专利名称：裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的裂解酶的制备方法，具体是一种能够裂解多种血清型猪 链球菌的裂解酶的制备方法。
背景技术：
猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎 、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，对相关从业人员的生 命安全构成严重威胁。裂解酶是由噬菌体基因组编码，能够水解细菌细胞壁的酶。噬菌体裂 解酶像噬菌体一样仅攻击细菌，而不影响动物细胞，并具有较高的特异性，因此该酶不影响 无害或有益的动物寄生菌。 一般认为，裂解酶作用于细菌的速度极快，以致于细菌不会对该 酶产生抗性。噬菌体的裂解酶有比噬菌体更为广泛的抗菌谱。所以，裂解酶作为新型抗菌药 物具有一定的优势。
经对现有技术的文献检索发现，王丽平、陆承平、唐家琪在《微生物学报》2004年第 44巻第6期第794 799页发表了 "32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性"， 文中提及，从猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株 以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类 、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制 或抗菌药物显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的 制备方法。本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体(SMP)的裂解基因，获得纯化的有活 性的裂解酶，它可在体外对多种猪链球菌有裂解作用；本发明的方法制得的裂解酶能裂解多 种血清型猪链球菌。
本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤
步骤一，纯化猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA;
步骤二，以步骤一所得DNA为模板，PC財广增裂解酶基因；
步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；
步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到裂解酶。步骤三中，所述原核表达采用的质粒是pET-28a ( + )。
步骤四中，所述裂解酶的使用条件具体为在裂解酶的反应体系中加入e-巯基乙醇， 使得e -巯基乙醇的最终的体积分数为o. 8%。
步骤四中，所述裂解酶的使用条件具体为在裂解酶的反应体系中加入半胱氨酸，使得 半胱氨酸的最终浓度为10mM。
步骤四中，所述裂解酶使用的缓冲液为PH为5. 2醋酸钠缓冲液。 步骤四中，所述裂解酶的作用温度为37'C。
本发明利用PC財广增猪链球菌烈性噬菌体(SMP)的裂解基因，获得目的片断，再将目的 片断与pET-28a ( + )载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌进行表达，获得一个分子 量为55kDa的融合蛋白，经过Ni柱纯化和加入还原剂复性，得到有活性的裂解酶，获得的裂 解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌 体(SMP)的裂解基因，获得纯化的有活性的裂解酶，它可在体外对多种猪链球菌有裂解作 用；比较噬菌体与裂解酶的裂解谱发现，猪链球菌烈性噬菌体(SMP)仅能裂解2株猪链球菌 2型，但裂解酶可裂解17株猪链球菌2型中的15株，此外，还能裂解猪链球菌7型SH040805、 9型SH040817，马兽疫链球菌亚种ATCC35246以及金黄色葡萄球菌ATCC25923等。
本发明中所涉及的菌株大肠杆菌已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌 holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008,48(7) :963 969》 文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公 司地址上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，下列事实例中未注明具体条件的实验方法、工作原理，通常按照 常规条件进行，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
一、噬菌体的提纯、DNA的制备和裂解酶的表达
步骤一，取平板上长成密集相连噬斑的噬菌体SMP (基因组序列已提交GenBank，登录号 EF116926)，每板加入5mL SM液(噬菌体稀释液，每升稀释液的组分为5. 8g NaCl， 2g MgS04 . 7H20， 50mL 1M Tris-Cl， 5mL 2%明胶，余量为水；pH 7.5) ， 4"C摇床晃动3小时， 收集SM液放无菌离心管4000g离心10分钟去除细胞碎片。上清液加入胰DNaseI和RNaseI至终浓度为lyg/mL， 37。C温育30分钟。加入NaCl至终浓度lmol/L，冰浴1小时后，4。C 11000g离 心10分钟，收集上清。上清液加入PEG 8000至终浓度10%室温搅拌溶解后冰浴1小时，使噬菌 体颗粒发生沉淀。4°C 12000g离心10分钟，弃上清，沉淀的噬菌体颗粒用SM液过夜重悬。
步骤二，在重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50y g/mL， 37。C温育30分钟，再加 10。/。SDS至终浓度为0. 5%，混匀后将消化混合物于56。C温育1小时，冷却至室温。用等体积酚 /氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中。在回收的亲水 相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0. 3mol/L，混匀后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g 离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀。用适当体积的TE(核酸溶解缓冲液)溶解噬菌体DNA。
步骤三，裂解基因的原核表达
(1) 猪链球菌烈性噬菌体SMP裂解基因的克隆 根据猪链球菌烈性噬菌体SMP的基因序列设计引物进行PC財广增。连接到pMD-18 T载体(
Takara公司)上测序。所设计的引物上游包含EcoR I限制性酶切位点，下游包含Xho I限制 性酶切位点。
(2) 表达载体的构建
EcoR I和Xho I分别酶切PCR产物和pET-28a ( + ) ， T4 DNA连接酶(Takara公司)10 16。C过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5a中，37。C过夜培养，提取质粒。用EcoR I和Xho I酶切鉴定。鉴定的阳性重组质粒测序。
(3) 融合蛋白的表达
筛选阳性克隆提取质粒，转入大肠杆菌BL21中。挑取l个菌落接种2ml卡那霉素LB培养 基过夜培养。取5mL过夜培养菌液接种lL卡那霉素LB培养基，37°C 200转/分摇菌培养5h，至 OD6oo为0.4 1。加IPTG (异丙基硫代-e-D-半乳糖苷)至终浓度为lmM， 27。C摇菌培养4h后 ，收取菌液。
(4) SDS-PAGE电泳
配制12%的分离胶和5%的浓縮胶，样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓縮胶电压80V，分离 胶电压136V，电泳4 5h，考马斯亮兰染色2h。脱色观察，在55kDa处有明显的条带出现。 二、融合蛋白的纯化
IPTG诱导的细菌lL溶于25mL预冷的裂解缓冲液(含50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)，超声 破碎。8000g离心取上清。以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni柱，将样品上至柱内，再用预冷的 裂解缓冲液洗柱，直至0028()<0. 1。用预冷的清洗缓冲液A(裂解缓冲液加5mM咪唑)洗柱，直 至0028()<0. 1。用预冷的清洗缓冲液B(裂解缓冲液加20mM咪唑)洗柱，直至0028()<0. 1 。最后用溶出液(裂解缓冲液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脱液，即为纯化的裂解酶。
三、 裂解酶最佳裂解条件的确定
将猪链球菌SS-4 (临床分离株)离心，重悬于pH5.2的醋酸钠缓冲液，配成0D630为0.7 1.5的细菌悬液，加入96孔板中，每孔100yl。 20yg/ml纯化的裂解酶中，分别加入O. 5% 、0.8%、 1.0%、 3. 0%和5. 0% (V/V) 6-巯基乙醇，各取100y l加入细菌混悬液中。每个浓 度各做3个重复，裂解缓冲液作为空白对照。室温下反应30min后，在600nm处读取吸光度。
取吸光度减少最大的浓度作为e -巯基乙醇加入的最佳浓度。测定的最佳浓度为O. 8%。
将猪链球菌SS-4 (临床分离株)离心，重悬于pH5.2的醋酸钠缓冲液，配成0D6加为0. 7 1.5的细菌悬液，加入96孔板中，每孔100yl。 20yg/ml纯化的裂解酶中，分别加入lmM、 2mM、 4mM、 5mM、 8mM、 10mM、 15mM半胱氨酸，各取IOO y l加入细菌混悬液中。每个浓度各做 3个重复，裂解缓冲液作为空白对照。25。C下反应30min后，在600nm处读取吸光度。取吸光 度减少最大的浓度作为半胱氨酸加入的最佳浓度，测定的最佳浓度为10mM。
分别用20mM pH5. 2醋酸钠缓冲液、10mM p朋.8磷酸盐缓冲液、10mM pH7. 2磷酸盐缓冲液 、20mM pH8. 5 Tris-Cl缓冲液重悬链球菌，其余步骤与上面同，测定最佳反应缓冲液为20mM pH5.2醋酸钠缓冲液。分别在4。C、 18°C、 25°C、 37。C和42。C作用30min，其余步骤与上面同 ，测定裂解酶最佳反应温度为37'C。
四、 裂解酶对细菌的裂解作用测定
取猪链球菌制成OD6oo为1.0的细菌悬液，与纯化的裂解酶混合，室温下反应30min，检测 OD60o，计算浊度递减的百分比。所测临床分离的猪链球菌菌株的浊度递减试验结果见附表l (表l中的菌株均可通过公开的市售渠道获得)。裂解酶可使猪链球菌、马兽疫链球菌亚种 、金黄色葡萄球菌的细菌浊度下降1.2 68%。表l裂解酶对各菌株的浊度递减实验结果
细菌种类菌株号血清型细菌浊度递减百分数(％)
猪链球菌SS2-3260. 9
ATCC43756252. 5
SS2-1240. 4
05-465237. 7
T15237. 1
19-2(A)235. 8
SS2-4235. 8
5-2229. 2
zy05719211. 3
,801225
HA9802222. 1
HA05729-1218. 4
29216. 8
SS2-H216. 2
ll-l215. 4
SH040805715. 3
SH040817968
马兽疫链球菌亚种ATCC352469. 5
金黄色葡萄球菌ATCC2592310. 7
沙门氏菌NATSEL01141. 1
大肠杆菌MC10612. 权利要求
1.一种裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，纯化猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；步骤二，以步骤一所得DNA为模板，PCR扩增裂解酶基因；步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到裂解酶。
2.根据权利要求l所述的裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方 法，其特征是，步骤三中，所述原核表达采用的质粒是pET-28a ( + )。
3.根据权利要求l所述的裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法，其特征是，步骤四中，所述裂解酶的使用条件具体为在裂解酶的反应体系中加入e-巯基乙醇，使得e -巯基乙醇的最终的体积分数为o. 8%。
4.根据权利要求l所述的裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方 法，其特征是，步骤四中，所述裂解酶的使用条件具体为在裂解酶的反应体系中加入半胱 氨酸，使得半胱氨酸的最终浓度为10mM。
5.根据权利要求l所述的裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方 法，其特征是，步骤四中，所述裂解酶使用的缓冲液为pH为5.2醋酸钠缓冲液。
6.根据权利要求l所述的裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方 法，其特征是，步骤四中，所述裂解酶的作用温度为37'C。
全文摘要
一种生物技术领域的能够裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法，包括如下步骤步骤一，纯化猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；步骤二，以步骤一所得DNA为模板，PCR扩增裂解酶基因；步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到裂解酶。本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得纯化的有活性的裂解酶，它可在体外对多种猪链球菌有裂解作用；本发明的方法制得的裂解酶能裂解多种血清型猪链球菌。
文档编号C12N9/88GK101671662SQ200910309089
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者孙建和, 琰 王, 陆承平 申请人:上海交通大学