附着软骨细胞的多孔质体的长期保存方法
【专利摘要】本发明揭示了一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法。该方法具备以下部分：将分离了的软骨细胞以1.0×107个细胞/ml～1.0×108个细胞/ml的给与细胞浓度悬浊于去端肽胶原液中制备细胞悬浊液，将上述细胞悬浊液接种在具备生物体适宜性的多孔质体上，使上述细胞悬浊液在上述多孔质体中凝胶化得到附着软骨细胞的多孔质体，将上述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每1mL为1.0×105个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5％以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于0cm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26～37℃。
【专利说明】附着软骨细胞的多孔质体的长期保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种长期保存附着软骨细胞的多孔质体的保存方法。
【背景技术】
[0002]专利文献I中，揭示了将培养软骨细胞而得的培养软骨组织使用磷酸缓冲液、林格氏(Riger，日文:U ^ )类保存液、或者生理盐水等等渗压盐类溶液在2~25°C下保存10天的方法。
[0003]专利文献2中，揭示了一种将细胞浸溃于细胞保存液中的细胞保存方法，该方法对相邻的2个细胞集合体的旋转速度进行测定，基于该旋转速度使细胞保存液的能量源浓度或量不同，维持细胞活性的同时使细胞增殖能力钝化。 [0004]专利文献I 中记载的方法以在运输期间所需的保存(10天左右)为目的，并非为了药典中规定的无菌试验所要求的14天期间的保存。
[0005]专利文献2中，相邻2个细胞集合体的旋转速度以处于维持细胞活性的同时使细胞增殖能力钝化的范围中的条件下使细胞保存液的能量源或量不同，因此在不能交换培养基的状況下不能采用。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本专利特开2005-95152号公报
[0009]专利文献2:日本专利第4230750号公报
【发明内容】
[0010]发明所要解决的技术问题
[0011]本发明的技术问题是，提供一种不需要交换培养基而长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法。
[0012]解决技术问题所采用的技术方案
[0013]为了解决上述问题，本发明是一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法，其特征在于，具备以下部分:
[0014]将分离了的软骨细胞以1.0X IO7个细胞/ml~1.0 X IO8个细胞/ml的给与细胞浓度悬浊于去端肽胶原中制备细胞悬浊液，
[0015]将上述细胞悬浊液接种在多孔质体上，
[0016]使上述细胞悬浊液在上述多孔质体中凝胶化得到附着软骨细胞的多孔质体，
[0017]将上述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每ImL为1.0X IO5个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于Ocm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26~37。。。
[0018]发明的效果[0019]根据本发明，能够不需要交换培养基而长期保存附着软骨细胞的多孔质体。藉此，可通过无菌实验确认附着软骨细胞的多孔质体的无菌状态。此外根据本发明，在长期保存中能够防止多孔质体上附着的软骨细胞的过量增殖。进一步，由于在长期保存后的死细胞数量少，因此能够提供即使在长期保存后也处于适宜移植的状态的附着软骨细胞的多孔质体。因此，可提供一种在与目前相比在长期中，如日本药典规定的无菌实验期间，即14天内不交换培养基的附着软骨细胞的多孔质体保存方法。此外，即使在根据法律没有保存14天的义务的国家或地区里，预计从制造附着软骨细胞的多孔质体到提供给患者移植机构为止会有一定的时间差，在该期间里也可将软骨细胞至少安全地保存14天。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是表示附着了耳廓软骨细胞的多孔质体的制造工序的流程图。
[0021]图2是表示向多孔质体给与含有去端肽胶原的细胞悬浊液的状态的示意图。
[0022]图3是表示在密闭容器内保存细胞附着多孔体的状态的示意图。
[0023]图4是表示长期保存细胞附着多孔体的状态的示意图。[0024]图5是表示由保存温度产生的保存中的细胞生存率差异的图。
[0025]图6是表示在特定的保存温度下细胞生存率没有差异的图。
【具体实施方式】
[0026](I)附着软骨细胞的多孔质体的制造以及保存的概要
[0027]本说明书中，也将“附着软骨细胞的多孔质体”称为“细胞附着多孔质体”。使用图1对细胞附着多孔质体的制造工序的概况进行说明。
[0028]首先，从对象上采集软骨。对得到的软骨通过例如胶原酶处理等进行酶处理，分离软骨细胞。接着将其以1.0X IO7个细胞/mL~1.0X IO5个细胞/mL的浓度悬浊于2~3%的去端肽胶原溶液中。将得到的细胞悬浊液接种在多孔质体上。接着，例如，通过在37°C的恒温箱内静置2小时，利用将去端肽胶原进行凝胶化的方式在多孔质体上固定细胞。藉此得到细胞附着多孔质体。细胞附着多孔质体在对象上进行移植来使用。因此，在移植之前，需要对制作的细胞附着多孔质体进行试验确认无菌。
[0029]无菌试验中，对于I个批次，制作来源于相同软骨的多个细胞附着多孔质体，对该批次所包括的一部分细胞附着多孔质体进行无菌试验。将没有用于无菌试验的细胞附着多孔质体，与接受无菌试验的细胞附着多孔质体一起密封保存在密闭容器中。至少在无菌试验的期间内维持密封保存。密封保存通过以下方式进行:将细胞附着多孔质体在给与活细胞数量每ImL为1.0X IO5个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的保存用培养基中，以以下方式进行振荡的同时，维持26~37°C ;该振荡方式为:振荡振幅为直线的情况下至少在一个方向上为IOmm~50mm、圆方向的情况下其直径也为IOmm~50mm、振荡速度在15rpm~90rpm的范围内。通过无菌试验确认该批次无菌之后，将密封保存的细胞附着多孔质体用于移植。
[0030](2)细胞附着多孔质体
[0031]细胞附着多孔质体包括多孔质体和固定于多孔质体的表面以及孔的内面的软骨细胞。[0032](3)分离细胞
[0033]如下制备分离细胞。首先，采集软骨细胞，例如耳廓软骨细胞。接着从所采集的软骨细胞去除脂肪、血管以及血液等。将其切碎。进一步，通过酶，例如胶原酶溶液进行消化，得到分离细胞。
[0034]在使用分离细胞制备细胞附着多孔质体前，可将分离细胞接种于有明胶涂层的培养皿或有明胶涂层的烧瓶中，通过以例如胰蛋白酶等酶进行消化回收，实施原代培养以及传代培养。
[0035]用于原代培养以及传代培养的增殖培养基，其基础培养基如DMEM/F12或者MEM中含有抗生素，例如，青霉素以及链霉素。
[0036]如下进行将分离细胞固定于多孔质体，制备细胞附着多孔质体的工序。将分离了的细胞悬浊于去端肽胶原液中得到细胞悬浊液。去端肽胶原液含有去端肽胶原，基础培养基如MEM、DMEM/F12，和抗生素如青霉素以及链霉素。
[0037]在例如半圆柱状的多孔质体中添加细胞悬浊液。可通过如图2所示的，从所需大小的多孔质体21的上方，利用移液管23给与细胞悬浊液22的方式向多孔质体添加细胞悬浊液。给与多孔质体的细胞悬浊液可以1.0X IO7个细胞/mL~1.0X IO8个细胞/mL的浓度含有细胞。
[0038]多孔质体可以是具备生物体适宜性的多孔质材料，例如聚乳酸。多孔质体的体积可根据所要移植的部位決定。多孔质体的气孔率为85~90%，平均孔径约400 μ m。
[0039]对给与了细胞的多孔质体，通过在37°C的具有足够湿度的环境下，例如在放入盖上盖子的培养皿中的状态下静置于37°C的恒温箱内维持约2小时的方式，将去端肽胶原凝胶化。
[0040]通过去端肽胶原的凝胶化将细胞悬浊液凝胶化，藉此将细胞固定于多孔质体的表面以及孔的内面，得到细胞附着多孔质体。
[0041]此外，去端肽胶原液的凝胶化也可如下进行:例如，将IOmL的在基础培养基如MEM、DMEM、DMEM/F12或DMEM/F12中加入了抗生素如青霉素以及链霉素的培养基放入直径9cm的培养皿内，在该培养皿内设置载放多孔质体的台，在该台上，以不浸没并从培养基中露出的状态载放给与了细胞的多孔质体，在培养皿的盖上盖子的状态下，例如在37°C的恒温箱内培养2小时。
[0042](4)密封保存
[0043]密封保存示于图3。首先，准备灭菌了的密闭容器30。该密闭容器30具备在开口缘部的外面进行螺纹加工的单密封筒体31，和在开口缘部的内面进行螺纹加工、螺合于单密封筒体31的螺纹部的盖子32。接着，在单密封筒体31的内部收容保存用培养基33。然后，在单密封筒体31的内部收纳细胞附着多孔质体34。在单密封筒体31的开口部螺合盖子32，密闭单密封筒体31内部。
[0044](5)保存用培养基的振荡
[0045]参照图4对保存用培养基33的振荡进行说明。首先，准备在内部配置了能够以例如椭圆形移动的滑动台41的恒温振荡器40。在容器30的轴方向与滑动台41的表面大致平行的条件下将密闭容器30载放在滑动台41上。并且，在密闭容器30中以将细胞附着多孔质体34整体浸入保存用培养基33的方式进行收纳。[0046]将容器30载放在滑动台41上之后，将恒温振荡器40的内部设定为26~37°C的环境，并使滑动台41进行运动。通过滑动台41的运动使保存用培养基33在容器30内振荡。
[0047]滑动台41的动作，除椭圆运动以外，也可进行例如圆周运动、往返运动及/或八字型运动等椭圆以外的运动。通过滑动台41的运动，密闭容器30内所含的保存用培养基以以下方式进行振荡:振荡振幅为直线的情况下至少在一个方向上为IOmm~50mm、圆方向的情况下其直径也为IOmm~50mm、振荡速度在15rpm~90rpm的范围内。这样的振荡环境可通过例如使用超小型恒温振荡培养机(泰太克株式会社(夕4 ^ 々株式会社)制，
V?BR-36)通过15rpm~90rpm的设定而产生的椭圆运动实现。此外，利用本身公知的振荡机，例如通过使滑动台41以例如0°~15°的倾斜角度进行反复倾斜，也可实现相同的振荡效果。对保存用培养基进行振荡振幅为20mm(圆周运动)的振荡时，用东芝制Aplio (注册商标)XG1202S对保存用培养基33的流速进行测定的情况如下。
[0048]15rpm...不能测定流速。其中，可以确认密闭容器30内的保存用培养基33的水面伴随着滑动台41的运动有很少的上下波动。因此，认为形成了测定机无法测定的O以上微小流动。
[0049]30rpm...不能测定流速。其中，可以确认密闭容器30内的保存用培养基33的水面与15rpm时一样，伴随着滑动台41的运动有上下波动。并且水面的上下波动与15rpm的情况下比较，观察到其振幅明显更大。因此，认为形成了测定机无法测定的O以上流动。
[0050]60rpm...流速为0.5~1.0cm/秒,可确认密闭容器30内的保存用培养基33的水面伴随着滑动台41的运动明显地上下波动。
[0051]90rpm...流速为1.6~2.8cm/秒，可确认密闭容器30内的保存用培养基33的水面伴随着滑动台41的运动大幅上下波动。
[0052]保存用培养基的振荡速度可大于Ocm/秒且在2.8cm/秒以下，优选U=L 6cm/秒以上且在2.8cm/秒以下。将保存用培养基的流速作为u时，该速度以Ocm/秒< u≤2.8cm/秒，U=L 6cm/秒~2.8cm/秒的式子表示。
[0053]并且，在下述的实施例中只要没有特别指定，以振荡机的振荡幅度为20mm进行验证。
[0054]保存用培养基，在基础培养基如DMEM/F12中含有胰岛素、纤维芽细胞生长因子以及5%以上的血清，进一步，含有抗生物质如青霉素以及链霉素。
[0055]如果根据本发明的方法，则可在不进行培养基交换的情况下，长期地、至少在14天内保存细胞附着多孔质体。藉此，能够进行用于确认细胞附着多孔质体的无菌状态的无菌试验。此外，该方法可防止在长期保存中的细胞附着多孔质体的过量增殖，减少长期保存后的死细胞数量。从而，可提供即使在长期保存后也处于适合移植的状态的细胞附着多孔质体。
[0056][例]
[0057]1.附着软骨细胞的多孔质体的制作步骤
[0058]后述的例I~例8所使用的附着软骨细胞的多孔质体基本上如下制作而成。
[0059](I)软骨组织的分离与细胞接种(PO)
[0060] 通过无菌操作搬入所采集的软骨组织，去除脂肪或血液等。接着，将得到的软骨切碎。将切碎的软骨放入1.2%的胶原酶溶液，使用超小型恒温振荡培养机(泰太克株式会社制，V*BR-36)以37°C 120rpm(长轴为20mm的圆周运动，以下，如无特别描述，振荡的运动相同)振荡18小时，分离细胞。分离细胞以所需的细胞数量悬浊于增殖培养基(含有5 μ g/mL的胰岛素+0.1 μ g/mL的FGF+5%血清+青霉素-链霉素的DMEM/F12)中。将细胞悬浊液以2 X IO5个细胞/培养皿的浓度接种在有明胶涂层的培养皿中。将其培养在37°C的CO2恒温箱中。
[0061]如下制备1.2%的胶原酶溶液。称量胶原酶0.3g，加入50mL的试管中。对其添加25mL的DMEM/F12并完全溶解。
[0062]如下制备培养培养基。在培养基瓶中用50mL的移液管加入450mL的DMEM/F12。接着，用5mL的移液管加入5mL的100单位/mL青霉素-0.lmg/mL的青霉素_链霉素。进一步，用1000 μ L的枪头加入500 μ L的100 μ g/ml的FGF。进一步，用1000 μ L的枪头加入710 μ L的作为胰岛素的诺和灵R(Novolin R，日文:八节1」> R )。用25mL的移液管向其中加入25mL的血清并充分混合。
[0063]〈PO细胞培养基交换>
[0064]对上述(I)的细胞的培养基进行如下交换。从上述(I)的含有细胞的培养中的有明胶涂层的培养皿中 ，利用吸气器去除培养基。接着，各加入IOmL增殖培养基。将其进一步培养在37 °C的CO2恒温箱中。培养基交换3~4天进行I次。
[0065](2)传代(PO — Pl)
[0066]如下进行传代。从原代培养中的含有细胞的有明胶涂层的培养皿上通过胰蛋白酶处理剥离细胞，集中在I支试管中。将回收的细胞悬浊于增殖培养基(含有5μ g/mL的胰岛素+0.1 μ g/mL的FGF+5%血清+青霉素-链霉素的DMEM/F12)中。将得到的细胞悬浊液以1.5 X IO5个细胞/烧瓶的浓度接种于18个有明胶涂层的烧瓶中。将其培养在37°C的CO2恒温箱中。
[0067]<培养基交换>
[0068]如下进行传代培养中的培养基交换。从有明胶涂层的烧瓶中使用吸气器去除培养基。接着，在该有明胶涂层的烧瓶中加入20mL增殖培养基。将其培养在37°C的CO2恒温箱中。
[0069](3)细胞回收和向多孔质体的给与
[0070]从18个有明胶涂层的烧瓶中剥离细胞，将细胞集中回收到I支试管中。将回收的细胞悬浊液进行离心分离之后，置于含有青霉素-链霉素的MEM中，将其一部分用于测定细胞数量。根据所测定的细胞，用25mL的试管移取相当于2.25X IO8个细胞的量的细胞悬浊液，离心分离后，去除其上清。将得到的细胞颗粒，在最终液量为3.0mL的条件下悬浊于含有青霉素-链霉素的MEM。将其与1.5mL的3%去端肽胶原混合。此处，细胞悬浊液:去端肽胶原=2:1，混合后的去端肽胶原的最终浓度为I %。以ImL的注射器采集700 μ L，给与聚乳酸制的近似半圆柱状的多孔质体(6(宽，W)X50(长，L)X3(高，H))。多孔质中添加的含有去端肽胶原的细胞悬浊液的量根据多孔质体的大小而定。例如在多孔质的大小为6 (W) X 5 (L) X 3 (H)的情况下，给与液量设为TOyUlO(W) X 5 (L) X 3 (H)的情况下设为120 ~150 μ L。
[0071](4)细胞的固定[0072]接着，将给与了细胞的多孔质体配置于放入了含有青霉素-链霉素保存用培养基的培养皿中，通过在37°C的恒温箱内静置2小时，将去端肽胶原凝胶化，得到细胞附着多孔质体。
[0073]2.细胞数量计量方法
[0074]例子中细胞数量的计量，使用卡摩公司(chemometec社)制的NucleoCounter (注册商标)，作为细胞处理试剂使用Reagent AlOO以及Reagent BlOO (卡摩公司制)，同时使用NucleoCassette (注册商标)作为专用样本盒。
[0075]总细胞浓度测定如下进行。
[0076].样本的制备
[0077]在试管中采集50 μ L要测定的细胞的悬浊液，分别加入50 μ L细胞处理试剂Reagent AlOO 以及 Reagent B100,制备样本。
[0078].总细胞浓度的测定[0079]总细胞浓度的测定中，将上述的“样本的制备” 一项中所制备的样本抽取到NucleoCassette (注册商标)中，装配在NucleoCounter (注册商标)上。接着按下NucleoCounter (注册商标)的“运行(Run) ”按钮，开始总细胞数量的测定，得到测算结果。
[0080].死细胞浓度的测定
[0081]如下进行死细胞浓度的测定。在试管中取IOOyL的培养细胞，抽取到NucleoCassette (注册商标)中，装配在NucleoCounter (注册商标)上。接着按下NucleoCounter (注册商标)的“运行(Run) ”按钮，开始死细胞数量的测定，得到测算结果。
[0082]细胞生存率使用以下公式算出:
[0083]活细胞浓度=总细胞浓度一死细胞浓度
[0084]细胞生存率=活细胞浓度/总细胞浓度。
[0085]〈例1>
[0086]保存用培养基的组成
[0087]确定了细胞附着多孔质体的保存用培养基的组成。对含有作为生长因子的胰岛素、FGF (Fibroblast Growth Factors:成纤维细胞生长因子)、地塞米松(诱导软骨细胞的再分化)以及生长调节素(诱导软骨细胞的再分化)和血清的任意组合的培养基，对细胞附着多孔质体的长期保存后的细胞产生的影响进行讨论。
[0088]培养基中所含的各成分通过以下记号表示，与使用浓度一起，对应的缩写示于以下的表1。
[0089][表 I]
【权利要求】
1.一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法，其特征在于，具备以下部分: 将分离了的软骨细胞以1.0X 107个细胞/ml~1.0X 108个细胞/ml的给与细胞浓度悬池于2~3%去端肽胶原中制备细胞悬池液， 将所述细胞悬浊液接种在具备生物体适宜性的多孔质体上， 使所述细胞悬浊液在所述多孔质体中凝胶化而得到附着软骨细胞的多孔质体， 将所述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每1mL为1.0X 105个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于0cm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26~37°C。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述振荡速度在1.6cm/秒~2.8/秒的范围内。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述振荡速度通过以下振荡方式实现:在振荡振幅为直线的情况下至少在一个方向上为10mm~50mm,圆方向的情况下其直径为10mm~50mm,振荡速度在15rpm~90rpm的范围内。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞为耳廓软骨细胞。
5.如权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于，在培养基中所含的所述血清浓度在5体积％以上。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法，其特征在于，在培养基中所含的所述血清浓度在10体积％以上。
7.如权利要求1~6中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基为DMEM/F12。
8.如权利要求1~7中任一项所述的方法，其特征在于，所述保损温度为30°C~34°C。
【文档编号】C12M3/00GK103958670SQ201280058882
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年12月1日
【发明者】原井基博, 馆山俊晶 申请人:富士软件株式会社