专利名称：一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法
技术领域：
本发明属于血液分子生物学领域，具体涉及一种L型PML/RARa融合基因检测试剂盒及相应的检测方法。
背景技术：
白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。染色体异常是白血病发生的常见原因之一。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病的细胞分化停滞在较早阶段，多为原始细胞及早幼细胞，病情发展迅速。其中急性早幼粒细胞白血病(AcutePromyelocytic Leukemia, APL)是一种常伴发严重出血的急性白血病,95%以上的APL发生特异性的染色体易位t (15 ；17) (q22 ；ql2 21)，导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病((Promyelocytic leukemia, PML)基因与17号染色体上的维甲酸受体a (Retinoicacid receptor α , RARa)基因融合产生PML / RARa融合基因。依据PML基因内部断点不同，可分为L、S和V型三种，其中L型PML /RARa融合基因为主要类型，约占70 80%。分子生物学研究表明，PML / RARa融合基因是APL高度特异性的分子标志物，是APL患者发病的重要机制之一，已作为APL MICM分型诊断的依据之一。近年来，随着维甲酸、三氧化二砷在临床上的应用，APL完全缓解(complete reminion, CR)率明显提高，长期无病生存的病例大大增加。但白血病的复发问题却一直困扰着医务人员，关键原因在于临床上CR患者体内仍有微小残留病灶(minimal residual disease MRD)存在。初发患者体内白血病细胞总数为IO12 1013，经化疗诱导达到血液学CR后，体内仍残留IO6 IO8白血病细胞。因此，准确监测APL微小残留病，预测复发，指导临床治疗是提高APL患者长期生存率的主要途径之一。目前PML/ RARa融合基因检测的方法主要有染色体分析、实时定量RT-PCR、荧光原位杂交技术等，但这些方法均存在特异性不高、操作繁琐、检测费用高等问题，限制了其广泛应用魏娜，陈敬华，王昆等.发夹结构DNA探针用于检测白血病PML / RARa融合基因的电化学传感器的研究[J].分析测试学报，2008，27 (9):907— 910。所以急需建立一种简便、快速、高特异性的检测新方法。
发明内容
本发明提供了一种L型PML/RARa融合基因检测试剂盒及相应的检测方法，目的是实现某一种细胞该融合基因的检测。本发明是采用如下技 术方案实现的:一种L型PML/RARa融合基因检测试剂盒，由以下成分组成:功能化氧化石墨烯、序列为5’ FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂1、甲醛、皂角素、PBS缓冲液，试剂盒中各成分浓度及用量见表1，所列试剂的量为10个样本反应:
表I
权利要求
1.一种L型PML/RARd融合基因检测试剂盒，其特征是由以下成分组成:功能化氧化石墨烯、序列为5’ FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂1、甲醛、皂角素、PBS缓冲液，试剂盒中各成分浓度及用量见表1，所列试剂的量为10个样本反应:
2.—种L型PML/RARa融合基因的检测方法，该方法使用权利要求1的试剂盒，其特征是包括以下步骤: (1)细胞培养 将待测细胞接种于含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液中，在37°C，5% CO2条件下培养，2 3天半量换液； (2)与细胞共孵育的孵育液制备 将功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA和试剂I混合即得到孵育液； (3)细胞预处理 A、将待测细胞收集到流式离心管中，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液；B、然后在上述流式离心管中加入100W甲醛，立刻混匀，室温下静置10 15min后， 向流式离心管中加入4ml PBS缓冲液吹打混勻后，于室温下1000 rpm离心5 min,弃去上清 液；C、最后在处理完的流式离心管中加入100W皂角素，混匀，室温下静置5min后，向流 式离心管中加入4 ml PBS缓冲液轻轻混勻后，于室温下1000 rpm离心5 min,弃去上清液 备用;(4)孵育液与细胞共孵育将步骤(2)得到的孵育液加入步骤(3)处理后的流式离心管中，充分混匀，37°C下、避 光、静置lh后，于室温下1000 rpm离心5 min，弃去上清液，然后向流式离心管中再加入4 ml PBS缓冲液混勻后，于室温下1000 rpm离心5 min,弃去上清液,再向流式离心管中加 lml PBS缓冲液，混匀后进行结果分析。
3.根据权利要求2所述的一种L型PML/RARa融合基因的检测方法，该方法使用权利 要求1的试剂盒，其特征是所述步骤(4)中的分析方法采用激光共聚焦显微镜法和流式细 胞仪法。
全文摘要
本发明涉及血液分子生物学领域，具体为一种L型PML/RARα融合基因检测试剂盒及相应的检测方法，由以下试剂组成功能化氧化石墨烯、序列为5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC标记的单链DNA、试剂Ⅰ、甲醛、皂角素以及PBS缓冲液，其中试剂Ⅰ由Tris碱、NaCl、KCl、MgCl2、HCl、H2O组成，使用方法包括细胞培养、与细胞共孵育的孵育液制备、细胞预处理和孵育液与细胞共孵育。使用本试剂盒提供的试剂，可以快速、准确检测出某一种细胞是否存在L型PML/RARα融合基因，该试剂盒更敏感、特异，操作简单、快速，这对于APL的诊断及其微小残留的监测具有重要的意义，可以做到早期预测复发、指导临床治疗。
文档编号C12Q1/68GK103074420SQ201210449468
公开日2013年5月1日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者李然, 王宏伟, 覃艳红, 陈秀花, 任方刚, 张耀方, 徐智芳, 李莉, 郭海秀, 王晓娟 申请人:山西医科大学