)、2UT7RNA聚合酶（NewEnglandBiolabs⑩Inc.，MA,USA)。转录反应在 37°C 下孵育过夜。通过加入IX反应缓冲液中的1URNAse无DNAseI(Fermentas,Thermo FisherScientificInc.，MA，USA)并在37°C下孵育25分钟来停止反应。利用如之前所述 的NucAway?SpinColumns(Ambion,NY,USA)将RNA适配体从低分子量污染物纯化。在室 温下利用 650μ1 1XHMCKN缓冲液（10mMΗ印espH7.4、lmMMgCl2、lmMCaCl2、2.7mMKC1 和150mMNaCl)将柱水合五分钟。将柱置于收集管中并使其以750Xg旋转两分钟以除去过 量的细胞间液。弃流通量并将RNA回收物直接加入到凝胶床的中心。将柱置于干净的收集 管中并以750Xg旋转两分钟。含有流通量的干净RNA备用，并丢弃旋转柱。利用NanoDrop 1000 分光光度计（ThermoFisherScientificInc.，ΜΑ,USA)在A260 处对RNA进行定量 分析。利用260:280的比率作为DNA纯度的指标，其中对于纯RNA的期望比率为2. 0。在 在200V将来自每一步骤的RNA流分溶解于1XTBE电泳缓冲液中的12%聚丙烯酰胺8M 尿素凝胶上，以证实RNA产生质量。通过与1XRNA负载染料（Fermentas,ThermoFisher ScientificInc.，USA) -起孵育并加热至95°C持续三分钟通过来制备RNA以用于。在UV 光下通过MolecularImagerChemidocXRS+ImagingSystem(BIORAD，CA,USA)染色通过溴 化乙锭来实现可视化。为了正确的折叠，在使用前使适配体在95°C变性三分钟并且在存在 IXHMCKN缓冲液的条件下再折叠并在室温下孵育10分钟。
[0083] 抗-⑶7适配体的荧光标记
[0084] 用6-羧基-荧光素（FAM，激发494nm和发射518nm)标记适配体，以使得其能 够利用显微镜和流式细胞术对于内化作用和结合进行示踪。根据制造商的试验方案使用 Silencer?siRNA标记试剂盒（Ambion,NY,USA)。该标记反应用5μg单链RNA、1X标记缓 冲液和15%FAM标记试剂来制备并且在37°C恒温下在暗处孵育一小时。然后乙醇沉淀该标 记的RNA以除去过量的标记试剂，因为其会导致转染的细胞的短期毒性。为了使RNA沉淀， 向末端标记反应中加入0. 1体积的5MNaCl和2. 5体积的100%乙醇，并且在混合孔之后， 将反应在-20°C下孵育一小时。通过在80000Xg离心15分钟使RNA沉淀，之后弃上清，并 通过该阶段可见RNA为绿色沉淀。RNA沉淀在70%乙醇中洗涤，之后在室温下在暗处风干。 然后将该沉淀重悬于1XHMCKN缓冲液中并利用微阵列测定进行定量分析从而在NanoDrop 1000 分光光度计（ThermoFisherScientificInc.，ΜΑ,USA)上检测焚光浓度。
[0085] 抗-⑶7适配体的细胞表面结合的流式细胞术分析
[0086] 利用流式细胞术来评估适配体与细胞表面表达的⑶7受体的结合。以1X105 细胞/ml的浓度将⑶7-HeLa和未转染的HeLa细胞悬浮于无血清培养基中。在4°C将 CD7-HeLa细胞的部分与 0· 5μg抗-CD7 单克隆抗体（CD7 (H-7) :sc-28332;SantaCruz Biotechnology,Inc.，CA，USA)抗体一起孵育20分钟，之后将所有的细胞与400nMFAM标 记的适配体一起孵育20分钟。然后，在4°C将细胞在细胞在500μ1PBS中洗涤三次，之 后在4°C重悬于100μ1无血清培养基以用于利用GuavaEasyCyte流式细胞仪（Guava TechnologiesInc.，CA,USA)通过流式细胞术进行分析。利用Flowjo版本7.6.5(Tree Star,Inc. ,OR,USA)来分析和处理结果。对于每次运行，对10 000个事件进行计数并根据 正面和侧面散射剖面设门（gate)。将适配体结合的细胞与单纯的细胞进行比较，并确定染 色细胞的百分比。将结合于CD7_HeLa细胞的适配体与未转染的HeLa细胞的结合以及与用 抗-⑶7单克隆抗体阻断的⑶7-HeLa细胞进行比较。
[0087] 抗-⑶7适配体内化作用的共聚焦显微镜分析
[0088] 通过在37°C将荧光标记的适配体与⑶7-HeLa细胞和未转染的HeLa细胞一起 孵育20分钟来进行适配体CSIR3. 3、CSIR3. 53和CSIR3. 23内化作用的初始筛选。以 2X105细胞/ml的密度将⑶7-HeLa细胞和未转染的HeLa细胞接种到14mm盖玻片上并在 37°C以5%COJ?育过夜。在孵育之后，以20nM的终浓度将适配体CSIR3. 3、CSIR3. 53 和CSIR3. 23加入到细胞中并在37°C孵育两小时。用预热的PBS(Gibco，BRL，UK)洗涤盖 玻片并在室温下利用4% (w/v)多聚甲醛固定30分钟。在室温下用PBS洗涤固定的细胞 萨尼，并在室温下利用HCSCellMask?蓝色全细胞染色染色30分钟，激发346nm和发射 442nm(Invitrogen，CA，USA)。用PBS(Gibco,BRL，UK)再洗涤三次之后进行染色，之后利用 PBS封固介质中的50%甘油封固盖玻片。利用具有Andorenccd16比特照相机（Andor Technologypic.，UK)的NikonT1eclipse(NikonCorporation,日本）对玻片成像。图 像的Z-STACK获自细胞内部，不包括细胞表面。这确保了仅仅细胞内部的适配体而不是附 着于细胞表面的适配体被成像。ImageJ1.45软件用于分析该图像并使堆叠图像变得平坦 成为针对"最大强度"选择的单幅图像。利用"平均强度"命令使细胞染色堆叠变得平坦。 通过扣除背景来处理这两幅图像并利用"增强对比度"以0. 01 %饱和像素来归一化，之后产 生一组叠化的图像。绿色伪彩色被归为适配体染色，而灰色比例尺则被用于细胞染色。
[0089] 与在T淋巴细胞上内源性表达的表面⑶7受体的抗-⑶7适配体关联度
[0090] 选择Jurkat细胞用作用于适配体关联度表征的T淋巴细胞。使Jurkat细胞在完 全培养基中生长至密度为4X106细胞/ml，并以2X105细胞/孔的密度将其接种至96孔板 中（Nunc?,ThermoFisherScientific,Inc.，MA,USA)。针对与JurkatT淋巴细胞的结合对 选自CD7-HeLa细胞的结合研究中的CD7特异性适配体（CSIR3. 14、CSIR3. 28、CSIR3. 31、 CSIR3. 35、CSIR3. 37、CSIR3. 39、CSIR3· 42 和CSIR3· 48)进行测试。在 37°C和 5%C02 下在完全培养基中以400nM的终浓度将Cy3标记的适配体与Jurkat细胞一起孵育过夜。作 为适配体内化作用的阳性对照，利用LipofectamineRNAiMAX试剂（Invitrogen,CA,USA) 将适配体转染到细胞中。在孵育之后，细胞沉淀出来并用PBS洗涤三次。在洗涤之后，将细 胞重悬浮于400μ1PBS中并利用CyAn流式细胞仪（BeckmanCoulterInc.，CA,USA)进行 分析；利用Flowjo版本7· 6· 5(TreeStar,Inc. ,OR,USA)分析结果。对于每一次运行，对 10 000个事件进行计数并根据正面和侧面散射剖面设门（gate)。将适配体结合的细胞与 单纯的细胞进行比较，并确定染色细胞的百分比。每个单纯适配体关联度被归一化为其转 染对照（设定为100% )。进行学生氏t检验以确定转染对照和单纯适配体之间的显著差 异。两次实验的平均值用于证实抗-CD7适配体的关联度。
[0091] 抗-⑶7适配体结合速率和结合特征
[0092] 进一步分析显示出结合Jurkat细胞的适配体CSIR3. 14和CSIR3. 37和 CSIR3. 42以确定其动力学速率常数。使Jurkat细胞在完全培养基中生长至密度为4X106 细胞/ml，并以2X105细胞/孔的密度将其接种至96孔板中（Nunc?,ThermoFisher Scientific,Inc. ,MA,USA)。在37°C和5%C02下在完全培养基中以400nM的终浓度将Cy3 标记的适配体与Jurkat细胞一起孵育不同的时间段（1小时、3小时、6小时、12小时和24小 时）。在孵育之后，细胞沉淀出来并用PBS洗涤三次。在洗涤之后，将细胞重悬浮于400μ1 PBS中并利用CyAn流式细胞仪（BeckmanCoulterInc.，CA,USA)进行分析。利用Flowjo 版本7. 6. 5(TreeStar,Inc. ,OR,USA)分析结果。对于每一次运行，对10 000个事件进行计 数并根据正面和侧面散射剖面设门（gate)。将适配体结合的细胞与单纯的细胞进行比较， 并确定染色细胞的百分比。针对单纯细胞以及那些用Cy3标记的适配体染色的细胞来计算 平均和中位荧光。两次实验的平均值用于证实抗-CD7适配体与表面表达的CD7受体的关 联度。分析跨越整个时间段的染色细胞的百分比，并拟合非线性回归线（GraphPadPrism SoftwareInc.，CA，USA)，以确定结合和解离速率常数。
[0093] 与Jurkat细胞关联的适配体关联度的检测限
[0094] 对适配体CSIR3.14和CSIR3. 37进行分析以确定适配体-细胞关联度的检测 限。使Jurkat细胞在完全培养基中生长至密度为4X106细胞/ml，并以2X10 5细胞/孔 的密度将其接种至 96 孔板中（Nunc?,ThermoFisherScientific，Inc.，MA，USA)。在 37°C 和5%C02下在完全培养基中以变化的终浓度（10. 9nM、21. 9nM、43. 8nM、87. 5nM、175nM、 350nM和700nM)将Cy3标记的适配体与Jurkat细胞一起孵育12小时。在孵育之后，细胞 沉淀出来并用PBS洗涤三次。洗涤之后，将细胞重悬浮于400μ1PBS中并利用CyAn流式 细胞仪（BeckmanCoulterInc.，CA,USA)对焚光进行分析。利用Flowjo版本 7. 6. 5(Tree Star,Inc. ,OR,USA)分析结果。对于每一次运行，对10 000个事件进行计数并根据正面和 侧面散射剖面设门。将适配体结合的细胞与单纯的细胞进行比较，并确定染色细胞的百分 比。两次实验的平均值用于证实抗-CD7适配体的浓度梯度关联度。适配体结合被归一化 为在12小时结合的阴性对照适配体CSIR3. 31。
[0095] 适配体CSIR3. 14结合位点突变特性
[0096] 适配体CSIR3. 14二级结构预测突出显示保守的区域，这可归因于⑶7结合。这种 预测通过除去结合区域和评估与Jurkat细胞的关联度的十个核苷酸部分来进行测试。还 针对Jurkat细胞关联度对适配体CSIR3. 14的DNA进行了评估。使Jurkat细胞在完全培 养基中生长至4X106细胞/ml的密度并以2X105细胞/孔接种到96孔板中（Nunc?，Thermo FisherScientific，Inc.，MA，USA)。在 37°C和 5%C02下在完全培养基中以 400nM的终 浓度将FAM标记的适配体（根据第3. 2. 2章产生）与Jurkat细胞一起孵育过夜。作为 适配体关联度的阳性对照，包括全长适配体CSIR3. 14。在孵育之后，细胞沉淀出来并用 PBS洗涤三次。在洗涤之后，将细胞重悬浮于400μ1PBS中并利用GuavaEasyCyte流式 细胞仪（GuavaTechnologiesInc.，CA,USA)进行分析，并利用Flowjo版本 7· 6· 5(Tree Star,Inc.，OR,USA)分析结果。对于每一次运行，对10 000个事件进行计数并根据正面和 侧面散射剖面设门。对绿色荧光设门以除去细胞的红色自动-荧光。每一适配体突变和 DNA被归一化为全长CSIR3. 14的关联度（设定为100 % )。进行学生氏t检验以确定转染 对照和单纯适配体之间的显著差异。两次单独试验用于计算每一适配体的关联度。进行适 配体CSIR3. 14突变体和DNA的计算机分析以预测二级结构。
[0097] 抗-⑶7适配体内化作用表征和定位
[0098] 选择适配体CSIR3. 14用于进一步表征在JurkatT淋巴细胞中的内化作用。 用多聚-L-赖氨酸的0. 1 %水溶液（w/v) (Sigma-Aldrich，M0，USA)涂覆玻璃底细胞室 (Mateck，MA，USA)，以使得悬浮细胞能够附着于细胞室表面。在37°C和5%C02下将Jurkat 细胞（2X105细胞）加入到盘中心并使得其能够定殖并附着20分钟。将活细胞置于连接于 ZeissLSM510共聚焦显微镜（CarlZeissAG，0berkochen，德国）的孵育室中，利用40Χ 物镜用于活细胞成像。以Ιμπι截面实施通过细胞截面的图像的。利用ZeissLSMImage Browser版3. 5(CarlZeissAG，0berkochen,德国）分析这些图像以产生该堆叠的三维投影 (补充数据）。这些工具用于将适配体荧光定位至细胞内部。
[0099] 抗-⑶7适配体内化作用的动力学
[0100] 通过共聚焦显微镜选择适配体CSIR3. 14以用于进一步表征共聚焦显微镜的动 力学内化作用。用多聚-L-赖氨酸的0· 1%水溶液（w/v) (Sigma-Aldrich，MO，USA)涂覆玻 璃底细胞室（Mateck，MA，USA)，以使得悬浮细胞能够附着于细胞室表面。在37°C和5%C02 下将Jurkat细胞（2X105细胞）加入到盘中心并使得其能够定殖并附着20分钟。将活细 胞置于连接于ZeissLSM510共聚焦显微镜（CarlZeissAG，Oberkochen,德国）的孵育 室中，其设置用于检测激发为550nm且发射为570nm的Cy3荧光。在六小时期间进行时程 成像，利用40X物镜以15分钟间隔捕获图像。ZeissLSMImageBrowser版本3. 5(Carl ZeissAG，Oberkochen,德国）用于分析图像。选择分别包括全视野场和单个细胞的两个感 兴趣的区域（R〇I1和R0I2)。针对荧光信号随时间的累积来分析这些区域。利用raphPad Prism版本5(GraphPadPrism软件Inc. ,CA,USA)来分析该数据，并拟合非线性回归线以确 定结合和解离速率常数。以下示出了用于定义用以拟合线和速率常数的结合的动力学的等 式：
[0101]Y=YmaxX(l-ekob'x)
[0102] kob=观测速率常数（min-1)
[0103]Y_=最大Y值（特异性结合）
[0104]X=时间（分）
[0105] 哺乳动物细胞培养
[0106] 将HeLa哺乳动物细胞保持5X105细胞/ml的密度。在37°C下在具有5% 0)2的 增湿的培养器中将细胞保持在其中补充有10%FBS(Gibco，BRL，UK)的具有L-谷氨酰胺 (Gibco，BRL，UK)的达尔伯克改良的伊格尔氏培养基（DMEM)中。在每一次运行之后，在光 学显微镜下通过台盼蓝拒染确定细胞活力。将CD7-HeLa哺乳动物细胞保持5X105细胞 /ml的密度。在37°C下在具有5% 0)2的增湿的培养器中将细胞保持在具有L-谷氨酰胺 (Gibco，BRL，UK)并且补充有10%FBS(Gibco，BRL，UK)和50yg/ml新霉素的达尔伯克改 良的伊格尔氏培养基（DMEM)中。在每一次运行之后，在光学显微镜下通过台盼蓝拒染确 定细胞活力。Jurkat细胞为来源于患有急性淋巴细胞白血病（ATCC#TIB-152)的14岁男 孩的外周血白膜的T淋巴母细胞。将JurkatT淋巴细胞保持5X105细胞/ml的密度。将 ⑶7-HeLa哺乳动物细胞保持5X105细胞/ml的密度。在37°C下在具有5%C02的增湿的培养 器中将细胞保持在具有2禮1^-谷氨酰胺（6让〇〇,81^，1]1()、11111丙酮酸钠（6让(3 〇,81^，1]1()、 4500mg/ml葡萄糖（Gibco,BRL,UK)、1500mg/ml碳酸氢钠（Gibco,BRL,UK)并且补充有 10% FBS(Gibco，BRL，UK)的RPMI中。在每一次运行之后，在光学显微镜下通过台盼蓝拒染确定 细胞活力。
[0107] 适配体缀合于siRNA
[0108] 设计三个适配体-siRNA嵌合体。使siRNA被靶向以抑制CCR5受体（R5-siRNA)和 不相关乱序的对照siRNA(scr-siRNA)。两个单独的⑶7适配体被用于形成嵌合体：⑶73. 14 和CD73. 37 (图28)。利用非特异性树枝状大分子G5李艾转染对照siRNA。在转染后48小 时收集RNA，并且所提取的RNA被用于测量CCR5表达。
[0109] 结果
[0110] 通过全细胞SELEX内化抗-⑶7适配体的选择
[0111] 全细胞（体内）SELEX用于产生能够利用人表面⑶7受体内化细胞的RNA适配体。 所产生稳定转染的CD7_HeLa细胞系用于内化适配体的正向选择。未转染的HeLa细胞（证 实无CD7受体表达）用于负向选择以除去非特异性内化RNA物质。在每一轮选择时，针对 循环数最优化PCR(图2)。选择最大PCR循环数一使得PCR片段能够被过度扩增（在24次 循环后的较高条带，图2)。在循环数目较高时，引物二聚体启动扩增并且能够被视为在大约 75个核苷酸的条带（图2)。感兴趣的条带能够被视为与分子量标志物的100个核苷酸条 带一致（图2)。选择产生单个条带的循环数作为最优循环数以用于针对选择的轮数的DNA 的PCR扩增。
[0112] 在CD7_HeLa细胞中的三轮正向选择之后是一轮针对未转染的HeLa细胞的负向选 择。负向选择之后是又两轮在⑶7-HeLa细胞中的正向选择。在未转染的HeLa细胞中重复 在CD7_HeLa细胞中的每一轮选择，并比较来自每一细胞类型的回收物（图）。来自未转染 的HeLa细胞的回收物保持恒定，而在CD7_HeLa细胞中的回收物则在每一轮中显示出富集， 这表明对于表达的CD7受体具有特异性。在六轮选择之后，通过PCR扩增适配体的富集池 (图4)，并将其连接于pGEM-TEasy?载体（promega，WI，USA)以用于克隆到化学感受态One ShotT0P10 大肠杆菌中（Novagen,Merck,Darmstadt,德国）。
[0113] 取得并分析九十六个克隆以用于阳性插入。为了检测阳性插入，利用M13特异性 引物通过PCR来扩增每一克隆以扩增该载体（图5)。对于插入而言五十九个克隆是阳性的 并且被送至InqabaBiotech(南非）进行测序。
[0114] 抗-⑶7适配体克隆测序和分析
[0115] 对五十九个适配体克隆进行测序（表2-1)并且利用BioEditV7. 1.3.0软件 (Hall，1999)中的CLUSTALW多重比对应用针对保守基序和序列类似性对其序列进行分 析。基于其测序的顺序命名适配体并且因此不反映其属性。收集59个适配体克隆中的三 个（适配体CSIR3. 3、CSIR3. 23和CSIR3. 53) -次以上。剩余的适配体序列具有高度离 散（divergent)。产生了适配体克隆的最大可能进化树并且指示该克隆的最大多样性（图 6) 〇