专利名称：透明质酸用于软骨细胞抗氧化与增生的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及透明质酸(hyaluronic acid、义名玻璃质酸)用于改善软骨细 胞的氧化损害，进而促进软骨细胞增生的用途。本发明还涉及透明质酸用于制 造供治疗或预防关节炎的医药品，及提供改善关节炎病症的口服性食品或饮料 的用途。
背景技术：
关节是提供生物体骨架活动的枢纽。关节内相邻的两骨骼面覆盖一层有弹 性、表面光滑的软骨，其在骨骼实际接触并活动摩擦时，具有吸收震动及减少 摩擦力的作用，以促使关节的活动顺畅。为增加软骨接触面的滑动顺畅，关节 内含有粘稠的关节液具有像润滑油一般的功效。在软骨和关节液中，有种重 要成分透明质酸。关节液含0.15% (w/v)水状溶液的透明质酸，主要由关节滑 膜细胞(synoviocyte)制造，是 -种大分子的长链聚醣类，其功能为l.以水 溶液形态存在于关节液中，提供粘稠度(Pathophysiology. 2003， 9:215-220); 2.与一些葡糖胺聚糖分子(Glucosaminoglycan、 GAG等)结合形成蛋白聚糖 (Proteoglycan)，作为关节软骨细胞外基质的主要成分之一；3.在软骨中提 供软骨细胞附着及生存的骨千；4.会受氧化物质的毒性而破坏其结构(参见， 例如Arthritis & Rheumatism.2003， 48:3151-3158)，而其中的最后一项，H前 正日益受到重视。因为关节运动的机械性损耗或老化等其它因素，会降低代谢性氧化剂和增 加氧化物或自由基等，而造成软骨细胞的伤害。由于软骨基质中含有透明质酸， 其必须由健全的软骨细胞维持恒定的结构(质)与量，才可供维持正常的软骨结 构。但是这些细胞在人体生命周期的中期或更早，就逐渐衰老甚或凋亡，于是退形性病变就形成了。软骨细胞功能衰退的原因十分复杂，u前学界所知不多， 但 -项公认的重要因素，就是代谢过程(包括前述机械性磨耗和生体自然的生 物性运作等等)中产生的氧化性物质，特别是像自由基等强氧化剂对它所造成 的伤害。
在化学反应中，活性氧(reactive oxygen species, ROS)或称为氧自由基(free radicals)会以不稳定的情况存在，必须得到-一个电子来达到平衡，因此会以 氧化的方式，与其它原子或化合物竞争电子。据估计人体内所有的自由基屮约 有95 7。以上属于ROS，活性氧或其衍生物因相互竞争电子，会影响其它分子或化合物的状态。细胞的构造中多处皆可产生自由基如线粒体、溶酶体、细胞膜磷脂质、内质网等。自由基过多会对细胞组织造成伤害。当体内的氧化物过多时会导致体内的平衡失调，而造成脂质、蛋白质或是DNA损伤，进而造 诸如癌症、帕金森氏症、高血压、动脉硬化症、心肌梗塞、血栓形成、血小板 凝集等疾病产生。目前已知自由基会和细胞膜上脂质的不饱和键结合，产生脂 质过氧化反应，而使细胞膜受损。自由基也会损害含硫蛋白及其它蛋白，造成 离子转运系统(ion transport systems)受损，导致细胞受到伤害或造成蛋白质 分解、结构改变或变性等。另外自由基会对脱氧核糖核酸的碱基造成伤害，使 DNA断裂、突变、细胞周期改变、甚至具有致癌性。目前已知在关节炎中，活性氧(如02—'、 OH'、 H202、 HOC1等)会进行 去聚合化(depolarization)而破坏透明质酸结构，并降低透明质酸的数量、降低 关节的粘稠度与润滑度以及产生发炎现象(参见，例如Free Radic Biol Med. 2003,35:169-78;及Pathophysiology. 2003， 9:215-220) 。 &02和CuCl2的存在 会破坏高分子量(例如120万道尔顿)透明质酸的结构(参见Carbohydr Res. 1999, 321:228-34; Carbohydr Res. 2006， 341:639-44;及Pathophysiology. 2003, 9:215-220)。现有文献还提及关节液中的透明质酸易受H202或山H202衍生 的OH'破坏(Inflammation. 1993， 17:403-15)。因此，&02似乎为造成透明质 酸结构变化的主因。本发明利用不同分子量与制造来源的透明质酸，在体外或活体试验评估透明质酸作为-j亢氧化(H202)，以及进而促进软骨细胞增生的用途。并评估外加透明质酸可以在人关节退化的过程中，提供某种程度的还原及 保护细胞的功用，或具有软骨细胞增生的效应。发明内容本发明目的及优点将部分描述于下，或可由描述中显而易见。本发明的目的在于提供透明质酸(hyaluronic acid)用于改善软骨细胞因 活性氧所引起的氧化损害的用途。 本发明的另 一 目的在于提供透明质酸用于促进软骨细胞增生的用途。本发明的上述目的是这样实现的 一种透明质酸的促进软骨细胞增生的用 途，是通过对软骨细胞生长周期的调控而实现。本发明所述的用途，该生长周期的调控是增加生长周期调控因子Cydhi Bl在G2/M期的表现。本发明的又一 目的在于提供用于治疗或预防关节炎的医药品。本发明的上述目的是这样实现的 一种用于治疗或预防关节炎的医药品，其特征在于包含分子量介于50-800万道尔顿(Dalton)的透明质酸。本发明所述的医药品，该透明质酸用于改善关节软骨细胞的氧化损害。 本发明所述的医药品，该透明质酸用于降低关节液内的自由基活性。 本发明的再一 目的在于提供用于改善关节炎病症的口服性食品。本发明的上述目的是这样实现的 -种供改善关节炎病症的口服性食品，其特征在于，包含分子量介于50-800万道尔顿的透明质酸。下面，结合具体实施例及其所示附图，对本发明作进-歩详细说明。
图1表示各种不同分子量的透明质酸(Hyaluronan)降低关节液中H202的产生。图2表示在给予病人透明质酸后，其关节液内的02—'、 H202、及发炎l天l子 C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)与结合珠蛋白(haptoglobin)的量，相比于对照组的下降情形。图3A表示在给予透明质酸的环境下，自由基的表现受到抑制。 图3B表示在有或无透明质酸(20 pl)存在下，软骨细胞随着11202浓度增加的存活率。图4表示在有或未给予透明质酸的状况下，老年人类软骨细胞随时间的生长情形。图5表示利用流式细胞仪(flow cytometery)分析有或未经透明质酸(1 mg/ml)处理的老人软骨细胞的细胞周期。图6表示以蛋白质印迹分析调控G0/G1期的蛋白质细胞周期蛋白Dl、 cdk4与cdk6;以及调控G2/M的蛋白质细胞周期蛋白B1，在有或未经透明
质酸(lmg/ml)处理的软骨细胞中的表现变化情形。
具体实施方式
以下实施例为使用日本专利1284023与1353027的方式分离的透明质酸 制品。其中包含600万道尔顿透明质酸(Synvisc,Biomatrix,USA)， 60-120万 道尔顿透明质酸(ARTZDispo, Seikagaku， Japan), 60-120万道尔顿透明质酸 (Hikamilon Dispo， Taisho Pharmaceutical Co., Ltd., Japan), 60-120万道尔顿透明 质酸(Lumisteron Dispo, Nissin, Japan), 60-120万道尔顿透明质酸(Unihylon Dispo, UJI, Japan), 50-73万道尔顿透明质酸(Hyalgan， Fidia， Italy), 50-73万道 尔顿透明质酸(Suplasyn， Bioniche， Ireland)。实施例1.透明质酸降低关节液内的11202与发炎物质为了解在临床上使用透明质酸注入于病人关节内，其对关节液内自由基表 现的影响如何，首先取出受过透明质酸治疗的病人的关节液，检测其内所含的自由基量。将所收集的人类关节液置于冰上。取200 ^tl的关节液置于铁盘内，并放 入化学冷光检测仪(CLA-FS1， Tohoku Electronic Ind. Co., Sendai，日本)的 检测槽内。启动检测仪，测一段50秒内的背景值后，再加入500^1鲁米诺(Luminol (5-amino-2,3隱dihydro-l,4-phthalazinedione) ， !)沟买于美国Sigma公 司，粉末溶于磷酸缓冲生理盐水(PBS)配制成0.1 mM并于4"C保存)或光泽精(Lucigenin (Bis-N-Methylacridinium)，购买于美国Sigma公口:]，粉末溶于磷酸 缓冲生理盐水(PBS)配制成0.1 mM并于4。C保存)进而检测自由基的含量直到 300秒停止(每10秒可得一个累积计数值)。存储文件并分析。计算时间-计数 50秒所得的积分平均值，再乘上30则可得300秒的背景积分值。将所有的吋 间-计数所构成的面积积分值扣除300秒的背景积分值，再除上25则可得到检 体每10秒的平均自由基计数。结果表示于图l。由图1显小，50-800万道尔 顿的透明质酸具有降低关节液中H202的产生的作用。其中降低H202的表现能 力为60-120万道尔顿的透明质酸〉50-73万道尔顿的透明质酸〉600万道尔顿 的透明质酸。
图1表示各种不同分子量的透明质酸(Hyaluronan)降低关节液中&02的产 生。其中降低&02的表现能力为60-120万道尔顿>50-73万道尔顿>600万道尔顿。以未接受过透明质酸治疗的病人的关节液为对照组，由实验结果显示，对 照组的关节液内，含有大量的02"、 &02的自由基，然而在给予病人透明质酸 后，其关节液内的11202量比对照组明显的下降(参见图2)。实施例2.在体外试验中(in vitro)，透明质酸降低自由基产量并能减少软骨 细胞的死亡率为了解在体外实验中，透明质酸是否能减低自由基活性，取200pl不同浓 度的&02 (0、 100、 200及400^iM)，利用化学冷光测定仪测量其自由基的 表现情形。并且另外于200 iliM的环境下给予20 iul的透明质酸(hyaluronic acid) 并测定自由基的表现量。结果如图3A所示，自由基的表现量会随着H202的 浓度增加而增加，但在H2O2 200 ^iM有加20iLil透明质酸处理的环境下，发现自由基的表现受到抑制，且几乎和没有加入H202时的表现-样。由于从文献得知，自由基的含量增加，会造成细胞的死亡。于是，为探讨透明质酸 (hyaluronic acid)是否能减少因自由基造成的细胞死亡率，收集老年病人(大于 60岁)的软骨组织，进而分离出初级的软骨细胞进行培养。将装有检体的离心管秤重记录，扣掉离心管的净重量，记录软骨检体的重 梟。加10ml磷酸缓冲生理盐水(PBS)于离心管中，水平旋转摇晃五下，再 将PBS吸千。重复清洗软骨检体一次。利用平口镊子夹起软骨检体，转移辛. 10 cm细胞培养皿上。以10mlPBS将软骨检体再清洗 次。利用手术刀将软 骨检体做初步分离，将粘附于检体的软组织与硬骨组织分离；将分离出的纯白 色的软骨组织移到步骤八的无菌培养皿中。利用手术刀将软骨组织细分切成小 碎片(体积不超过lmm3)。添加60pl第—:型纤维素分解酶(100mg/ml)。 将置有细分后软骨组织的细胞培养皿移放置37°C、 5% C02细胞培养箱中的 摇晃器，以50rpm摇晃四小时。吸取5ml细胞培养液回冲分解后的软骨组织， 全部移至预备的无菌15 ml离心管中。再吸取5 ml细胞培养液回冲其分解软 骨的培养皿，以确保利用第二型纤维素分解酶分离出來的细胞全部皆收集到预 备的无菌15ml离心管中。于室温下，离心1000rpm5分钟。吸掉上清液，添 加10mlPBS打散细胞，再次离心1000rpm5分钟。重复清洗软骨细胞兩次。
添加10 ml细胞培养液均匀打散细胞，然后取其50pl细胞培养液移到1.5 ml 离心小管，加40 pi PBS与10^1的10x锥虫蓝染料(Trypan Blue),均匀混合后 取10^混合液缓慢放进血球计数器并在显微镜下计数。计数的细胞密度九 格的计数数目x2xl04/9:细胞数目/ml。软骨细胞以l x 104/ml细胞密度转 植入锥形瓶，并置放于37。C、 5%032细胞培养箱。每三天利用抛弃式吸管吸 掉锥形瓶中的细胞培养液，加10mlPBS于锥形瓶裡面上缘(切勿直接冲击细 胞)，水平缓和摇晃锥形瓶后，吸掉磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffer saline)， 再添加12ml细胞培养液于锥形瓶中，并将锥形瓶继续放于37"C、 5%032细 胞培养箱培养。进行存活实验时，于培养基内加入不同浓度的11202 (0、 100、 200及400 ^M)，另外两组是0及200pM的H2O2皆加入20(il透明质酸，如此培养细 胞一天后，收集软骨细胞并计算其存活率。从表示于图3B的结果显示，软骨 细胞的存活率随着^02的浓度增加而下降，但是在含有透明质酸的环境下， 细胞的存活率反而增加。因此，证明透明质酸确实具有降低自由基表现量，并 减少软骨细胞的死亡率，进而促进软骨细胞增生的功效。图3B表示在有或无透明质酸(20 pl)存在下，软骨细胞随着H202浓度 增加的存活率。结果显示，软骨细胞的存活率随着&02的浓度增加而下降， 但是在有透明质酸的环境下细胞的存活率反而增加。实施例3.透明质酸促进对老年人软骨细胞生^本实验进一步测试在有或无透明质酸存在下，对老人关节的软骨细胞生长 的影响，测量软骨细胞的生长曲线。按照前述实施例2的步骤，培养老人软骨 细胞，并于细胞长至约八成满时将其分盘，每盘约8xl04个/60mmdish并培 养至隔夜。隔天，取出细胞培养盘，将细胞培养液置换成含有lmg/ml透明质 酸(hyaluronic add)的细胞培养液来培养细胞(HA组)，而对照组则更换 般的 培养液，培养时间持续至12天为止，并于第5天更换-次培养液。从第0天 (DayO)起开始计算细胞总数，而后每两天计算一次。此实验重复二次。结果表 示于图4。由所测得的生长曲线可知，老年人类软骨细胞在有给予透明质酸 (hyaluronic acid)的状况下，从第2到第4天可发现，HA组的细胞数明显的大 于对照组1.7倍，而在第6天HA组比对照组达到大于两倍的差异。第8辛:12 天HA组生长速度趋缓，但和对照组比起来，仍有1.4至1.6倍的差异。
实施例4.透明质酸对老年人软骨细胞生长促进是经由生长周期的调控 为了解透明质酸是否会调控老年人类软骨细胞的细胞周期，按照前述实施例2的步骤，于八成满时将其分盘，每盘约3x105/100 mm dish并于隔天将细 胞培养液置换成含有1 mg/ml透明质酸的细胞培养液来培养细胞(HA组)，而 对照组则更换一般的培养液，培养时间持续至8天为止。从第0天(DayO)起开 始收集细胞，而后每两天收集一次。所收集的细胞，经处理过后，利用流式细 胞仪(flow cytometery)分析其细胞周期。先制备单细胞悬浮液。经培养的细胞以PBS润洗，再以胰蛋白质酶处理， 待细胞变圆后，便以5 ml含胎牛血清(5。/。FCS)的培养液收取细胞，并均匀地 打散细胞悬浮液。加入5ml冰冷PBS来清洗细胞，低速离心5分钟，之后小 心地去除上清液，可留约50pl溶液，避免碰及细胞。加入0.2mlPBS并均匀 地打散细胞。 一边振荡混合细胞悬浮液，同时一滴--滴地加入1 ml 70%酒精 以固定细胞，静置在-2(TC冰箱中至少- 小时(酒精固定后样品可静置过夜)。 以低速(1200转/分钟)离心5分钟，吸除上清液避免触及细胞。将细胞团块 均匀地打散，加入5mlPBS清洗细胞。静置一分钟后低速1200rpm离心5分 钟，之后尽量吸除上清液。加入1 ml碘化丙啶PI/聚氧乙烯辛基苯基醚Triton X-100染色液，将细胞团块均匀地打散，并轻摇混合，在室温下暗室中作用 30分钟(最终浓度为聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton X-100) 0.1%，核醣核酸酶 A(RNase A 0.2 mg/ml &碘化丙啶PI 20吗/ml，避免重复使用回温过的酶)。在 临上机前混匀样品，并以35卞m尼龙筛网过滤样品。于样本制备的两小时内， 利用流式细胞仪(flow cytometer) (FL2-A)检测细胞荧光的表现，且可按照所得 的数据分析细胞周期的变化。结果表示于图5。于G0/G1期的测定结果(参见图5A)，在第4天时对 照组的细胞数百分比HA组高，其余则无差异。而于S期的测定结果(参见图 5B)，在实验组与对照组两组间，从第0至8天并没有统计上的差异。另外， 在G2/M期的测定结果(参见图5C)，发现第4天时HA组的细胞数百分比 较对照组高，但第6天以后则没有差异。实施例5.透明质酸可以增加生长周期调控因子细胞周期蛋白Bl (G2/M) 的表现为进一步了解透明质酸如何改变细胞周期的进行，是否和细胞周期调控因 子有关，按照前述实施例2的步骤培养老人软骨细胞，且于有或未给予1 mg/ml 透明质酸的环境下，进行培养2、 4、 6及8天，并收集细胞的蛋白质后，以蛋 白质印迹法(Western blotting)分析其中各种不同细胞周期调控因于的表现情形。
用1倍PBS清洗三次细胞，并加入RIPA缓冲液(50mM Tris (pH7.5)， 150mMNaCl， 1%NP40， 0.1%十二烷基硫酸钠SDS， 0.5y。脱氧胆酸钠(sodium deoxycholic acid),蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor))将细胞打破并溶出蛋白 质。配合使用刮勺，将细胞从培养盘上刮下，收集至微量离心管。离心(12000 转速，30min， 4°C)，取出上清液预备进行电泳分离。蛋白定量过后的检体 取出20 pg，并依照样本样本缓冲液(含甘油)=1:4的比例混合，丄L在IO(TC 的水温下加热五分钟，加样至电泳槽。进行电泳的后，取出胶体并剪下大小适 合的尼龙纸，浸入转移缓冲液(100ml浓縮溶液(Tris30.28g及甘氨酸(glycine) 144.9g配置成一公升，pH8.2 8.4) + 700ml二次蒸馏水+ 200ml屮醇)中，将 纸覆盖在胶体上， 一起放入转移箱(transferchamber),接上电极调整电流而开。 始进行转移。转移(Tmnsfer)的条件为300 mA、 2.5 3 hr。转移结束后，将尼 龙纸取出并置于5M脱脂牛奶溶于Tris缓冲液内，于室温下摇一小时。用Tris 缓冲液将尼龙纸清洗干净(清洗三次，每次五分钟)，加入一级抗体于室温下摇 --个小时或于4。C摇过夜。用Tris缓冲液清洗尼龙纸，清洗五次，每次五分钟。 加入二级抗体并于室温下摇40分钟。如前述用Tris缓冲液清洗尼龙纸，的后 加入化学发光测试组(ECLkit)(溶剂l:溶剂2=1:1)，溶液需完全覆盖于尼龙纸， 在室温下反应一分钟。至暗房显影。
结果如图6所示，调控G0/G1期的蛋白质如细胞周期蛋白D1、 cdk4及 cdk6，在对照组及透明质酸处理组(HA组)中皆没有差异。但在处理过透明 质酸(hyaluronic acid)的软骨细胞中，于第4天时，调控G2/M期的蛋白质 细胞周期蛋白Bl表现量略高于对照组。另外和细胞周期蛋白Bl相关的蛋白 质cdc2则没有改变。
综上所述，本发明已利用不同浓度的过氧化氢(H202)加到软骨细胞的 培养环境中，来模拟细胞遭受氧化物质侵害的状况。然后在这些系统中添加不 同分子量或来源的透明质酸，观察是否可以减低细胞发生的损伤。此项研究的 正面发现，可进一步说明在关节腔中注射透明质酸的有效机转，同时提供防治
关节炎的另 一种有效模式。此外本发明的抗-H202透明质酸还适用于因铁过度 累积的血色素沉着病、青铜色糖尿病与色素性肝硬变。基于以上的实验结果， 本发明还提出含透明质酸用于制造供改善关节炎病症的口服性食品或饮料的 用途。
权利要求
1. 一种将透明质酸用于改善软骨细胞的氧化损害的用途，其中该氧化损害是由活性氧所引起。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中该透明质酸的分子量介于50-800万 道尔顿。
3. 根据权利要求2所述的用途，其中该透明质酸的分子量介于60-120万 道尔顿。
4. 根据权利要求1所述的用途，其中该活性氧选自02—'、OH'、H202及HOCl。
5. 根据权利要求1所述的用途，其中该改善软骨细胞的氧化损害是通过减 低活性氧的自由基活性而实现。
6. 根据权利要求1所述的用途，其中透明质酸能够进一步减少软骨细胞的 死亡率。
7. -种将透明质酸用于促进软骨细胞增生的用途。
8. 根据权利要求7所述的用途，其中透明质酸促进软骨细胞增生是通过对 软骨细胞生长周期的调控而实现。
9. 根据权利要求8所述的用途，其中该生长周期的调控是增加生长周期调 控因子Cyclin B1在G2/M期的表现。
10. —种用于治疗或预防关节炎的医药品，其特征在于，包含分子量介于 50-800万道尔顿的透明质酸。
11. 根据权利要求IO所述的医药品，其中该透明质酸的分子量介于60-120 万道尔顿。
12. 根据权利要求IO所述的医药品，其中该透明质酸用于改善关节软骨细 胞的氧化损害。
13. 根据权利要求IO所述的医药品，其中该透明质酸用于降低关节液内的 自由基活性。
14. 一种供改善关节炎病症的口服性食品，其特征在于，包含分子量介于 50-800万道尔顿的透明质酸。
15. 根据权利要求10所述的食品，其中该透明质酸的分子量介于60-120 万道尔顿。
全文摘要
本发明涉及透明质酸(hyaluronic acid、又名玻璃质酸)用于改善软骨细胞的氧化损害，进而促进软骨细胞增生的用途。更特别地，本发明涉及分子量介于60-120万道尔顿(Dalton)的透明质酸用以保护活性氧伤害软骨细胞，及促进软骨细胞增生的用途。本发明还涉及透明质酸用于制造供治疗或预防关节炎的医药品，及提供改善关节炎病症的口服性食品或饮料的用途。
文档编号A61K31/726GK101209259SQ20061017230
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者徐焕清, 江清泉, 郑剑廷 申请人:江清泉;郑剑廷;徐焕清