表征组合物中的rna的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：i.提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，ii.使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：a.带有3’-尾部的第一核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，b.带有5’-尾部的第二核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，c.其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，iii.将所述第一核酸分子的杂交的5’-尾部共价链接到所述第二核酸的杂交的3’-尾部，其中所述链接通过逆转录和随后的连接反应完成，将RNA-DNA杂合体与双链体特异性抗体结合，iv.用对所述第一核酸分子的所述第一3’-尾部和所述第二核酸分子的所述第二5’-尾部具有特异性的引物扩增链接的分子，和v.借助于新一代测序对扩增产物进行测序。所述试剂盒包含引物、抗体和连接酶或逆转录酶。
【专利说明】表征组合物中的RNA的方法和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、诊断且更特别是表达谱的领域。
【背景技术】
[0002] 近几年来，在转录组分析领域中的研究已经从使用RNA印迹（Northern blotting)的以候选基因为基础的RNA检测发展成为由微阵列的出现驱使的高通量表达 谱。自2006年，通过为细胞转录组的多维检验提供机会，新一代的测序技术已经使转录组 学发生了巨大变化，在所述多维检验中，在单碱基分辨率下获得高通量表达数据。表1汇总 基因表达谱里程碑。
[0003]
【权利要求】
1.确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：
1. 提供包含一种或多种核糖核酸分子（RNA)的组合物， ii. 使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括： a. 带有3'-尾部的第一核酸分子（DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交， b. 带有5'-尾部的第二核酸分子（DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交， c. 其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与 所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此 隔开2?1000个核苷酸， iii. 将杂交的第一核酸分子共价链接到杂交的第二核酸，其中所述链接通过逆转录和 随后的连接反应完成， iv. 用对所述第一核酸分子的所述第一 3' -尾部和所述第二核酸分子的所述第二 5' -尾部具有特异性的引物扩增链接的分子， v. 对扩增产物进行测序，其中，在扩增步骤（iv)之前， vi. 分离步骤（iii)的链接的分子与靶RNA的杂合体，所述分离通过特异性针对DNA/ RNA杂合体的抗体来捕集所述杂合体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在扩增步骤（iv)之前，所述RNA被酶消化。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的尾 部为10?50个核苷酸。
4. 根据权利要求1?3任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和/或所述第二核 酸分子包括经确定并不结合靶RNA的额外条形码序列，且其中所述序列的长度为3?20。
5. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸 分子对选自人类核酸序列、病毒序列、细菌序列、动物序列和植物序列的核酸序列具有特异 性。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述序列为mRNA序列、外显子-外显子连接区和 /或5'和3' UTR区。
7. 根据权利要求1?6任一项所述的方法，其中应用的新一代测序方法选自：合成测 序、焦磷酸测序、Sanger测序、寡核苷酸连接测序、半导体技术或单分子实时（SMRT?)测序。
8. 根据权利要求1?7任一项所述的方法，其中带有3'-尾部的所述第一核酸分子和 带有5'-尾部的所述第二核酸分子的浓度为lfM?ΙΟΟΟηΜ，其中所述3'-尾部不与所述组 合物中的RNA杂交且所述5' -尾部不与所述组合物中的RNA杂交。
9. 试剂盒，其包含： i. 带有3' -尾部的第一核酸分子（DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交， ii. 带有5'-尾部的第二核酸分子（DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交，其 中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA 杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2? 1000个核苷酸， iii. 对RNA/DNA双链杂交分子具有特异性的抗体，和 iv. 逆转录酶和/或DNA连接酶。
【文档编号】C12Q1/68GK104093854SQ201280059287
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年12月2日
【发明者】埃丽卡·韦德勒, 霍尔格·韦德勒 申请人:凯杰有限公司