纯化酶液样本，向0.5mL`的反应体系(含80mM的磷酸钠缓冲液，200 μ M的NAD+，pH7.5，25°C)中加入终浓度为200μ M的ONBA作为反应底物，并测定NbaA酶活力。一个酶活力单位(U)定义为:25°C条件下，每分钟还原lymol NAD+所需的酶量。比活力表示为每毫克蛋白的酶活力单位。蛋白浓度以牛血清白蛋白作为标准参照，通过Bradford法测定。ONBA含量测定参照Yu等人报道进行(Yu Fang-Βο, Shen Bi ao, Li Shun-Peng.1solation and characterization of Pseudomonas sp.strain ONBA-17degradingo-nitriobenzaldehyde.Current Microbiology，2006，53:457-461)。
[0042]结果显示，上述纯化酶液样本对ONBA的酶活力为2442U / mg (该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为5.6U / mg)，对照(实施例3中提到的未转入重组质粒E.coliBL21的粗酶提取纯化物)无ONBA降解能力，这也进一步证实了实施例2中所得基因片段的功能作用。较已有报道，本发明得到的NbaA酶活力分别是NahF酶活力(552U / mg)(该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为4.2U / mg)和NahV酶活力(245U / mg)(该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为3.6U / mg)的442.4%和996.7%，显著强于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62%和89%。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。
[0043]将纯化酶液样本在50°C水浴30min后，再通过上述方法测定酶活力。结果表明，在较高温度下NbaA比NahF和NahV更稳定。在50°C保温30min后，NbaA仍保持了 88.4%的酶活力(该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.6% )，而NahF和NahV仅保存了71.4% (该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.7% )和11.2% (该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.2% )的酶活力，差异显著。
[0044]实施例5反应体系pH对酶活性的影响
[0045]参照实施例4准备反应体系,缓冲液仍为80mM的磷酸钠缓冲液(测试pH值分设
5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，以 200 μ M 的 ONBA 为底物，并添加实施例 3 和 4 中提及的纯化酶液样本，结果如图2所示。由图2可知，当反应体系pH值介于6.5和8.0之间时，酶活力保持在较高水平(较高水平指最大酶活性的75%及以上)。
[0046]实施例6添加金属化合物对酶活性的影响
[0047]参照实施例4和5准备反应体系，缓冲液为80mM的磷酸钠缓冲液(pH值7.5)，以200 μ M的ONBA为底物，添加实施例3、4和5中提及的纯化酶液样本，以及终浓度为0.2mM的易溶于水的金属化合物(测试金属离子包括:氯化锂、氯化镁、硝酸银、氯化镍、氯化锌、氯化镉、氯化铜、氯化亚铁、氯化钡和氯化钴)。同时，设置不添加上述测试金属化合物的处理作为对照。结果如表1所示，镍、银、锂、铜和钴离子对酶活有明显的抑制作用，锌、亚铁、钡和镉离子对酶活力影响不显著，镁离子添加可使酶活力较对照提高32%，达显著差异水平。
[0048]表1、金属离子对酶活力的影响
[0049]
【权利要求】
1.一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，其特征在于:所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM 的 MgCl2,反应体系 pH 值为 6.5-8.0。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征在于:所述的邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为 0.03-0.1mg / mLo
3.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征在于:所述的MgCl2终浓度为0.2mM。
4.一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂的制备方法，其特征在于:取纯化酶液样本20mL和氯化镁，用pH值7.5的80mM磷酸钠缓冲液定容至IL制成酶制剂，酶制剂中氯化镁的终浓度为 0.1-0.3mM0
5.根据权利要求1所述的酶制剂的制备方法，其特征在于:所述纯化酶液样本的制备方法如下:挑取含有重组质粒的菌株，该重组质粒上含有nbaA基因编码片段，用LB培养基于37°C培养，待A6tltlnm值为0.6时，加入IPTG至终浓度ImM，随后于20°C过夜表达；离心收集细胞，重悬于80mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，在冰水浴中超声破碎细胞——功率为400W超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环；随后，于4°C，1000Og离心30min去除细胞碎片，上清液即为粗酶提取液；使用一站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒对所述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本。
6.一种权利要求1所述的酶制剂在降解土壤中邻硝基苯甲醛中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:应用权利要求1所述酶制剂降解土壤中邻硝基苯甲醛时，体系温度为18-40°C，pH为6.0-8.5。
【文档编号】B09C1/10GK103497935SQ201310454128
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】虞方伯, 单胜道, 管莉菠, 叶正钱, 骆林平 申请人:浙江农林大学