专利名称：白血病融合基因的联合并行检测方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断检测技术领域，具体涉及多种白血病融合基因的液相芯片联 合并行检测方法及其诊断试剂盒。
背景技术：
白白血病是由于造血干细胞分化异常和恶性增生而引起的造血系统恶性肿瘤，是 我国最常见的恶性肿瘤之一。随着白血病研究的不断进展，发现许多白血病患者具有特异 性的染色体易位，导致新的融合基因产生，这些异常基因已成为不同类型白血病的分子生 物学特异性标志。2000年WHO关于白血病分型的标准中更是将一些常见异常基因归纳为白 血病基本诊断的标准。因此，在分子基因水平对白血病相关的融合基因进行检测，不仅可以 为白血病诊断、分型、临床治疗选择和预后判断提供重要依据，同时也为白血病微小残留病 变提供检测基础。白血病中常见的融合基因有慢性粒细胞白血病(CML)中的BCR-ABL (b2a2)、 BCR-ABL(b3a2)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)中的 BCR-ABL(ela2)、E2A-PBX1、TEL-AML1、 MLL-AF4(elO/e4)；急性粒细胞白血病(AML)中的 CBFB-MYH11 (A type)、AML1-ET0 ；急性早 幼粒细胞白血病(APL)中的 PML-RARA (L form)、PML-RARA (S form)。目前，白血病主要是依靠细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学等检测方 法来进行诊断和检测分型。细胞形态学受主观因素影响，临床诊断的一致率仅为70%左 右。核型分析和显带技术等细胞遗传学方法是在全基因组水平筛查染色体易位，容易漏检 许多染色体的微小异常。免疫学方法具有较高的假阳性率和假阴性率，并且无法做到早期 诊断。当前国内外广泛使用的分子生物学检测白血病融合基因的方法中，荧光原位杂交技 术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存在着检测通量的局限性，所以都还 不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性 差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法，能够迅速、 稳定、准确地对白血病的多种融合基因进行联合并行检测，液相芯片技术(xMAP)正是这样 一种新型检测技术。液相芯片能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、 灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造 过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为 100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分 子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交 反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可 以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列 快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红 色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧 光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特 定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽 等突出优点，对白血病的多种融合基因进行联合并行检测，能够在临床检测上得到更好的 应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种白血病融合基因的联合并行检测方法及诊断试剂盒。该方法及试剂盒包含对BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA(S form)，10种融合基因联合并行检测，可以对慢性粒细胞白血病(CML)、 急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)进 行临床分型，同时对患者进行疗效观察、预后及微小残留疾病进行动态监测。本检测方法及 诊断试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。为解决上述技术问题，本发明的白血病融合基因的联合并行检测方法，包括以下 步骤(1)包含10种不同荧光编码的羧基微球beads，编号分别为11、15、17、21、25、33、 37、45、50、56 ；每种微球上分别共价结合针对白血病中染色体易位形成的10种融合基因的 mRNA所设计的特异性核酸探针(DNA探针)；(2)针对不同白血病类型中染色体易位所形成的10种融合基因的mRNA，分别设计 上下游引物，对不同的融合基因mRNA，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；(3)含有特异性核酸探针的微球与融合基因mRNA的逆转录扩增产物杂交后，加入 链霉亲和素_藻红蛋白(Sti^ptavidin-PE)，通过液相芯片法xMAP检测荧光信号；(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中 是否含有白血病相关的融合基因，和/或样品中融合基因的表达状况。以上检测方法中所述的微球是平均直径为5. 6 μ m，结合了不同荧光染料的聚苯烯 微球，即色彩编码微球(color-coded beads)；白血病中染色体易位形成的融合基因是针 对以下10种可以自由组合的融合基因BCR-ABL(b2a2)、BCR-ABL(b3a2)、BCR-ABL(ela2)、 E2A-PBX1、TEL-AMLl、MLL-AF4 (el0/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form), PML-RARA(S form)。所述的共价结合于微球上的10条特异性核酸探针(DNA探针)，包括如下序列(其 中5’端含氨基修饰)BCR-ABL(b2a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQID NO. 1 所示；BCR-ABL(b3a2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQID N0. 2 所示；BCR-ABL(ela2) :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQID N0. 3 所示；E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG_3，，如 SEQ ID N0. 4 所示；
TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘,如 SEQ ID NO. 5 所示；MLL-AF4(elO/e4) :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如SEQID NO. 6 所示；CBFB-MYH11(A type) :5， -AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID NO. 7所示；AMLl-ETO :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC_3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；
PML-RARA(L form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQID NO. 9所示；PML-RARA(S form) :5， -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQID NO. 10所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。所述的针对不同融合基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如下序列(其中上游 引物5’端含生物素标签)BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQID NO. 11 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 12 所示；BCR-ABL(b3a2)上游引物 5， -biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQID N0. 13 所示；下游引物 5’ -GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 14 所示；BCR-ABL (ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ IDN0. 15 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID N0. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID N0. 17 所 示；下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID N0. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，_biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID N0. 19 所 示；下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID N0. 20 所示；MLL-AF4(elO/e4)上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示；下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID N0. 22 所示；CBFB-MYH11 (A type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID N0. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID N0. 24 所示；AML1-ET0 上游引物 5，_biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ IDN0. 25 所 示；下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID N0. 26 所示；PML-RARA(L form)上游弓丨物 5， -biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，，如 SEQ IDN0. 27 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 28 所示；PML-RARA(S form)上游弓丨物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID N0. 30 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。所述的内参基因Abelson基因的引物和探针序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探针5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本发明另一个解决的问题是，提供一种检测白血病多种融合基因的诊断试剂盒， 包含共价结合了白血病融合基因mRNA特异性探针的微球混合物、结合了 Abelson基因探针 的微球、白血病融合基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、链霉亲和素-藻 红蛋白Str印tavidin-PE、质控品(阴性对照和阳性对照)。以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种融合基因质粒的混合液(包括含Abelson基因的质粒)，阴性对照品为不含有融合基因及 Abelson基因的质粒；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。本发明的一种检测白血病多种融合基因的诊断试剂盒，可用于检测体外样品，对 白血病进行分型，早期诊断，疗效观察，预后与微小残留疾病的动态监测。由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、 高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对白血病融合基因进行定性和定量检 测，能在临床检测上得到更好的应用。
具体实施例方式下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的 实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化 形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。实验材料引物和探针均由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；逆转录 cDNA合成试剂盒、PCR试剂购置于Fermentas公司；不同编号的微球(表面羧基修饰)、链 霉亲和素_藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐(EDC)购置于Pierce公司；2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂酰基氨酸钠 (Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购置于sigma公司。缓冲液和杂交液的配制偶联缓冲液，ρΗ4·5 250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 杂交溶液 250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ρΗ8. O 18.75ml
0. 5M EDTA, ρΗ8· 0 3. OmlH2O1. 37ml ；1.5 X TMAC 杂交溶液 250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, pH8. 0 12.5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 2. OmlH2O84. 25ml ；TE 缓冲液，pH8. 0500mlIM Tris-HCl, pH8. 0 5ml0. 5M EDTA, pH8. 0 ImlH2O444ml实例1 :4种白血病融合基因的液相芯片联合并行检测方法具体的检测方法包括如下步骤一 .检测 BCR-ABL (b2a2)、TEL-AMLl、CBFB-MYH11 (A type)、PML-RARA (L form)四 种融合基因的微球混合液的制备1.按照以下序列合成寡核苷酸探针BCR-ABL (b2a2) 5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，TEL-AML 15， -AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，PML-RARA (L form) 5，-AminoIinkerC 12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3，Abelson 基因 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3'2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、25、37、50、64号的5种羧基 微球偶联2. 1取出一小份_20°C保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；2. 2 用 dH20 分另Ij 溶解 BCR-ABL (b2a2)、TEL-AML 1、CBFB-MYH11 (A type)、 PML-RARA(Lform),Abelson 的寡核苷酸探针，浓度为 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分别全速涡旋编号为11、25、37、50、64号的5种羧基微球储存悬液至少3min， 产生均一的微球悬液；2. 4分别取2. 5 X IO6微球储存悬液到五个离心管中；2. 510，OOOg,离心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20 秒；2. 7将五种浓度为ImM寡核苷酸探针分别用dH20以1 10的比例稀释，使其浓度为 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每种探针各加入2 μ 1 (浓度为0. Inmol/μ 1)到混勻的相应的微球里，涡旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步 EDC的使用)；
2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到五种微球中(25 μ g终浓 度约为0. 5 μ g/ μ 1)涡旋混勻；2. 11室温避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意EDC粉末如果潮解，则 应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；2. 13五种微球中各加入2. 5 μ 110mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混勻；2. 14室温避光孵育30min ；2. 15五种偶联微球中各加入Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg，离心，l_2min ；2. 17移除上清，分别用Iml 0. 1 % SDS重悬五种偶联微球，振荡混勻；2. 1810，000g，离心，l-2min ；2. 19移除上清，分别加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，涡旋混合20s,重悬微球；2. 20用细胞计数器计数五种偶联了寡核苷酸探针的微球；a.用dH20将偶联微球以1 100稀释；b.涡旋震荡充分混勻；c.取10 μ 1到细胞计数器上；d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球总量)X 2. 5 X 100 (稀释倍数)。3.微球混合液的配制将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列分别为BCR_ABL(b2a2)探针微球11、 TEL-AMLl 探针微球 25、CBFB-MYH11(A type)探针微球 37、PML-RARA (L form)探针微球 50、 Abelson探针微球64，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/ μ 1，2_8°C避光保存。二.样本的制备1-4号白血病患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA 1.淋巴细胞提取取新鲜全血2ml加Iml 3%柠檬酸钠，混勻后3000r/min离心， 10min，4°C，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室温放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 离心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，剧振荡混勻后室温放置15min ；5. 4°C 12，OOOg 离心 15min ；6.吸取上层水相，至另一离心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1异丙醇混勻，室温放置5-lOmin ；8. 4"C 12，OOOg 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 离心 5min，尽量弃上清；11.室温晾干或真空干燥5-lOmin ；12.可用 50ul H2OjTE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0. 5% SDS均须用DEPC处理并高压)；
13.测OD值定量RNA浓度。三.多重RT-PCR按照如下方法对上述的1-4号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增l.cDNA第一链的合成①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1
Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1)1 μ 1EDPC-treated waterforword to12 μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；②离心管于70°C温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离 心收集管壁上的反应液到管底；③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；5Xreaction buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；④离心管于37°C温育5分钟；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，终体积为 20 μ 1 ；⑥离心管于42°C反应60分钟；⑦离心管于70°C加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2) 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，PML-RARA(L form)上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反应体系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix5 μ 1
dd H2O20 μ 1终体积为50 μ 1PCR 扩增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 个循环，每
循环一次，退火温度降低l°c，后21个循环，退火温度保持在50°C中进行；72°C 7min ；4°C保温。四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物；2.涡旋震荡20s，混勻微球；3.制备微球工作液，用1. 5 X TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/ μ 1。(注每个反应需要33 μ 1的微球工作液)；4.涡旋震荡20s，混勻微球工作液；5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μ 1微球工作液；6.向每个样品孔内分别加入1-4号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(ρΗ为 8. 0)，总体积为17 μ 1 ；7.用排枪上下吸打，温柔混勻反应液；8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100°C下孵育l_3min，使样品中的寡核苷酸去掉二 级结构；9.在杂交温度下孵育反应板15min ；10.制备新鲜的检测混合液，用IXTMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液 至10 μ g/ml (每个反应需要25 μ 1的检测混合液)；11.向每孔加入25 μ 1的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混勻；12.在杂交温度下孵育5min ；上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并95°C，l_3min;杂交温度，forever；13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持杂交温度，对各反应孔 进行检测分析，测定荧光MFI值(平均荧光强度)。五.检测结果及分析检测结果(荧光MFI值)如下 结果分析 1号患者类型为白血病融合基因TEL-AMLl阳性，2号患者类型为白血病融合基因 BCR-ABL (b2a2)阳性，3号患者类型为白血病融合基因CBFB-MYH11 (A type)阳性，4号患者 类型为白血病融合基因PML-RARA(L form)阳性；同时，将患者呈现阳性的融合基因的荧光 MFI值与内参Abelson基因的荧光MFI值相比，可得出融合基因的表达状况。实例2 10种白血病融合基因的液相芯片联合并行检测方法具体的检测方法包括如下步骤一 .检测 BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2)、BCR-ABL (ela2)、E2A-PBX1、TEL-AMLl、 MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、PML-RARA (Sform) 十种融合基因的微球混合液的制备1.按照以下序列合成寡核苷酸探针BCR-ABL(b2a2) 5 ‘ -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTTCCTTATT-3‘BCR-ABL(b3a2) 5， -AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，BCR-ABL(ela2) 5' -Amino1inkerCl2TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC-3‘E2A-PBX 15， -AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3‘TEL-AML 15’ -AminolinkerCl2TCCAAGTATGCATTCTGCTA-3‘MLL-AF4(elO/e4) 5‘ -AminolinkerCl2AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC-3‘CBFB-MYH11(A type) 5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，AML1-ET05’ -AminolinkerCl2TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3‘PML-RARA(L form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTGCCTCCCC-3‘PML-RARA(S form) 5' -Amino1inkerCl2GTCTCAATGGCTTTCCCCTG-3‘Abelson 基因5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT_3，2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、15、17、21、25、33、37、 45、50、56、64号的11种羧基微球偶联2. 1取出-小份_20°C保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；2. 2 用 dH20 分别溶解 BCR-ABL (b2a2)、BCR-ABL (b3a2) ,BCR-ABL (ela2)、E2A_PBX1、 TEL-AMLl、MLL-AF4(elO/e4)、CBFB-MYH11 (A type)、AMLl-ETO, PML-RARA (L form)、 PML-RARA(S form)、Abelson 的寡核苷酸探针，浓度为 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分别全速涡旋编号为11、15、17、21、25、33、37、45、50、56、64号的11种羧基微 球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；2. 4分别取2. 5 X IO6微球储存悬液到11个离心管中；2. 510，OOOg，离心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2. 7将11种浓度为ImM寡核苷酸探针分别用dH20以1 10的比例稀释，使其浓 度为 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每种探针各加入2 μ 1 (浓度为0. Inmol/μ 1)到混勻的相应的微球里，涡旋混 合；2. 9用dH20配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)；2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到11种微球中(25 μ g终 浓度约为0. 5 μ g/ μ 1)涡旋混勻；2.11室温避光孵育30min ；2. 12用dH20配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意EDC粉末如果潮解，则 应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；2. 1311种微球中各加入2. 5μ 1 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混勻；2. 14室温避光孵育30min ；2. 1511 种偶联微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 1610，OOOg,离心，l_2min ；2. 17移除上清，分别用Iml 0. 1 % SDS重悬11种偶联微球，振荡混勻；2. 1810，OOOg,离心，l_2min ；2. 19移除上清，分别加入100 μ 1 TE, ρΗ8· 0，涡旋混合20s,重悬微球；2. 20用细胞计数器计数11种偶联了寡核苷酸探针的微球；a.用dH20将偶联微球以1 100稀释；b.涡旋震荡充分混勻；c.取10 μ 1到细胞计数器上；d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球总量)X 2. 5 X 100 (稀释倍数)。3.微球混合液的配制将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列BCR-ABL(b2a2)探针微球11、 BCR-ABL (b3a2)探针微球 15、BCR_ABL (ela2)探针微球 17、E2A_PBX1 探针微球 21、TEL_AML1 探针微球 25、MLL-AF4(elO/e4)探针微球 33、CBFB-MYH11 (A type)探针微球 37、AML1-ET0 探针微球 45、PML-RARA (L form)探针微球 50、PML-RARA (S form)探针微球 56、Abelson 探 针微球64，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μ 1，2-8°C避光保存。二 .样本的制备1-10号白血病患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA 1.淋巴细胞提取取新鲜全血2ml加Iml 3%柠檬酸钠，混勻后3000r/min离心， 10min，4°C，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150 μ 1，然后加Iml TRIZ0L， 室温放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 离心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，剧振荡混勻后室温放置15min ；5. 4"C 12，OOOg 离心 15min ；
6.吸取上层水相，至另一离心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1异丙醇混勻，室温放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 离心 5min，尽量弃上清；11.室温晾干或真空干燥5-10min ；12.可用 50ul H2O, TE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0.5% SDS均须用DEPC处理并高压)；13.测OD值定量RNA浓度。三.多重RT-PCR按照如下方法对上述的1-10号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增1. cDNA第一链的合成①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1EDPC-treated water forword to 12 μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；②离心管于70°C温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；5Xreaction buffer4μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1) 1 μ 1IOmM dNTPs Mix2 μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；④离心管于37°C温育5分钟；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，终体积为 20 μ 1 ；⑥离心管于42°C反应60分钟；⑦离心管于70°C加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物BCR-ABL(b2a2)上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(b3a2)上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，BCR-ABL(ela2)上游引物 5，-biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，E2A-PBX1上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，下游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，TEL-AMLl上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，
下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，MLL-AF4(elO/e4) 上游引物 5，-biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，CBFB-MYHlKA type)上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，AMLl-ETO上游引物 5，-biotinCAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，PML-RARA(L form) 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，PML-RARA(S form) 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，2. 2PCR反应体系如下cDNA10 μ 110XPCR Buffer10 μ 1MgCl2 (25mmol/L)4μ 1dNTPs (IOmM)0. 5 μ 1Taq Polymerase (5u/μ 1) 0. 5 μ 1Primer mix 11 μ 1dd H2O14 μ 1终体积为50 μ 1PCR 扩增程序:95 V IOmin ；95 V 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 个循环，每
循环一次，退火温度降低l°c，后21个循环，退火温度保持在50°C中进行；72°C 7min ；4°C保
ilm ο四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物；2.涡旋震荡20s，混勻微球；3.制备微球工作液，用1. 5 X TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/ μ 1。(注每个反应需要33 μ 1的微球工作液)；4.涡旋震荡20s，混勻微球工作液；5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μ 1微球工作液；6.向每个样品孔内分别加入1-10号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(ρΗ为 8. 0)，总体积为17 μ 1 ；7.用排枪上下吸打，温柔混勻反应液；8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100°C下孵育l_3min，使样品中的寡核苷酸去掉二 级结构；9.在杂交温度下孵育反应板15min ；10.制备新鲜的检测混合液，用IXTMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10 μg/ml (每个反应需要25 μ 1的检测混合液)；11.向每孔加入25μ 1的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混勻；12.在杂交温度下孵育5min ；上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并95°C，l_3min;杂交温度，forever；13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持杂交温度，对各反应孔 进行检测分析，测定荧光MFI值。五.检测结果及分析检测结果(荧光MFI值)如下 结果分析 同时，将患者阳性融合基因的荧光MFI值与内参Abelson基因的荧光MFI值相比， 可得出融合基因的表达状况。在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各 种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。序列表<110>江苏迈迪基因生物科技有限公司<120>白血病融合基因的联合并行检测方法及诊断试剂盒<130>NP-09-12968<160>33<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>1tgaagggctt cttccttatt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>2tgaagggctt ttgaactctg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>3tgaagggctt ctgcgtctcc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>4tactcaaaac actgtaggag20<210>5<211>20<212>DNA<213> 人工序列<220><221>misc_feature
<223>(1). . . (20)<400>5tccaagtatg cattctgcta20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>6agtaggtctg cttaaagtcc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>7gctcatggac ctccatttcc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>8tcagtacgat ttcgaggttc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>9gtctcaatgg ctgcctcccc 20
<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>10gtctcaatgg ctttcccctg20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>11tgtgtgaaac tccagactgt cc22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>12ggagcttttc acctttagtt atgc24<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>13ggtttctgaa tgtcatcgtc c21<210>14<211>24
<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物
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<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>23aagaggctcg gagaaggaca c21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>24ctcttccagc tgcgtcttca tc22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>25caagtcgcca cctaccacag ag22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>26gtggcattgt tggaggagtc ag22<210>27<211>20<212>DNA
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<223> 引物<400>31gcgcaaaatg ttggagatc19<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>32ggagcttttc acctttagtt atgc24<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>(1). . . (20)<400>33ctgaagggct tcttccagat 20
权利要求
一种白血病融合基因的联合并行检测方法，包括以下步骤(1)包含10种不同荧光编码的羧基微球Beads，每种微球上分别共价结合针对白血病中染色体易位形成的10种融合基因的mRNA所设计的特异性核酸探针；(2)针对不同白血病类型中染色体易位所形成的10种融合基因的mRNA，分别设计上下游引物，对不同的融合基因mRNA，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；(3)含有特异性核酸探针的微球与融合基因mRNA的逆转录扩增产物混合杂交，加入链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE后，通过液相芯片法xMAP检测荧光信号；(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中是否存在白血病融合基因，以及样品中融合基因的表达状况。
2.如权利要求1所述的白血病融合基因的联合并行检测方法，其特征在于，所述的微 球是色彩编码微球Color-coded beads，其平均直径为5. 6 μ m，是结合了不同荧光染料的聚 苯烯微球。
3.如权利要求1所述的白血病融合基因的联合并行检测方法，其特征在于，所述的白 血病中染色体易位形成的融合基因是针对以下10种可以自由组合的融合基因BCR-ABL b2a2、BCR-ABL b3a2、BCR-ABL ela2、E2A-PBX1、TEL-AMLU MLL_AF4elO/e4、 CBFB-MYH11 A type、AML1-ET0、PML-RARA L form,PML-RARA S form。
4.如权利要求1所述的白血病融合基因的联合并行检测方法，其特征在于，所述的共 价结合于微球上的10条特异性核酸探针，包括如下序列，其中5’端含氨基修饰BCR-ABL b2a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTTCCTTATT_3，，如 SEQ IDN0. 1 所示； BCR-ABL b3a2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTTTGAACTCTG_3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； BCR-ABL ela2 :5，-AminolinkerC12TGAAGGGCTTCTGCGTCTCC_3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； E2A-PBX1 :5，-AminolinkerC12TACTCAAAACACTGTAGGAG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； TEL-AMLl :5，-AminolinkerC12TCCAAGTATGCATTCTGCTA_3，，如 SEQ ID NO. 5 所示； MLL-AF4elO/e4 :5，-AminolinkerC12AGTAGGTCTGCTTAAAGTCC_3，，如 SEQ IDN0. 6 所示； CBFB-MYH11A type :5，-AminolinkerC12GCTCATGGACCTCCATTTCC_3，，如 SEQID N0. 7 所示；AML1-ET0 :5，-AminolinkerC12TCAGTACGATTTCGAGGTTC-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示； PML-RARA L form :5’ -AminolinkerC12GTCTCAATGGCTGCCTCCCC_3，，如 SEQ IDN0. 9 所示；PML-RARA S form :5，-AminolinkerC12GTCTCAATGGCTTTCCCCTG_3，，如 SEQ IDN0. 10 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85%的序列； 或者与上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
5.如权利要求1所述的白血病融合基因的联合并行检测方法，其特征在于，所述的针 对不同融合基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素 标签BCR-ABL b2a2 上游引物 5，-biotin TGTGTGAAACTCCAGACTGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 11 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示；BCR-ABL b3a2 上游引物 5，-biotin GGTTTCTGAATGTCATCGTCC-3，，如 SEQ IDN0. 13 所 示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 14 所示； BCR-ABL ela2 上游引物 5，_biotin ACTGCCCGGTTGTCGTGT-3，，如 SEQ ID NO. 15 所示； 下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 16 所示；E2A-PBX1 上游引物 5，-biotin CACCAGCCTCATGCACAAC-3，，如 SEQ ID NO. 17 所示；下 游引物 5，-CACGCCTTCCGCTAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 18 所示；TEL-AMLl 上游引物 5，-biotin ACCTCTCTCATCGGGAAGACC-3，，如 SEQ ID NO. 19 所示； 下游引物 5，-TGGCATCGTGGACGTCTCTAG-3，，如 SEQ ID NO. 20 所示；MLL-AF4elO/e4 上游引物 5，_biotin CCACCTCCGGTCAATAAG-3，，如 SEQ IDN0. 21 所示； 下游引物 5，-CTAGGCGTATGTATTGCTGTC-3，，如 SEQ ID NO. 22 所示；CBFB-MYHllAtype 上游引物 5，-biotinAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-3，，如 SEQID NO. 23 所示；下游引物 5，-CTCTTCCAGCTGCGTCTTCATC-3，，如 SEQ ID NO. 24 所示；AMLl-ETO 上游引物 5，-biotin CAAGTCGCCACCTACCACAGAG-3，，如 SEQ ID NO. 25 所示； 下游引物 5，-GTGGCATTGTTGGAGGAGTCAG-3，，如 SEQ ID NO. 26 所示；PML-RARA L form 上游引物 5，-biotinCCCGTCATAGGAAGTGAGGT_3，，如 SEQ IDN0. 27 所 示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 28 所示；PML-RARA S form 上游引物 5，-biotin CAGGACCTCAGCTCTTGCAT-3，，如 SEQ IDN0. 29 所示；下游引物 5，-CCATAGTGGTAGCCTGAGGACT-3，，如 SEQ ID NO. 30 所示； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85%的序列； 或者与上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
6.如权利要求1所述的白血病融合基因的联合并行检测方法，其特征在于，所述的内 参基因为Abelson基因，其引物和探针序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 31 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 32 所示；探针 5，-AminolinkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 33 所示；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
7.—种检测白血病融合基因的诊断试剂盒，其特征在于，包含了权利要求1中所述的 共价结合了白血病融合基因特异性探针的微球混合物及结合了 Abelson基因探针的微球、 权利要求1中所述的白血病融合基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、链 霉亲和素-藻红蛋白、质控品。
8.如权利要求7中所述的检测白血病融合基因的诊断试剂盒，其特征在于，所述的微 球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
9.如权利要求7中所述的检测白血病融合基因的诊断试剂盒，其特征在于，所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种融合基因质粒的混合液，包括含 Abelson基因的质粒；阴性对照品为不含有融合基因及Abelson基因的质粒溶液。
10. 一种如权利要求7所述的检测白血病融合基因的诊断试剂盒在检测体外样品，对 白血病进行分型、早期诊断、疗效观察、预后与微小残留疾病的动态监测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种白血病融合基因的联合并行检测方法及诊断试剂盒，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测白血病相关的多种融合基因。通过对白血病融合基因mRNA设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与逆转录PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中是否含有白血病融合基因及融合基因的表达状况。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对多种白血病融合基因同时进行定性和定量检测。
文档编号C12Q1/68GK101838682SQ20091005697
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者孙黎, 徐春雷, 邵棠 申请人:江苏迈迪基因生物科技有限公司