Cd7受体适配体的制作方法
【技术领域】
[0001]本申请涉及核酸适配体（aptamer)，其能够特异性识别、结合表达淋巴细胞-特异 性CD7受体的细胞和内化到该细胞中。因此，本发明能够用于诊断和治疗与淋巴细胞有关 的疾病和感染。
【背景技术】
[0002] 分子向靶细胞的特异性递送已经使医学领域困惑了数十年之久，并同时产生了对 这种工具的需要。存在大量的将分子递送到细胞中的机制（例如，脂质体、病毒载体和阳离 子多聚物试剂（polyplexreagents))，但这些机制限于一些方式，显然大多数机制并不能 在异质细胞群中选择性递送，如在人类器官和组织中所发现的。为了安全和有效地递送分 子，需要开发替代性医学工具，其不仅是非免疫原性的，而且能够在混合的群中选择性鉴定 靶细胞。适配体已经显示出满足该需要的潜力。
[0003] 适配体是能够被分离以结合于大分子阵列的人工核酸分子（Reviewedin Khati(2010))。与其靶标具有高亲和性的高度选择性适配体的选择和设计使得开发出大量 能够结合分子阵列的适配体。Gold(Tuerk，199)和Szostak(Ellington，1990)小组的先前 的工作分别确定了用于特异性结合于有机染料和T4DNA聚合酶的适配体选择的体外方法。 这种方法被称为指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolutionofLigandsby Exponentialenrichment，SELEX)，其已被应用于简化适配体的选择过程。适配体已被开发 为特异性靶向HIV表面糖蛋白gpl20并抑制病毒进入（Khati，2003 ;Zhou，2009)。利用其 靶标特异性，已经将这些适配体鉴定为用于将Dicer底物siRNA靶向递送至特定细胞的递 送载体（Zhou, 2009 ;McNamara，2006)。短干扰RNA(siRNA)是与辅助分子一起作用以使靶 基因转录后沉默的小RNA分子。这些强力的沉默分子仅在细胞质中活化一次并且不能单独 地有效内化。因此，它们需要活性递送到细胞中。适配体已被鉴定为不仅用于siRNA而且 还用于纳米颗粒的有效递送剂（Dhar，2008)。最近，抗-gpl20适配体和抗-tat/revsiRNA 嵌合体显示出减少人源化小鼠中的病毒复制和辅助性CD4+T细胞耗竭（Neff，2011)。该嵌 合体不会引出内含子应答，这不同于用脂质体或阳离子多聚物试剂介导的siRNA递送所观 察到的（Zhou, 2009)。
[0004] 目前的HIV靶向SiRNA-适配体缀合物通过感染的细胞膜上的靶向HIV糖蛋白 (gpl20)残基而指向感染的淋巴细胞（Zhou，2009)。淋巴细胞/单核细胞中的CD4受体已 被用于革向用于内化作用的适配体-SiRNA嵌合体（Wheeler, 2011)。然而，在1-4μΜ范围 离体条件下作用时，CD4适配体并不是针对内化作用选择的且十分低效。
[0005] ⑶7是在Τ和Β淋巴细胞、自然杀伤细胞和树状突细胞的前体上表达的泛-白细 胞受体（Hao, 2001 ;Sempowki, 1999)，其在Τ细胞激活中起辅助作用（Lazarovits, 1994 ; Stillwell, 2011)并且长存于成熟CD4+细胞的表面上（Cotta, 2006 ;Lobac, 1985)。CD7 作为用于白血病和淋巴瘤治疗的细胞毒性分子递送的靶标已被广泛研究（Peipp，2002 ; Bremmer, 2006 ;Franker, 1997 ;Vallera, 1996 ;Waurzyniak, 1997)。先前已经不出了利用通 过靶向于⑶7缀合至siRNAs的单链单克隆抗体以用于递送HIV治疗剂（siRNAs)，存在病毒 感染的保护性抑制（Kumar，2008)。Kumar(2008)的研究使用了靶向药物递送的抗体，其精 心构思和复杂缀合方法以用于连接效应子分子。
[0006] 因此，仍需要将靶子分子递送至表达⑶7细胞表面受体的细胞的克服了至少一些 上述问题的方法。
【发明内容】
[0007] 根据本发明的第一种实施方式，提供了长度不超过100个核苷酸的适配体分子， 其包含与序列 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC3'（SEQIDN0:3) 具有至少80%同一性的核苷酸序列，
[0008] 其中札为ηx，其中每个η代表任意核苷酸，且X为20至55的整数，并且
[0009] 其中，该适配体分子能够选择性结合于表达⑶7受体的细胞。
[0010]该适配体分子可具有与序列 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCAC AACAGG3'（SEQIDN0:123)或 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAG 3'（SEQIDNO: 124)具有至少80%同一性的核苷酸序列。
[0011]X可更优选地为29至55的整数，并且甚至更优选地为39至55的整数。甚至更优 选地，X可以为39至49的整数。
[0012] 札可以具有SEQIDN0S:4-57中任一个的核苷酸序列。
[0013] 该适配体分子可以包含至少68个核苷酸，并且更优选地包含至少80个核苷酸，例 如84至90个核苷酸。
[0014] 该适配体分子可以与SEQIDN0:3具有至少85%，至少90%，至少95 %或100% 的同一"性。
[0015] 该适配体分子可以包含SEQIDN0S:58-111中任一个所列出的核酸序列。
[0016] 该分子的一个或多个核苷酸碱基可以已经被修饰。
[0017] 该适配体分子能够被内化到表达⑶7的细胞中。
[0018] 该适配体分子可被用于向具有CD7受体的细胞递送治疗或诊断分子。
[0019] 根据本发明的第二种实施方式，提供了包含如上文所述的连接至治疗或诊断分子 的适配体分子的缀合物。
[0020] 根据本发明的第三种实施方式，提供了包含如上文所述的适配体分子或缀合物和 可药用载体的药物组合物。
[0021] 根据本发明的第四种实施方式，提供了用于向具有CD7受体的分子递送治疗或诊 断分子的方法，该方法包括使该细胞与如上文所述的适配体或缀合物接触。
[0022] 根据本发明的第五种实施方式，提供了用于检测表达CD7的细胞的方法，该方法 包括使细胞与如上文所述的适配体或缀合物接触，并且当该适配体或缀合物结合至或被细 胞内化时进行检测。
【附图说明】
[0023]图1:为诜择内化话配体的全细朐SELEX实验方案。利用全细朐来诜择内化话配 体。从将dsDNA文库转录为f氟化嘧啶RNA文库开始，利用CD7-HeLa细胞进行正向选择。 在37°C下将RNA与⑶7-HeLa细胞一起孵育，之后弃上清，并将结合的RNA从细胞清洗掉。 通过裂解细胞回收内化的RNA，并将回收的RNA逆转录为cDNA，并通过PCR进行扩增，之后 转录为RNA以用于下一轮选择。在HeLa细胞中的负向选择用于除去任何非特异性内化的 RNA。对于此，在将细胞与RNA的富集池一起进行孵育之后，弃细胞并保留上清以产生更多 的模板。继续进行该选择直至从每一轮的回收到达平台期。
[0024] 图2:PilotPCR用于最优化SELEXDNA扩增的循环次数。针对循环次数最优化毎 一轮选择的DNA的PCR扩增。在24次循环之后观察到模板的过度扩增，而在16次循环之 前没有产生产物。在20次扩增时，能够看到作为与75个核苷酸对齐的较下方条带的引物 二聚体扩增。在100个核苷酸处的感兴趣条带从16次循环得到证实。最佳循环次数产生 感兴趣的条带，而没有异常条带。
[0025] 图3 :从内化（体内）全细朐SELEX回收。在CD7_HeLa细胞中的5轮正向选择和 在未转染的HeLa细胞中的一轮负向选择之后选择CD7特异性内化适配体。在未转染的HeLa 细胞中重复每一轮的回收以确认富含CD7特异性适配体。从未转染的HeLa细胞的回收保 持恒定，而在⑶7-HeLa细胞中则显示出在每一轮中的富集。
[0026] 图4:在最后一轮诜择之后的CD7特异件话配体的富集池的PCR扩增。通讨低镁 浓度PCR来扩增⑶7特异性适配体的富集池。该PCR得到根据分子量标志物具有正确尺寸 的单条条带。一旦确认了正确尺寸和质量，就将DNA连接到pGEM-TEasy?^^本中。
[0027] 图5:利用M13引物讲行载体插入筛诜。利用M13特异性引物扩增96个克隆，以 确定插入阳性克隆。通过指示箭头处的条带来证实该阳性插入。在感兴趣条带下方可见过 量的载体DNA的条带，其表征PCR中过量载入的模板。
[0028] 图6 :话配体序列的最大可能件讲化树。来自全细胞SELEX的适配体序列被排列 于邻接树并在邻接树上作图，以确定该序列中的相似性。适配体序列仅与三个入池超过一 次的适配体（CSIR3. 3、CSIR3. 23和CSIR3. 53)有区别。
[0029] 图7 :通讨PCR和体外转录产牛CD7话配体。A.在转录为活性RNA之前通过PCR 扩增适配体。能够看到适配体（尺寸为90bp)对齐于100个核苷酸处的分子标记物。B.将 通过PCR扩增的适配体转录为其活性RNA。在8M变性聚丙烯酰胺凝胶上分离DNAse之前 (BD)和DNAse(AD)之后的馏分。BD中的多个条带指示DNA和RNA分子。
[0030] 图8记的适配体RNA的分光光度计定量分析。利用分光光度法对用劳光团标 记的RNA进行定量分析。标记示出RNA和标记物的光谱，并计算标记的RNA的量。
[0031] 图9 :通讨流式细朐术在HeLah鉴别的特异于⑶7-HeLa细朐的话配体。话配体 CSIR3. 3、CSIR3. 23和CSIR3. 53结合于CD7-HeLa细胞和未转染的HeLa细胞。结合不 同细胞类型的适配体的覆盖直方图。仅细胞对照为灰色阴影，而结合CD7_HeLa细胞和未转 染的HeLa细胞的适配体则分别为红色和绿色的线。B.结合归一化为仅细胞对照的适配体 设为 1(η= 4)。
[0032] 图10 :话配体CSIR3. 23结合特异件。格CD7_HeLa细胞和未转染的HeLa细胞与 20nMFAM标记的适配体CSIR3. 23-起孵育。CellMask全细胞染色用于使细胞可视化并 定位适配体染色。产生细胞和适配体染色的复合照片。
[0033] 图11 :话配体CSIR3. 3结合特异件。格CD7_HeLa细胞和未转染的HeLa细胞与 20nMFAM标记的适配体CSIR3. 3-起孵育。CellMask全细胞染色用于使细胞可视乎并定 位适配体染色。产生细胞和适配体染色的复合照片。
[0034] 图12 :话配体CSIR3. 53结合特异件。格CD7_HeLa细胞和未转染的HeLa细胞与 20nMFAM标记的适配体CSIR3. 53-起孵育。CellMask全细胞染色用于使细胞可视乎并 定位适配体染色。产生细胞和适配体染色的复合照片。
[0035] 图13 :在存在和不存在抗-CD7单克降抗体竞争的条件下，CD7话配体结合对比。
[0036] 图14 :在⑶7-HeLa细朐h结合于⑶7夸体的话配体CSIR3. 42的显微镜分析。第 一泳道为亮视野像，第二条带为适配体染色（归为伪彩色，红色）以及最后条带为最初两幅 图像的复合。A.在4°C下与CSIR3. 42-起孵育的⑶7-HeLa细胞。能够观察到适配体染 色，其定位于细胞周围（白色箭头）。B.用抗-CD7抗体阻断CD7-HeLa细胞，之后在4°C下 与CSIR3. 42 -起孵育。能够观察到适配体染色，其定位于细胞周围（白色箭头）。
[0037] 图15 :话配体CSIR3. 42夸体介导的向CD7_HeLa细朐中内化作用的显微镜分析。 适配体结合于表达⑶7受体的表面并加温至37°C。第一泳道为亮视野像，第二泳道为适配 体染色（归为伪彩色，红色）；第三泳道为核染色（归为伪彩色，蓝色）以及最后泳道为适 配体染色和核染色图像的复合。A.在4°C下将⑶7-HeLa细胞与CSIR3. 42 -起孵育20分 钟，用无血清培养基洗涤并升温至37°C。能够观察到适配体染色定位至细胞内部，细胞核周 围（白色箭头）。B.用抗-⑶7抗体阻断⑶7-HeLa细胞，之后在4°C下与CSIR3. 42 -起孵 育20分钟，用无血清培养基洗涤并升温至37°C。未出现适配体染色。
[0038] 图16 :话配体与在Turkat细朐h内源件表汰的CD7夸体的关联度。
[0039] 每一适配体的关联度单独归一化为其各自转染对照（设置为100% )。学生氏t检 验用于确定仅有适配体和其转染对照之间的显著性（η= 2)。除CSIR3. 14和CSIR3. 42 之外的所有的适配体都显著不同于其转染对照。
[0040] 图17 :话配体CSIR3. 14的时稈关联度。Pi· 400nM的终浓度将适配体CSIR3. 14 与Jurkat细胞一起孵育不同的时间（1小时、3小时、6小时、12小时和24小时）。A:在不 同孵育期过后适配体结合的覆盖频率分布图。适配体结合随孵育期的增加而增加。B:随时 间的适配体结合的非线性回归拟合（特异性关联度=体X丨()〇 )。
[0041] 图18 :话配体CSIR3. 37的时稈关联度。Pi· 400nM的终浓度将适配体CSIR3. 37 与Jurkat细胞一起孵育不同的时间（1小时、3小时、6小时、12小时和24小时）。A:在不 同孵育期过后适配体结合的覆盖频率分布图。适配体结合随孵育期的增加而增加。B:随时 间的适配体结合的非线性回归拟合（特异性关联度=X!()〇)"
[0042] 图19 :话配体CSIR3. 42时稈关联度。Pi· 400nM的终浓度将适配体CSIR3. 42与 Jurkat细胞一起孵育不同的时间（1小时、3小时、6小时、12小时和24小时）。A:在不同 孵育期过后适配体结合的覆盖频率分布图。适配体结合随孵育期的增加而增加。B:随时间 的适配体结合的非线性回归拟合（特异性关联度=比xHK)
[0043] 图20 :适配体CSIR3. 14的结合动力学分析。以不同浓度（11ηΜ、22ηΜ、44ηΜ、87ηΜ、 175ηΜ、350ηΜ和700ηΜ)将适配体CSIR3. 14与Jurkat细胞一起孵育12小时。Α.在不同 浓度时适配体结合的覆盖频率分布图。B.在不同浓度时配体与Jurkat细胞的特异性关联 度（特异性关联度=?本.X】00).. '又 C5i.s 3.31^^^·lib
[0044] 图21:适配体CSIR3· 37的结合动力学分析。以不同浓度（11ηΜ、22ηΜ、44ηΜ、87ηΜ、 175ηΜ、350ηΜ和700ηΜ)将适配体CSIR3. 37与Jurkat细胞一起孵育12小时。Α.在不同 浓度时适配体结合的覆盖频率分布图。B.在不同浓度时配体与Jurkat细胞的特异性关联 J i- a-Δ. ? 遠配体it夥IT-分比，、 度=--χ100),.
[0045] 图22:适配体CSIR3. 14全长突变体和CSIR3. 14DNA与Jurkat细胞的关联度。将 适配体CSIR3. 14RNA、突变体和DNA以400nM的终浓度与Jurkat细胞一起孵育过夜。A.通 过实体框（solidbox)来表示适配体二级结构的计算机预测、CSIR3. 14RNA的建议结合 区。B.不同浓度时的适配体结合的覆盖频率分布图（灰色阴影中仅细胞对照）。C.适配体 剛中型与Jurkat细胞的特异性关联度（特异性关联度=χ削)。
[0046] 图23 :通讨共聚隹显微镜的Z切片通讨图像截而。A:X、Y和Z屏幕视角的图形表 示。Β:每Ιμπι切开的可视平面的图形表示以产生Ζ堆叠。
[0047] 图24:以1μm间隔沿着Ζ轴从细胞下方至细胞上方仅沿着Ζ轴通过仅单个细胞 的图像切片用于定位适配体CSIR3. 14图像切片。在Ο.Ομπι处的第一图像位于细胞下方， 而在23. 0μπι处的最终图像位于细胞上方。9. 0μπι和15. 0μπι之间的图像来自细胞内部。
[0048] 图25:话配体CSIR3. 14内化作用的时稈。在加入话配体之后长汰45分钟的适 配体CSIR3. 14内化作用的图像。以15分钟的间隔在六小时内获取图像。
[0049] 图26:感兴趣冈域内的内化作用的动力学（全视野场）。
[0050] 选择包括全部可是平面的感兴趣区域以用于计算内化作用动力学。A.弥补R0I 1 的面积。B.用非线性回归线拟合的随时间变化的荧光强度。由虚线来表示该线的95%置 信区间。C.非线性回归线的计算参数。
[0051] 图27:感兴趣的两个（单个细朐）冈域的内化作用的动力学。诜择含有单个细朐 的两个感兴趣区域以用于计算内化作用动力学。A.表示全部可见平面环境下单个细胞的 弥补R0I2的区域。B.用非线性回归线拟合的随时间的荧光强度。由虚线来表示该线的 95%置信区间。C.非线性回归线的计算参数。
[0052] 图28 :三种CD7话配体-siRNA嵌合体的设计。
[0053] 图29 :用话配体-siRNA嵌合体和对照转染的CEM细朐并通讨aRT-PCR对CCR5抑 制讲行测试。
[0054] 图30:在CEM细胞中CD73. 37R5-siRNA的细胞内化作用。siRNA为用Cy3荧光团 标记的3'-端。向CEM细胞施用800nM的适配体-嵌合体并通过荧光显微镜可视观察。用 DAPI对细胞核进行反染色。数据表示适配体-嵌合体至CEM细胞的具体定位。
【具体实施方式】
[0055] 本发明提供了特异性结合于表达CD7细胞表面受体的细胞或组织的核酸适配体。 该适配体包含与核酸序列5' -GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC-3'（ SEQ IDN0:3)具有至少80%同一性的核酸序列的分子，其中^为!^，其中每个η代表任意 核苷酸且X为29至55的整数。
[0056] 除非另外定义，否则本文中使用的所有的技术和科学术语具有与本发明领域的普 通技术人员通常理解相同的含义。通常，本文中使用的专用术语和试验方法是本领域公知 的并且是本领域中常用的。
[0057] 如在本文中使用的，术语"核酸适配体"是指能够以高亲和性特异性识别其靶标的 小的单链寡核苷酸。
[0058] 如在本文中使用的，短语"与…具有至少80% /85% /90% /95 %同一性的核酸序 列"是指相对于参比序列包含一个至若干个核苷酸添加、缺失或置换的核酸序列。
[0059]申请人已经示出了 具有核酸序列 5' -GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCU CACAACAGGC-3'（SEQIDN0:3)或其修饰的适配体能够结合于表达⑶7受体的细胞和/或被 内化到表达⑶7受体的细胞中。该具有SEQIDN0S:58至111的分子是这样的适配体的具 体实例。
[0060] 适配体能够具有与提供的SEQIDN0:3具有至少85% ,90%或95%同一性的序 列，然而，该适配体能够结合于表达CD7受体的细胞或组织或被内化到表达CD7受体的细胞 或组织中。该适配体能够与SEQIDN0:3完全相同。引起与SEQIDN0:3具有至少80%、 85 %、90 %或95 %同一性的修饰通常为位于侧接于&的核苷酸上的修饰，其可