专利名称：用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明用于白血病分型和研究的蛋白质芯片属于生命科学领域。蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列，以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可应用于生物学、医学及其相关领域。
AML是髓系白细胞异常增殖，随血液循环释放到外组织和浸润各种组织器官。起病急骤，约66％的病人在一个月内起病，病情急，发展快。贫血和发热时首发症状，中后期出现出血。其长期存活率差(20-30％)，最好在缓解后，继续接受骨髓移植，以提高治愈机会。ALL是由原始淋巴细胞大量增殖引起的，除发热和出血外，还有明显的肝、脾、淋巴结肿大等症状。其生存率高(60-70％)，若不幸复发，方可考虑接受骨髓移植。CML是一种起源于多能干细胞的肿瘤性增生疾病，临床特点是粒细胞显著增多，脾明显肿大，绝大多数CML有较特异的Ph标记染色体，病程较缓慢，急性变预后极差，如不积极治疗往往在数月内死亡。CLL是由于一种小淋巴细胞克隆性扩展，逐步积累而浸润骨髓、血液、淋巴结和其他器官，最终导致造血功能衰竭的一种恶性疾病。这种细胞形态上虽类似成熟淋巴细胞，但是一种免疫学不成熟的、功能不全的细胞。CLL绝大多数为B细胞性，T细胞性极少。因此，白血病初诊时类型的确定，对评估预后、制定治疗策略、提高缓解率有重要价值。
目前临床上白血病分型的方法主要是根据细胞形态学和细胞化学来进行的。一般是抽取病人血液和骨髓做细胞涂片检查，可辨别是否有异常的细胞增殖，再进行细胞化学染色和细胞计数来检测白血病细胞的类型和数量，从而确定白血病的类型，但该方法存在灵敏度低、效率差等缺点。近来由于免疫学的进步，发现有247种表达于细胞表面的CD(Cluster of Differentiation)抗原分子与白血病细胞相关。不同类型的白血病细胞会表达特异的CD分子，利用标有荧光标记的抗CD的抗体可以检出表达相应CD分子的细胞，但此法每次反应只能检测一个指标，速度慢，浪费大量人力和物力。随着生物芯片技术的发展，Golub等从38位AML或ALL病人的骨髓提取物的基因表达谱中检测到1100个与AML-ALL分型有关的基因，并利用其中差异性最显著的50个基因制成了精确度很高的DNA芯片。但这种方法实验步骤复杂，适用范围小，成本昂贵，不太适用于临床检测。此外，还有根据细胞遗传学或分子特征分型的方法，都存在着实验复杂、效率低的缺点。并且上述种种方法都是仅仅为分型而设计，没有考虑到对不同白血病亚型的分子特性进行全面的研究。
本发明目的可通过以下技术方案实现是将与白血病相关的表达于白细胞细胞膜上的特异性表面标志CD系列抗原分子的相应抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点印于固相载体上，蛋白质通过化学键连接固定在固相载体上，以用于对病人的外周血进行白血病的分型和研究。
其中，表面标志CD系列抗原，可包括迄今已经发现的所有CD分子，也可选择其中的一部分；阳性对照分别采用CD4和CD8；阴性对照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
在上述技术方案的基础上，本发明的目的可通过下述技术方案实现采用双抗体夹心法对病人的外周血进行白血病的分型和研究，即是取病人外周血，稀释后滴加于芯片表面，表达分泌不同CD抗原分子的细胞分别被固定在芯片上的相对应的抗体捕获，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的CD4抗体和CD8抗体的混合液，由于CD4和CD8是正常白细胞和病态白细胞普遍表达的表面标志，洗去未结合的抗体后，进行荧光扫描。
在上述技术方案的基础上，对荧光扫描的结果分析如下某点产生荧光信号，则表明该病人的白细胞可分泌表达该点所对应的CD分子，记为阳性，例如CD5+；如果不产生荧光信号，则记为阴性，例如CD10-；对所有结果进行综合分析，即可对该病人进行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表达特征。
本发明用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的制备方法如下第一步，根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定每个样品对应的检测CD分子的腔室，做好标记，并确定点阵的排列方式和点样位置；第二步，点样针从多孔板取出蛋白质样品(各种CD抗体以及对照品)后直接高密度点印于固态基底上；第三步，室温过夜或37℃温育1小时，以固定样品；第四步，利用制作蛋白芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装和保存。
本发明用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的检测方法如下第一步，在点样好的芯片上滴加患者白细胞样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；第二步，用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗净晾干；第四步，滴加以封阻液稀释过的荧光标记的CD4和CD8的抗体混合液，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；第五步，反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
本发明具有下述优越性第一，可在蛋白质分子水平对各种白血病进行精确分型，结果准确、可靠，并可尽早确诊。而用传统的免疫学实验方法对单种CD分子逐一检测，速度慢、效率低、实用性差；细胞形态法检测往往需要多种方法辅助检查才能明确诊断，而且一般只适用于急性白血病，对慢性白血病和一些白细胞不增多症缺乏灵活的确诊方法。且传统方法灵敏度低、限制因素多而且重复性差；而采用本技术可以通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果，确定所有与白血病相关的CD抗原表达情况，因而大大提高了检测的速度和效率。第二，可对不同型白血病的白细胞特征和分子特征进行研究，并有机会发现更多的型和亚型。而此前的方法着眼于检测，很难进行全面的研究。第三，操作系统化，工艺简单，分析方便，成本较低，实用性强。
4——加入荧光标记的CD4抗体和CD8抗体5——荧光标记物结合于白细胞表面，从而可通过发荧光的位点判读该样品的CD分子表型。
杂交反应第一步，在点样好的芯片上滴加患者白细胞稀释液样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；第二步，用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗净晾干；第四步，滴加以封阻液稀释过的荧光标记的CD4和CD8的抗体混合液，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干。
结果的检测、分析反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。对荧光扫描的结果分析如下某点产生荧光信号，则表明该病人的白细胞可分泌该点所对应的CD分子，记为阳性，例如CD5+；如果不产生荧光信号，则记为阴性，例如CD10-；对所有结果进行综合分析，即可对该病人进行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表达特征。
本实施例中，A病人的CD特异性表型为CD11c+，CD22+，CD19+，CD25+，CD103+/CD5-，CD10-；B病人的特异表型为CD5+，CD19+，CD20+，CD23+/CD10-，CD22-，表明前者患有毛细胞白血病，后者患有慢性淋巴细胞白血病。其它CD分子在这两种白血病的分型中无关，此处不一一列举。
权利要求
1，用于白血病分型和研究的蛋白质芯片，其特征在于，将与白血病相关的表达于白细胞细胞膜上的特异性表面标志CD(Cluster ofDifferentiation)系列抗原分子的相应抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点印于固相载体上，蛋白质通过化学键连接固定在固相载体上。
2，根据权利要求1所述的用于白血病分型和研究的蛋白质芯片，其特征在于，所述表面标志CD系列抗原，可包括已知的CD分子或其中的一部分；所述阳性对照分别采用CD4和CD8；所述阴性对照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
3，用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的使用方法，其特征在于，采用双抗体夹心法，即是取病人外周血，稀释后滴加于芯片表面，表达分泌不同CD抗原分子的细胞分别被固定在芯片上的相对应的抗体捕获，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的CD4抗体和CD8抗体的混合液，由于CD4和CD8是正常白细胞和病态白细胞普遍表达的表面标志，洗去未结合的抗体后，进行荧光扫描、分析。
4，根据权利要求3所述的用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的使用方法，其特征在于，对荧光扫描的结果分析如下某点产生荧光信号，则表明该病人的白细胞可分泌表达该点所对应的CD分子，记为阳性；如果不产生荧光信号，则记为阴性。
5，用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的用途，其特征在于，用于对病人进行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表达特征。
6，用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于，第一步，根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定每个样品对应的检测CD分子的腔室，做好标记，并确定点阵的排列方式和点样位置；第二步，点样针从多孔板取出包括各种CD抗体以及对照品的蛋白质样品后直接高密度点印于固态基底上；第三步，室温过夜或37℃温育1小时，以固定样品；第四步，利用制作蛋白芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装和保存。
7，用于白血病分型和研究的蛋白质芯片的检测方法，其特征在于，进行杂交反应第一步，在点样好的芯片上滴加患者白细胞稀释液样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；第二步，用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗净晾干；第四步，滴加以封阻液稀释过的荧光标记的CD4和CD8的抗体混合液，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；第五步，反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
全文摘要
本发明用于白血病分型和研究的蛋白质芯片涉及一种蛋白质芯片,可实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断。本发明是将与白血病相关的表达于白细胞细胞膜上的特异性表面标志CD系列抗原分子的相应抗体以及阳性对照、阴性对照同时高密度点印于固相载体上,蛋白质通过化学键连接固定在固相载体上。本发明可在蛋白质分子水平对各种白血病进行精确分型,通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果,确定所有与白血病相关的CD抗原表达情况,结果准确、可靠,检测的速度和效率高,并可尽早确诊;可对不同型白血病的白细胞特征和分子特征进行深入研究;操作系统化,工艺简单,分析方便,成本较低,实用性强。
文档编号G01N33/68GK1372143SQ02111129
公开日2002年10月2日 申请日期2002年3月21日 优先权日2002年3月21日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 徐锋, 任一萍 申请人:上海晶泰生物技术有限公司