sIL-4R-NAP融合基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因领域，提供了一种融合基因，用于抗哮喘，该基因包含编码可溶性白介素4受体sIL-4R的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白HP-NAP的片段b。该基因可连入载体，起到很好的抗哮喘效果。
【专利说明】SIL-4R-NAP融合基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因领域，尤其涉及一种融合基因。
【背景技术】
[0002]支气管哮喘，简称哮喘，是严重困扰人类健康的慢性疾病，全球哮喘患者已多达3亿多人，我国近10年来儿童哮喘发病率上升了 60%，目前尚无根治办法。临床上常用吸入糖皮质激素(GC)和β 2受体激动剂等缓解哮喘的临床症状，但价格昂贵而且长期使用易引起诸多不良反应，如生长迟缓、发声困难、骨密度降低等。哮喘是一种免疫失调性疾病，有较多治疗药物在开发，如可溶性白介素4受体(SIL-4R)，可阻断IL-4信号、起到一定的抗哮喘作用。但哮喘受到一个复杂信号网络的调控，例如仅仅阻断IL-4信号但IL-13也能补偿IL-4的部分生理学功能，维持哮喘的病理学特征。
【发明内容】
[0003]本发明解决的技术问题是，提供了一种融合基因，给药的抗哮喘效果非常显著。
[0004]一种融合基因，其包含编码可溶性白介素4受体(SIL-4R)的片段a和编码幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白(本文简称HP-NAP蛋白)的片段b。
[0005]优选的，所述 片段a含有SEQ ID No:1所示片段。
[0006]优选的，所述片段b含有SEQ ID No:2所示片段。
[0007]优选的，所述基因还含有连接片段a和b的连接片段C，片段c不干扰片段a或b的功能，且片段c编码柔性肽(本领域又称连接肽、柔性连接肽，用以防止连在其两端的蛋白在空间构象上的相互干扰；以片段c为例，其可防止片段a表达的SIL-4R和片段b表达的HP-NAP在空间构象上的相互干扰，如防止sL-4R和HP-NAP形成空间高级结构而影响功能的发挥)。
[0008]优选的，所述片段c含有SEQ ID No:3所示片段。
[0009]优选的，所述基因的序列从5 ;端到3 ;端由SEQ ID No:USEQ ID No:3、SEQ IDNo:2顺序连接而成(下文将该基因称为SIL-4R-NAP基因，其编码的蛋白为sIL_4R_NAP蛋白)。
[0010]重组载体，包含任一上述形式的融合基因。融合基因可转入任何可用的载体中，如pcDNA3.1 (+) (invitrogen公司)。重组载体可制成核酸疫苗(如DNA疫苗)或药物组合物，通过在宿主内表达融合SIL-4R与HP-NAP的蛋白以调节代谢、治疗/预防疾病。
[0011]目前有较多抗哮喘药物在开发，本发明另辟蹊径，通过反复探索，惊奇地发现，包含编码可溶性白介素4受体(SIL-4R)的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)的片段b的重组载体，通过OVA诱导的小鼠哮喘模型验证，至少在以下任一方面均有显著的效果:
[0012]减少气道周围炎症细胞的浸润、减少支气管肺泡灌洗液BALF中细胞总数、降低所述BALF中嗜酸性粒细胞数目、降低肺组织嗜酸性粒细胞趋化因子-2eotaxin-2的mRNA水平、上调肺组织中IFN-Y水平、降低肺组织中IL-4水平、降低肺组织中IL-5的mRNA水平、降低血浆中介导过敏反应的IgE水平。
[0013]另外，相比蛋白药物，DNA疫苗的构建变得相对容易，DNA疫苗避免了蛋白质纯化的复杂工艺，并且DNA疫苗在个体内的持续表达也优于传统的蛋白质给药方式。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为三酶切鉴定质粒pcDNA3.l_sIL_4R-NAP的电泳图，泳道M:DNA markerDL10, 000 (Takara 公司)；泳道 I 或 2:质粒 pcDNA3.l_sIL_4R-NAP 用 Hind II1、BamH 1、XhoI三酶切产物；泳道3:sIL-4R基因PCR产物；泳道4:Linker-HP-NAP基因PCR产物；
[0015]图2为BALF细胞计数比较，纵坐标表示细胞总数，单位为105/ml，横坐标对应于各实验组；
[0016]图3为BALF中的嗜酸性粒细胞计数比较，纵坐标表示嗜酸性粒细胞数目，单位为IOVmi，横坐标对应于各实验组；
[0017]图4为肺组织切片H&E染色比较；
[0018]图5为IL-4比较图，纵坐标表示IL-4含量，单位为pg/ml，横坐标对应于各实验组；
[0019]图6为IFN- Y比较，纵坐标表示IFN- Y含量，单位为pg/ml，横坐标对应于各实验组； [0020]图7为IgE水平比较，纵坐标表示IgE水平，单位为ng/ml，横坐标对应于各实验组；
[0021 ] 图8为IL-5的mRNA表达水平比较，纵坐标表示IL-5的mRNA相对NS组的表达水平，横坐标对应于各实验组；
[0022]图9为eotaxin-2的mRNA水平比较,纵坐标表示eotaxin-2的相对NS组的mRNA水平，横坐标对应于各实验组；
[0023]图10 为 RT-PCR 检测 sIL_4R_NAP 的 mRNA 表达；
[0024]图11为western blot检测融合蛋白的表达。
[0025]注:上述各涉及数据的图中，*表示各组与OVA组相比，P < 0.05即有显著性差异，**表示P < 0.01, ***表示P < 0.001, **、***均为极显著性差异。
【具体实施方式】
[0026]融合基因SIL-4R-NAP可通过本领域常规方法制得，下面以其为例，分别说明用本发明的疫苗的构建、该疫苗的治疗效果、该融合基因SIL-4R-NAP的蛋白表达。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
[0027]部分材料或仪器:
[0028]真核表达载体pcDNA3.1(+) (invitrogen公司)，SPF级BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，
[0029]限制性内切酶Hind II1、BamH 1、Xho I，T4 连接酶，Taq DNA 聚合酶，RNAisoPlus,质粒小提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR仪(均购自Takara公司)，
[0030]明矾、V级 OVA (Sigma 公司)，SYBR Green qRT-PCR mix (Takara)，实时荧光定量仪(罗氏)，瑞氏染液(南京建成生物工程研究所)，兔抗HP-NAP多抗(山东舟山同生生物公司制备)，超声雾化器(402AI)；
[0031]BALF支气管肺泡灌洗液:从颈下剪开老鼠皮毛，剖开组织分离出气管，用一次性注射器(5ml)吸取0.8ml预冷的PBS，剪掉针尖，插入气管，用细线双线结扎针头，缓缓推吸3次得到BALF。
[0032]部分缩写:
[0033]PBS:磷酸盐缓冲液
[0034]0VA:鸡卵清蛋白
[0035]—、构建DNA疫苗(亦称融合表达载体):
[0036]1.1构建DNA疫苗用材料或仪器:真核表达载体pcDNA3.1 (+)(invitrogen公司)，限制性内切酶Hind II1、BamH I ,Xho I，T4连接酶，Taq DNA聚合酶，RNAiso Plus，质粒小提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR仪(均购自Takara公司)，
[0037]反转录试剂盒(Fermentas公司)
[0038]1.2PCR引物的设计
[0039]1.2.1融合表达载体HP-NAP区段的引物设计为SEQ ID No:4、5所示，本文简称该对引物为“HP-NAP引物”。
[0040]1.2.2融合表达载体SIL-4R区段的引物设计为SEQ ID No:6、7所示，本文简称该对引物为“SIL-4R引物”，设计思路为:
[0041]根据GenBank 中 C57BL/6 小鼠 IL-4R (ΝΜ_001008700.3)序列，结合 UniProt 蛋白质数据库预测的IL-4R (P16382)胞外段编码序列设计扩增sIL_4R的引物，正向引物5丨端加入酶切位点Hind III，反向引物V端加入酶切位点BamH I，根据pcDNA3.1 (+)载体说明的高表达要求，5丨端起始密码子ATG序列之前加入ACC序列。
[0042]
【权利要求】
1.融合基因，其特征在于:其包含编码可溶性白介素4受体SIL-4R的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白HP-NAP的片段b。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于:所述片段a含有SEQID No:1所示片段。
3.如权利要求1或2所述的基因，其特征在于:所述片段b含有SEQID No:2所示片段。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因还含有连接片段a和b的连接片段C，片段c不干扰片段a或b的功能，且片段c编码柔性肽、用以防止片段a表达的SIL-4R和片段b表达的HP-NAP在空间构象上的相互干扰。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于:所述片段c含有SEQID No:3所示片段。
6.如权利要求1所述的基因，其特征在于:所述基因的序列从5丨端到3丨端由SEQID No:USEQ ID No:3、SEQ ID No:2 顺序连接而成。
7.重组载体，包含权利要求1-6任一项所述的基因。
8.核酸疫苗，包含权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求7所述的重组载体在制备预防或治疗哮喘的药物中的应用。
10.权利要求1-6任 一项所述的基因编码的蛋白。
【文档编号】C07K19/00GK103923935SQ201410161397
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】康巧珍, 傅国, 汲振余, 刘鑫, 王婷, 曲晓丽, 王小龙, 杜明萱 申请人:郑州大学